CN108624545A

CN108624545A - 一种噬菌体фx174裂解蛋白e及其应用

Info

Publication number: CN108624545A
Application number: CN201810392228.8A
Authority: CN
Inventors: 诸葛斌; 黄孟楠; 陆信曜; 宗红
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-04-27
Filing date: 2018-04-27
Publication date: 2018-10-09

Abstract

本发明公开了一种噬菌体ФX174裂解蛋白E及其应用，属于遗传工程领域。本发明是以重组大肠杆菌E.coli(PAI/GroELS)作为出发菌株，通过引入噬菌体ФX174裂解蛋白E，在重组大肠杆菌细胞表面产生孔洞，再利用细胞内外渗透压差，从而将亚油酸异构酶从细胞中释放出来的方法。最后经过对释放条件优化，使细胞内81％的亚油酸异构酶被释放出重组大肠杆菌细胞。

Description

一种噬菌体ФX174裂解蛋白E及其应用

技术领域

本发明涉及一种噬菌体ФX174裂解蛋白E及其应用，属于遗传工程领域。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是一种具有共轭双键的亚油酸(linoleic acid，LA)同分异构体，这些共轭双键始于碳9、11或10、12位，是一种普遍存在于人体或动物体的营养元素。CLA是一种新发现的营养元素，目前在欧美的健康食品界，几乎成为预防现代疾病的灵丹妙药，已经被这些国家开发成为食品添加剂、保健品和营养饲料。动物体和人体的研究表明，CLA具有多种生理功能，包括清除自由基、抑制肿瘤细胞扩散、防止动脉粥硬化、调节免疫系统和控制脂质积累等。目前，共轭亚油酸主要是通过化学方法合成，不仅造成了严重的化工污染，而且合成得到的是多种结构共轭亚油酸的混合物，下游分离成本十分高昂。最近几年，研究的焦点逐渐转移到利用生物法合成专一的共轭亚油酸上来了。

目前，利用生物法合成专一性共轭亚油酸的方法是将来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶在其它宿主中异源表达，再用重组菌直接催化生产共轭亚油酸或者提取胞内表达的酶，用酶催化共轭亚油酸的生产。其中以大肠杆菌为宿主构建工程菌生产亚油酸异构酶时，重组亚油酸异构酶定位在重组大肠杆菌的细胞质中，为了获得胞内酶需要将细胞破碎，此过程极大的增加了工业化生产共轭亚油酸的成本。因此，开发简便高效的亚油酸异构酶提取方法成为利用生物酶法生产共轭亚油酸的关键技术之一。

噬菌体ФX174裂解蛋白E是一种来源于噬菌体的小分子蛋白，其能够融合革兰氏阴性菌的内外膜，并在细胞膜上形成大小为40～200nm的空洞。细胞质中的物质在内外渗透压差的作用下，被排出细胞。目前，噬菌体ФX174裂解蛋白E已经被应用于免疫领域制备细胞菌影和用于蛋白领域用于回收高纯度的包涵体。

发明内容

本发明提供了一种利用噬菌体ФX174裂解蛋白E释放PAI的方法，能够使重组大肠杆菌中81％的亚油酸异构酶被释放到胞外环境中。

本发明的第一个目的是提供一种噬菌体ФX174裂解蛋白E，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述噬菌体ФX174裂解蛋白E的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明的第三个目的是提供携带所述噬菌体ФX174裂解蛋白E的载体或细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pBV220。

本发明的第四个目的是提供所述噬菌体ФX174裂解蛋白E在食品、生物领域的应用。

本发明的第五个目的是提供一种提高微生物蛋白释放率的方法，其特征在于，在所述微生物细胞中共表达噬菌体ФX174裂解蛋白E，所述噬菌体ФX174裂解蛋白E含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物包括革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述方法用于提高酶(PAI)的可溶性表达量。

本发明的第六个目的是提供一种生产亚油酸异构酶(PAI)的重组大肠杆菌，是以E.coli BL21(DE3)为宿主，以T7启动子调控PAI的表达，以启动子ParaB控制伴侣蛋白GroEL-GroES(GroES和GroEL的编码基因分别为NCBI-Gene ID:948655和NCBI-Gene ID:948665)的表达；以启动子pR/pL控制噬菌体ФX174裂解蛋白E的表达。

本发明的第七个目的是提供一种构建所述重组大肠杆菌的方法，所述方法是将pBV220与噬菌体ФX174裂解蛋白E基因连接，构建重组质粒pBV220-E，再将构建获得的重组质粒pBV220-E转化至E.coli BL21(DE3)中。

本发明的第八个目的是提供一种生产PAI的方法，所述方法应用所述的重组大肠杆菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵是在35～37℃下培养10～16h，转接至加入终浓度为4～6mg/mL的L-阿拉伯糖发酵培养基，在35～37℃下培养到OD₆₀₀＝1.2～1.5；添加IPTG至终浓度为0.1～0.2mmol/L，降低温度到20～22℃诱导PAI连续表达16～20h；升高温度到40～42℃，维持2～3h,诱导噬菌体ФX174裂解蛋白E的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体为：将37℃、200rpm下培养12h的重组大肠杆菌以2％的接种量转入发酵培养基，同时根据需要加入终浓度为4.0mg/mL的_L-阿拉伯糖，在37℃、200rpm下培养到OD₆₀₀＝1.5；添加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，降低温度到20℃诱导PAI连续表达20h；升高温度到42℃，并维持3h,诱导噬菌体ФX174裂解蛋白E的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述方法还在低渗双蒸水中添加100mM ETDA、0.2％脱氧胆酸钠、0.5％吐温-20、0.5％曲拉通X-100促进胞内PAI的释放量。

本发明还提供所述重组大肠杆菌在制备含PAI的产品方面的应用。

有益效果：本发明是以重组大肠杆菌E.coli(PAI/GroELS)作为出发菌株，通过引入噬菌体ФX174裂解蛋白E诱导重组大肠杆菌的裂解，从而促进的PAI的释放。有少量的PAI被释放到发酵培养基中；将诱导裂解后的细胞悬浮于不同渗透压的溶液中2h，当细胞悬浮于低渗双蒸水中时，大约35％的胞内PAI从细胞中释放出来。通过在低渗双蒸水中添加100mM ETDA、0.2％脱氧胆酸钠、0.5％吐温-20、0.5％曲拉通X-100促进胞内PAI的释放量，当添加0.2％的脱氧胆酸钠时，54％的胞内PAI被释放出细胞外；进一步将用0.2％脱氧胆酸钠的低渗双蒸水溶液处理的细胞悬浮于高渗30％甘油的溶液中，81％的胞内PAI被释放出重组大肠杆菌细胞。本发明为利用生物法转化生产共轭亚油酸奠定了基础。本发明提供的重组大肠杆菌胞内亚油酸异构酶提取方法操作简单，便于使用，具有很好的应用前景。

附图说明

图1为噬菌体ФX174裂解蛋白E对细胞内溶物释放的影响。泳道M，标准蛋白质分子量；泳道1，诱导裂解细胞；泳道2，完整细胞。

图2为不同渗透压溶液对PAI释放量的影响。其中，A，诱导裂解细胞；B，完整细胞。泳道M，标准蛋白质分子量；泳道1和4，2和5，3和6，分别用高渗30％甘油溶液、等渗生理盐水和低渗双蒸水处理。备注：括号内为酶活释放率；伴侣蛋白GroES(10kDa)分子量太小未能在图中检测到。

图3为不同添加剂对PAI释放量的影响。泳道M，标准蛋白质分子量；泳道1，曲拉通X-100；泳道2，0.5％吐温-20；泳道3，0.2％脱氧胆酸钠；泳道4，100mM EDTA；泳道5，双蒸水溶液。

具体实施方式

重组大肠杆菌种子培养及发酵：

种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨12，酵母粉24，甘油5，KH₂PO₄ 2.31，K₂HPO₄ 16.4。

培养条件：将37℃、200rpm下培养12h的种子以2％的接种量转入发酵培养基，于20℃、200rpm条件下培养20h；42℃条件下培养3h。

实施例1

从含有E.coli(PAI/GroELS)的新鲜平板上挑取单菌落，至终浓度为100μg/ml的卡那霉素和氯霉素的LB培养基中，37℃、200rpm培养OD₆₀₀＝0.4-0.6时，从摇床取出，冰浴30min后离心。用0.1mol/L的CaCl₂洗涤菌体3次。将pBV220-E质粒加入到感受态细胞中，冰浴30min后42℃水浴热击90s，添加1ml的LB培养基，37℃培养1h后涂布相应抗性平板，待其长出后挑取正确转化子，得到含有相应质粒的重组大肠杆E.coli(PAI/GroELS/E)。

实施例2

从平板上挑取重组菌E.coli(PAI/GroELS/E)的单菌落于含有相应抗生素的LB培养基，过夜培养后作为种子液，以2％的接种量接种于50mL的发酵培养基中，同时加入终浓度为4.0mg/ml的_L-阿拉伯糖诱导分子伴侣蛋白表达。待菌体浓度培养至OD₆₀₀＝1.5时加入IPTG至终浓度为0.1mmol，降低温度到20℃、200rpm下培养20h，升高温度到42℃维持3h诱导重组大肠杆菌细胞裂解。

实施例3

将诱导裂解和完整细胞分别于8000×g、4℃、离心5min收集，等量细胞分别悬浮于高渗30％甘油溶液、等渗生理盐水溶液和低渗双蒸水溶液，并放置于冰水浴中震荡2h。8000×g、4℃、离心10min收集上清液，对上清液进行酶活测定。PAI释放率＝释放的酶活÷细胞内的酶活(用超声破壁后的酶活测定值)×100％。将EDTA、吐温-20、脱氧胆酸钠(DOC)、曲拉通X-100添加到双蒸水至终浓度为100mM、0.5％、0.2％、0.5％用于促进PAI的释放。

对DOC浓度进行了优化，结果显示，添加0.005～0.1％DOC对PAI释放率促进作用较小，释放率为35～39％，DOC浓度在0.1～0.2％下PAI释放率显著增加，提高至39～54％，＞0.2％后释放率处于54％左右维持不变。用0.2％脱氧胆酸钠的双蒸水溶液处理后的细胞继续悬浮于高渗30％甘油溶液中，放置于冰水浴中震荡2h。通过此过程使细胞内81％的PAI被释放出细胞。

实施例4

采用分光光度法测定PAI的酶活。1个单位的PAI酶活定义为：25℃下每分钟催化底物亚油酸形成1μmol共轭亚油酸(HPOD,ε＝17107.3L/(mol×cm))所需的酶量。酶活测定条件：以亚油酸为底物，在25℃下利用Shimadzu UV-2450分光光度计在线测定234nm下吸光值的变化，以吸光值变化曲线初始部分的斜率计算酶活。

相同菌体量的胞内总酶活为1.17U。释放率(％)＝(释放的总酶活/胞内总酶活)×100％。

结果如图3所示，双蒸水、100mM EDTA、100mM EDTA、0.2％脱氧胆酸钠、0.5％吐温20、0.5％曲拉通对应的酶活释放量为：0.41、0.47、0.63、0.37和0.51U。释放率依次为：35％、39％、54％、32％和44％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种噬菌体ФX174裂解蛋白E及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 91

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Val Arg Trp Thr Leu Trp Asp Thr Leu Ala Phe Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Leu Pro Ser Leu Leu Ile Met Phe Ile Pro Ser Thr Phe

20 25 30

Lys Arg Pro Val Ser Ser Trp Lys Ala Leu Asn Leu Arg Lys Thr Leu

35 40 45

Leu Met Ala Ser Ser Val Arg Leu Lys Pro Leu Asn Cys Ser Arg Leu

50 55 60

Pro Cys Val Tyr Ala Gln Glu Thr Leu Thr Phe Leu Leu Thr Gln Lys

65 70 75 80

Lys Thr Cys Val Lys Asn Tyr Val Arg Lys Glu

85 90

<210> 2

<211> 276

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggtacgct ggactttgtg ggataccctc gctttcctgc tcctgttgag tttattgctg 60

ccgtcattgc ttattatgtt catcccgtca acattcaaac ggcctgtctc atcatggaag 120

gcgctgaatt tacggaaaac attattaatg gcgtcgagcg tccggttaaa gccgctgaat 180

tgttcgcgtt taccttgcgt gtacgcgcag gaaacactga cgttcttact gacgcagaag 240

aaaacgtgcg tcaaaaatta cgtgcggaag gagtga 276

Claims

1.一种生产亚油酸异构酶的重组大肠杆菌，其特征在于，共表达噬菌体ФX174裂解蛋白E，所述噬菌体ФX174裂解蛋白E含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌以E.coliBL21(DE3)、E.coli JM109(DE3)、E.coli OrigamiB(DE3)、E.coli Rosetta(DE3)、中的任意一种作为宿主。

3.根据权利要求5所述的重组大肠杆菌，其特征在于，以E.coli BL21(DE3)为宿主，以T7启动子调控亚油酸异构酶的表达，以启动子ParaB控制伴侣蛋白GroEL-GroES的表达；以启动子pR/pL控制噬菌体ФX174裂解蛋白E的表达。

4.一种提高微生物蛋白释放率的方法，其特征在于，在所述微生物细胞中表达噬菌体ФX174裂解蛋白E，所述噬菌体ФX174裂解蛋白E含有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述微生物包括革兰氏阴性细菌。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括但不限于酶。

7.一种生产亚油酸异构酶的方法，其特征在于，应用权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌进行发酵。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在发酵过程中添加ETDA、1～2g/L脱氧胆酸钠、吐温-20、曲拉通X-100。

9.SEQ ID NO.1所示的噬菌体ФX174裂解蛋白E在食品、生物领域的应用。

10.权利要求5～7任一所述的重组大肠杆菌在制备含蛋白的产品方面的应用。