CN108603886A

CN108603886A - 对缺血性脑梗塞的多能干细胞的动员

Info

Publication number: CN108603886A
Application number: CN201780006759.2A
Authority: CN
Inventors: 出泽真理; 黑田敏
Original assignee: INSTITUTE OF LIFE SCIENCES; University of Toyama NUC
Current assignee: INSTITUTE OF LIFE SCIENCES; University of Toyama NUC; Life Science Institute Inc
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2018-09-28
Anticipated expiration: 2037-01-16
Also published as: CA3011333C; KR20200101991A; EP3404415B1; AU2017207154A1; US10641762B2; JP2020153991A; JP6940101B2; EP3404415A1; US20190025290A1; CN108603886B; JPWO2017122829A1; EP3404415A4; AU2017207154B2; WO2017122829A1; KR20180100337A; KR102262248B1; AU2020226991A1; SG11201806045XA; CA3011333A1

Abstract

一种检测方法，包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA‑3阳性多能干细胞的数量的步骤，将多能干细胞的数量作为指标的用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞。

Description

对缺血性脑梗塞的多能干细胞的动员

技术领域

本发明涉及一种用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞的检测方法、以及在上述检测方法中所使用的试剂盒。

背景技术

中风是人死亡的一个主要原因。在所有中风患者中，80％以上与缺血性脑梗塞有关[1]。尽管有很多研究，但是中风的治疗依然限定于在发病后4.5小时以内使用组织纤溶酶原活化因子(tPA)的血栓溶解疗法。对于慢性期的缺血性脑梗塞患者而言，仅确立了支援性照顾和康复。因此，需要一种用于改善患者的功能转换的替代治疗方法。

在最近的研究中，被证实在包括缺血性脑梗塞的各种疾病中，各种干细胞/前体细胞从骨髄向外周血动员。该细胞中包括内皮前体细胞(EPC)、造血干细胞、CD31阳性细胞(血管前体细胞)等，有助于脑血管新生。另外，间充质干细胞(MSC)释放出神经营养因子等，能提高缺血性脑梗塞后的功能恢复[2]。更重要的是，这些细胞还含有能分化为神经细胞的少数多能性细胞[3]。最近，出泽等人在真皮纤维芽细胞以及MSC等的成人人间充质细胞中，发现了独特种类的干细胞。由于这些干细胞占MSC整体的百分之几、为应激耐性，因此被命名为多系分化持续应激(Multilineage-differentiating Stress Enduring(Muse))细胞[4]。这些干细胞能够作为阳性细胞有效地分离成公知的人胚胎干(ES)细胞标记的阶段特异性胚胎抗原(Stage Specific Embryonic Antigen(SSEA))-3。通过使用SSEA-3抗体，利用FACS，能从人骨髄及纤维芽细胞有效地分离Muse细胞[4]。Muse细胞能够自我复制，能够表达Nanog、Oct3/4以及Sox2等与多能性有关的基因，能从单一细胞分化为内胚叶、外胚叶以及中胚叶系统的细胞。在细胞因子诱导下，Muse细胞以约90％的非常高的比例分化为神经元标记物阳性细胞[5]。在动物实验中，在体内进行移植时作为组织修复细胞发挥作用；这些Muse细胞朝向损伤组织移动，在一些疾病动物模型中，自发地分化为适合于归巢了的组织的细胞[4]。实际上，当Muse细胞被直接注射入小鼠的梗塞脑中时，移植到宿主的脑后，能够进入组织中，表达神经元标记物，显著提高功能恢复[6]。与ES细胞或被诱导的多能干细胞(iPS细胞)等公知的多能干细胞不同，Muse细胞的端粒酶活性低，在免疫缺陷小鼠精巢中不会形成畸形[5、7]。

发明内容

解决技术问题所采用的技术方案

本发明人等发现在缺血性脑梗塞的患者中，在其急性期SSEA-3阳性多能干细胞(Muse细胞)从骨髄向外周血液动员，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

[1]一种检测方法，包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的步骤，将多能干细胞的数量作为指标用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞。

[2]根据前述[1]所述的检测方法，从受试者采取的血液样本是在从脑梗塞样症状刚刚发病到60天内所采取的。

[3]根据前述[1]或[2]所述的检测方法，多能干细胞是在缺血性脑梗塞的急性期，从骨髄向外周血液动员的干细胞。

[4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的检测方法，其特征是，将脑梗塞的预后与受试者有无吸烟和/或饮酒相互关联。

[5]根据前述[1]～[4]中任一项所述的检测方法，还包括与截断值进行比较的步骤。

[6]一种在前述[1]～[5]中任一项所述的检测方法中所使用的试剂盒，包括能够测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的试剂。

[7]一种筛选脑梗塞的治疗药物的方法，包括使受试者和脑梗塞的治疗药物的候选化合物接触后，测定来源于该受试者的血液样本中的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的步骤。

[8]根据前述[7]所述的筛选方法，还包括与截断值进行比较的步骤。

发明效果

根据本发明，能够预测脑梗塞的预后，另外，能够诊断由短暂性缺血发作引起的脑梗塞的风险，此外，对无症状性脑梗塞的诊断也有用。

附图说明

[图1]图1表示尺寸为小、中以及大的脑梗塞(箭头)的代表性FLAIR图像。

[图2]图2表示健康的人(A)以及缺血性脑梗塞(B)的代表性FACS数据。上图表示对照细胞计数数据，中图表示仅具有二级抗体的细胞计数数据，下图表示具有一级及二级抗体的细胞计数数据。SSEA-3阳性细胞在下图中鉴定(箭头)。

[图3]图3表示缺血性脑梗塞发病后30天内SSEA-3⁺细胞随时间变化的曲线图。A)减少了的组、B)未变化的组、以及C)增加了的组。

[图4]图4表示显示SSEA-3阳性细胞的小部分(绿色)的人骨髄的荧光免疫组织化学的显微镜照片。比例尺＝50μm。

[图5]图5表示年龄与骨髄中的SSEA-3⁺细胞比例之间的关系。白色圆圈表示没有接受化学疗法的患者的数据，黑色圆圈表示接受了化学疗法的患者的数据。

具体实施方式

以下，为了对本发明进行说明，对优选的实施方式进行详细阐述。本领域技术人员应理解为本发明并不限定于以下优选的实施方式，在其主旨的范围内也可以进行各种变形。

本发明提供一种基于测定在受试者中从骨髄向外周血动员了的多能干细胞(Muse细胞)的数量的、预测受试者的脑梗塞的预后的检测方法、以及在检测方法中所使用的试剂盒等。

1.疾病对象

本发明的目的在于，通过测定SSEA-3阳性多能干细胞(Muse细胞)在血液中的数量，诊断脑梗塞的预后、基于短暂性缺血发作的脑梗塞的风险、以及无症状性脑梗塞。此处，所谓“脑梗塞”是指由于脑血管的堵塞或灌流压的降低，导致在脑中产生局部性的缺血部分，呈现出神经细胞的不可逆的细胞死亡的状态。更具体而言，包括由于脑内小动脉因堵塞而发病的腔隙性梗塞、由于脑内大动脉因动脉粥样硬化堵塞而发病的动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞、以及由于心脏内的血栓形成栓子并堵塞脑内动脉而发病的心源性脑栓塞症的任一种。另外，在脑梗塞中也包括急性期、亚急性期、恢复期(慢性期)等任一种。在本发明中，将从刚刚发病到60天内的受试者的血液样本作为测定对象。此处，所谓“发病”被定义为最后见到患者正常状态的时间、或者在没有目击者的睡眠中引起脑梗塞时的睡眠时间。在脑梗塞中，根据血栓的来源被分为脑血栓和脑栓塞，本发明对脑血栓及脑栓塞，，进而对脑梗塞预后的诊断有用。所谓“短暂性缺血发作”是指由脑循环中血栓栓塞症引起的短暂性急性神经功能障碍。根据本发明，能够诊断这种短暂性缺血发作后是否发生脑梗塞的风险。另外，在本说明书中使用时，所谓“无症状性脑梗塞”是指例如，不具有急性并且显性的中风特征的症状，例如轻偏瘫、知觉减退和/或失语症的脑组织的缺血状态。

2.多能干细胞

在本发明的检测方法等中所使用的多能干细胞可以是作为本发明人之一的出泽在人生物体内发现其存在、且被命名为“Muse(多系分化持续应激、Multilineage-differentiating Stress Enduring)细胞”的细胞。一般而言，Muse细胞能够从骨髄液、脂肪组织(Ogura，F.，et al.，Stem Cells Dev.，Nov 20，2013(Epub)(published on Jan 17，2014))或真皮结缔组织等皮肤组织获得，也分散在各个内脏器官的结缔组织。另外，该细胞是兼具有多能干细胞和间充质干细胞的双方性质的细胞，例如，作为各个细胞表面标记物的“SSEA-3(阶段特异性胚胎抗原-3、Stage-specific embryonic antigen-3)”阳性、或者作为“SSEA-3”和“CD105”的双重阳性进行鉴定。因此，Muse细胞或者含有Muse细胞的细胞集团，例如，能够将这些抗原标记物作为指标从生物体组织进行分离。Muse细胞的分离方法、鉴定方法、以及特征等的详细内容公开在国际公开第WO2011/007900号。另外，正如Wakao等人(2011，上述)报告的那样，已知从骨髄、皮肤等培养间充质细胞，将其作为Muse细胞群使用的情况下，所有SSEA-3阳性细胞均为CD105阳性细胞。因此，在从生物体的间充质组织或者培养的间充质干细胞分离Muse细胞的情况下，能够仅将SSEA-3作为抗原标记物来精制Muse细胞、并使用。需要说明的是，在本说明书中，有时将可以在诊断脑梗塞(包括后遗症)的方法中使用的、将SSEA-3作为抗原标记物从生物体的间充质组织或者培养的间充质组织经分离的多能干细胞(Muse细胞)或者含有Muse细胞的细胞集团仅记载为“SSEA-3阳性细胞”。另外，在本说明书中，所谓“非Muse细胞”是指在生物体的间充质组织或者培养的间充质组织中所含有的、“SSEA-3阳性细胞”以外的细胞。

简单而言，Muse细胞或者含有Muse细胞的细胞集团，能够单独使用与作为细胞表面标记物的SSEA-3相对应的抗体、或者同时使用与SSEA-3及CD105相对应的各自的抗体，从生物体组织(例如，间充质组织)进行分离。此处，所谓“生物体”是指哺乳动物的生物体。在本发明中，生物体不包括受精卵以及发育阶段在囊胚期之前的胚胎，但包括胎儿以及包含囊胚的发育阶段在囊胚期之后的胚胎。对于哺乳动物并没有进行限定，但可例举人、猴子等灵长类；小鼠、大鼠、兔子、豚鼠等啮齿类；猫、狗、羊、猪、牛、马、驴、山羊、鼬等。Muse细胞在能够直接使用标记物从生物体的组织进行分离的方面考虑，可以明显与胚胎干细胞(ES细胞)、iPS细胞进行区分。另外，所谓“间充质组织”是指存在于骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨骼肌、真皮、韧带、肌腱、牙髓、脐带、脐带血等组织以及各种内脏器官的组织。例如，Muse细胞能够从骨髄、皮肤、脂肪组织获得。例如，理想的是采取生物体的间充质组织，从该组织分离Muse细胞，并利用。另外，也可以使用上述分离方法，从纤维芽细胞或骨髄间充质干细胞等培养的间充质细胞分离Muse细胞。

如前所述，已知Muse细胞或者含有Muse细胞的细胞集团，例如，能够将SSEA-3阳性、以及SSEA-3与CD105的双重阳性作为指标从生物体组织进行分离，但在人的成人皮肤中，含有各种类型的干细胞以及前体细胞。然而，Muse细胞与这些细胞并不相同。这种干细胞及前体细胞可例举来源于皮肤的前体细胞(SKP)、神经嵴干细胞(NCSC)、成黑素细胞(MB)、血管周细胞(PC)、内皮前体细胞(EP)、来源于脂肪的细胞(ADSC)。在这些细胞将固有的标记物的“非表达”作为指标，可分离Muse细胞。更具体而言，Muse细胞可将选自CD34(EP及ADSC的标记物)、CD117(c-kit)(MB的标记物)、CD146(PC及ADSC的标记物)、CD271(NGFR)(NCSC的标记物)、NG2(PC的标记物)、vWF因子(血管性血友病因子)(EP的标记物)、Sox10(NCSC的标记物)、Snai1(SKP的标记物)、Slug(SKP的标记物)、Tyrp1(MB的标记物)、以及Dct(MB的标记物)的11个标记物中的至少1个，例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或者11个标记物的非表达作为指标进行分离。例如，虽然不受限定，但能够将CD117及CD146的非表达作为指标进行分离，进而能够将CD117、CD146、NG2、CD34、vWF以及CD271的非表达作为指标进行分离，进而能够将上述11个标记物的非表达作为指标进行分离。

此外，具有上述特征的Muse细胞也可以具有选自以下(i)～(iv)中的至少一个性质：

(i)端粒酶活性低或者无；

(ii)具有分化为三胚叶的任一胚叶细胞的能力；

(iii)不显示肿瘤性增殖；和/或

(iv)自我更新能力。在本发明的一个方面，Muse细胞具有上述所有性质。此处，关于上述(i)，所谓“端粒酶活性低或者无”是指，例如在使用TRAPEZEXL端粒酶检测试剂盒(telomerase detection kit)(密理博(Millipore)公司)检测端粒酶活性的情况下，检测值低或者无法检测。所谓端粒酶活性“低”是指，例如具有与作为体细胞的人纤维芽细胞同等程度的端粒酶活性，或者具有与Hela细胞相比1/5以下，优选1/10以下的端粒酶活性的情况。关于上述(ii)，Muse细胞具有在体外及在体内分化为三胚叶(内胚叶系、中胚叶系以及外胚叶系)的能力，例如，通过在体外进行诱导培养，可以分化为肝细胞、神经细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞、骨细胞、脂肪细胞等。另外，在体内移植到精巣的情况下有时也显示分化为三胚叶的能力。此外，具有通过静脉注射移植到生物体、游走并移植到受到损伤的内脏器官(心脏、皮肤、脊髄、肝以及肌肉等)，并且分化为与组织相对应的细胞的能力。关于上述(iii)，Muse细胞具有如下性质,即通过悬浮培养以增殖速度约为1.3天进行增殖，但通过悬浮培养从1个细胞开始增殖，并制作胚状体样细胞块，到14天左右停止增值，但是将这些胚状体样细胞块转移到粘合培养时，细胞增殖重新开始，从细胞块增殖的细胞逐渐增加。此外在移植到精巣的情况下，具有至少半年不会癌化的性质。另外，关于上述(iv)，Muse细胞具有典型的自我更新(自我复制)的能力。此处，所谓“自我更新”是指能够确认到由1个Muse细胞通过悬浮培养而培养得到的胚状体样细胞块所含的细胞向3胚叶性细胞进行分化，同时通过对胚状体样细胞块的细胞重新将其1个细胞转移至悬浮培养，使其形成下一代的胚状体样细胞块，并且确认到其重0新向3胚叶性的分化以及悬浮培养中的胚状体样细胞块。自我更新重复1次或者多次周期即可。

3.检测方法

根据本发明，能够提供一种将Muse细胞的数量作为指标的用于预测受试者的脑梗塞的预后的检测方法，该检测方法包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的Muse细胞的数量的步骤。

在上述检测方法中，“被检测对象”只要是能引起脑梗塞的动物就什么动物都可以，更具体而言，可例举人、猴子或者大鼠等的啮齿类等。其中，本发明的脑梗塞的检测方法特别优选对怀疑有脑梗塞的人、或者脑梗塞发病后的人进行实施。

作为从上述被检测对象采取的“血液样本”，只要是含有从骨髄向外周血动员了的Muse细胞、能够测定其数量就没有特别限定，但具体而言，是EDTA血浆、柠檬酸血浆等的血浆，血清，全血中的任一种均可。其中，由于EDTA血浆可简单采取、容易保存并且采取量多因此优选使用。从被检测对象采取该血液样本的采血时机只要是进行诊断脑梗塞的时机就可以为任意时机，例如，优选从脑梗塞样症状刚刚发病到60天内的期间。

作为血液样本中所含的Muse细胞数量的测定方法，例如，使用荧光激活细胞分选(FACS)技术能够容易地测定采取至含有EDTA的管中的或者保存其的溶液所含有的Muse细胞。由于在上述采取的EDTA溶液中，除了Muse细胞还含有单核细胞，因此计算单核细胞中的SSEA-3阳性细胞的比例，就能够确定Muse细胞的数量。简而言之，能够使抗SSEA-3抗体作为一级抗体与经分离的单核细胞反应，然后，使荧光标记了的二级抗体反应，利用FACS设备确定细胞数量。

如前所述，在本发明的检测方法中，能够测定从被检测对象采取的血液样本(在本说明书中，有时将其称为“检测体”。)中的Muse的含量，将其作为指标，检测脑梗塞或者其预后。另外，也可以组合现有的作为脑梗塞标记的CRP或D-dimer等在检测体中的含量，或者也可以通过使用将临床症状的观察和心脏超声检查、MRI、MRA、颈部血管超声检查等结果相关联的复合指标来进行更准确的检测。

如后述的实施例2所示，在脑梗塞发病后的30天以内，根据从骨髄动员了的血液中的Muse细胞的数量的增减，主要可以分为3个类型。具体而言，分为：(i)从发病后开始细胞数量显著减少的类型(图3A)；(ii)无法看到从发病后开始细胞数量的显著变化的类型(图3B)；以及(iii)从发病后开始细胞数量显著增加的类型(图3B)。如果将这些类型与多变量分析的结果(参照表1)合并一起，则吸烟患者在第7天和/或第30天显著妨碍SSEA-3+细胞数量的增加，酒精摄取患者显著促进SSEA-3+细胞数量的增加。这样，本发明的检测方法能够将脑梗塞的预后和受试者有无吸烟和/或饮酒相互关联。此处，在本说明书中使用时，所谓受试者的“禁烟”是指在发病或者入院前的3个月以内以每天为标准的吸烟。另外，所谓“酒精摄取”是指受试者的酒精摄取量在3个月以内每周消耗超过150g的酒精量的情况。

这样，本发明能够提供一种预测脑梗塞预后的检测方法。脑梗塞的预后以在脑梗塞发病后，在某规定时间之后，由该受试者的脑梗塞引起的障碍程度来表示。障碍程度其本身为公知的，能够使用已经确定的指标来进行评价。作为指标，例如，可以使用日本版改良Rankin量表(mRS)判断标准(篠原幸人等、mRS可靠性研究小组、与改良Rankin量表(modified Rankin Scale)的可靠性相关的研究-日语版判定标准书以及问诊表的介绍、中风2007；29：6-13)等。此处，所谓“规定时间之后”可以是发病后的某时刻，但从评价受试者重返社会的状态的观点考虑，例如，一般在从发病开始到3个月～1年后期间进行评价。在预后的预测中，从预想方法的有用性方面进行考虑，通过从刚刚发病到60天内取至受试者的血液样本中的Muse细胞的数量，例如优选预测发病后3个月后的该受试者的状态的方法等，但不受限于此。

以从受试者采取的血液样本中所存在的Muse细胞的数量作为指标进行上述脑梗塞的预后等检测的情况下，可以和健康的人的血液样本中的Muse细胞的数量进行比较，也可以是规定适当的截断值来进行检测的方法。健康的人的Muse细胞的数量能够通过从事先在临床上已经确认到没有脑梗塞的健康的人采取血液，与从受试者采取的血液样本进行相同的处理以及测定、从而进行定量来获得。此处，所谓“截断值”，一般而言，是指在着眼于某种物质判断目标疾病群和非疾病群的情况下所规定的值。在判断目标疾病和非疾病的情况下，如果在截断值以下则设为阴性、如果在截断值以上则设为阳性，或者与其相反，如果在截断值以下则设为阳性、如果在截断值以上则设为阴性，以此可以判断疾病。

如后述的实施例2所示，由于通过测定明确了在健康的人中，血液中的Muse细胞的数量平均为3.5±4.3/μl，因此能够将该数值作为截断值来使用。在图3中，任意一个脑梗塞患者的数值都比上述数值高，由此显示在患者的血液中存在Muse细胞。因此，通过使用这样的截断值，例如，能够应用于所谓的患者是无症状性脑梗塞的诊断中，另外，能够评价脑梗塞治疗药物的效果。

利用本发明的检测方法被诊断为脑梗塞的受试者可以说是通过接受与各个疾病相适应的治疗方法，从而预后的经过以及治疗效果变得非常良好。

4.脑梗塞测定用试剂盒

本发明还提供一种包括能够测定从受试者采取的血液样本中存在的Muse细胞数量的试剂的在上述检测方法中所使用的试剂盒，用于进行脑梗塞的预防或者治疗效果的评价、或者用于进行脑梗塞预防或者治疗药物的筛选方法的试剂盒。试剂盒的内容物由试剂或者测定仪的组合构成，但只要含有与后述的各构成要素本质上相同、或者与其一部分本质上相同的物质，则构成及形态即使不同，也包括在本发明的试剂盒中。作为试剂，例如，在利用免疫测定方法测定Muse细胞数量的情况下，含有抗SSEA-3抗体。另外，根据需要，还可以含有生物体样本的稀释液、抗体固定化固相、反应缓冲液、清洗液、经标记的二级抗体、标记物的检测用试剂、标准物质等。作为生物体样本的稀释液，可例举在EDTA溶液、表面活性剂、缓冲剂等中含有BSA、酪蛋白等蛋白质的水溶液等。

反应缓冲液，例如，只要是提供Muse细胞的表面抗原和与其相对应的一级抗体进行结合反应时的溶剂环境的就可以，可以是任意反应缓冲液。经标记的二级抗体是与上述一级抗体相对应的抗体，可以使用FITC、辣根过氧化物酶(HRP)、牛小肠碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶等经标记的抗体。

5.确认脑梗塞的治疗效果的方法

本发明的其它方案是包括测定从给与了脑梗塞的治疗药物的受试者采取的血液样本中的Muse细胞的数量的步骤的、确认该受试者的脑梗塞的治疗效果的方法。所谓脑梗塞的治疗药物，只要是能作为治疗脑梗塞的药物使用的治疗药物就可以是任意的治疗药物，例如，可例举尿激酶、组织纤溶酶原活化因子等血栓溶解剂；肝素等抗凝剂、环氧化酶抑制剂、磷酸二酯酶抑制剂、血栓素A2(TAX2)合成抑制药等抗血小板剂；以及自由基清除剂等脑保护药等。

从给与了脑梗塞的治疗药物的受试者采取的血液样本中的Muse细胞的数量与给药前的数量相比增加或减少、或者接近脑梗塞未发病的对照受试者(例如，健康的人)的Muse细胞数量的情况下，就能够判断为有治疗效果。

6.脑梗塞预防或治疗药物的筛选方法

本发明的另外一种方案是脑梗塞的治疗药物的筛选方法，包括使受试者和脑梗塞的治疗药物的候选化合物接触后，测定该受试者的血液样本中的Muse细胞数量的步骤。所谓该筛选方法中的受试者，可以是血液样本中的Muse细胞数量显示出和脑梗塞状态相同的异常的非人动物个体。作为具有脑梗塞症状的动物，例如，可例举以外科手段等使其形成脑梗塞状态的脑梗塞模型非人动物(Yuji Kuge，Kazuo Minematsu等.Nylon Monofilament forIntraluminal Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats.Stroke，26，1655(1995))等。以血液样本中的Muse细胞的数量为基础，只要能够以脑梗塞状态的非人动物个体(例如，小鼠或大鼠)构建出与人的某种疾病类型类似的症状，就能够确立用于开发某种疾病类型的脑梗塞患者的治疗药物的实验体系。另外，通过监控非人动物个体预后的Muse细胞数量，能够开发对人的脑梗塞预后有效的治疗药物。

作为与这些受试者接触的脑梗塞的治疗药物候选化合物(以下，有时称为“候选化合物”。)，例如，可例举肽、蛋白、非肽性化合物、低分子合成化合物等，这些化合物可以是新型化合物，或者也可以是公知的化合物。在与候选化合物接触的受试者的Muse细胞数量与接触前的数量相比增加或减少，或者与对照的受试者的Muse细胞的数量接近的情况下，能够判断为该候选化合物对于脑梗塞具有治疗效果。

实施例

以下，通过实施例进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不限定于这些实施例。

材料以及方法

(1)受试者

在本研究中，包括在发病后，24小时以内以大脑半球(日语：テント上)区域的缺血性脑梗塞为理由住进医院的29名成人患者。腔隙性梗塞的患者被除外。男性为16名，女性为13名。平均年龄为71.4±13.3岁，为从41岁到93岁。本研究获得了富山大学医院及济生会富山医院的道德审查委员会的承认，并得到了各参加者的知情同意。

本发明人等对各患者收集了包括年龄、性别、入院时的NIHSS、过去的病历、吸烟、酒精摄取、缺血性脑梗塞的亚型、脑梗塞的位置和大小、发病后1个月内的改良Rankin量表的临床数据。过去的病历包括缺血性及出血性中风、高血压、真性糖尿病以及高脂血症。高血压被定义为比140/90mmHg更高的血压或者正在使用降压药的情况。真性糖尿病被定义为比6.5％更高的血红素A1C值或者正在使用抗糖尿病药物的情况。具有比140mg/dl更高的血清低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平或者正在使用降脂质药的患者被视为高脂血症。目前吸烟被定义为在入院前的3个月以内以每天为标准的任意吸烟。目前的酒精摄取量被定义为在3个月以内每周超过150g的酒精消耗量。

(2)生理学数据及实验数据

入院时记录了所有患者的血压、ECG、以及实验数据。在发病的7天后及30天后重复这些试验。

(3)辐射检测

入院时，针对所有患者使用1.5特斯拉的MR设备，获得了扩散加权成像、T2加权像以及液体衰减反转恢复(FLAIR)图像、和MR血管造影。脑梗塞的大小被分成3组为小、中以及大。在病变位于超过2支皮质支的区域的情况下脑梗塞的大小被分级为大，在病变位于1支皮质支的区域的情况下脑梗塞的大小被分级为中，以及在病变甚小的情况下脑梗塞的大小被分级为小(图1)。

(4)循环的SSEA-3⁺细胞的定量

为了对循环的SSEA-3⁺细胞进行定量，在入院时以及第7天和第30天采取了所有患者的外周血共3ml。将血液保存在含有乙二胺四乙酸(EDTA)的管中。为了分离单核细胞，将血液以同等容量的生理盐水进行稀释，并在2ml的人淋巴细胞分离液(Lymphoprep)(阿西斯-西德诊断有限公司(Axis-Shield Diagnostics Ltd.)，苏格兰)上铺层,在室温下以800g离心分离15分钟。接下来，使用荧光激活细胞分选(FACS)技术，确定了单核细胞中的SSEA-3阳性细胞的比例。简单而言，将经分离的单核细胞(约1×10⁶)再次悬濁于含有0.5％牛血清白蛋白以及2mM EDTA(FACS缓冲液)的100μl的冰冷磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)中。添加与SSEA-3(1：50稀释，密理愽(Millipore)，MAB4303)相对应的一级抗体，一边平稳地摇动一边在4℃下温育60分钟。一级抗体结合后，将细胞用FACS缓冲液清洗2次，再次悬濁于含有1：100的FITC结合山羊抗大鼠IgM(杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson ImmunoResearchLaboratories，Inc.)，巴尔的摩，PA)的100μl的FACS缓冲液中，一边平稳地摇动一边在4℃的暗处温育60分钟。二级抗体结合后，将细胞用冰冷FACS缓冲液清洗3次，再次悬濁于1ml的冰冷FACS缓冲液中，使其通过细胞过滤管(No.352235，BD Falcon)，之后立刻用FACSCantoTM II(BD Biosciences)进行了分析。在所有的FACS分析中，为了排除非特异性结合和/或自身荧光的可能性，使用了细胞的对照样本(仅暴露于二级抗体中)。使用BD FACSDiva软件(BD Biosciences)，计算FITC阳性细胞的数量。SSEA-3⁺细胞的绝对数值根据以下算式进行计算：

FACS上的SSEA-3⁺细胞数量(/μl)＝(所有WBC的数量-PMN的数量)(/μl)×SSEA-3⁺细胞(％)(式中，PMN表示多形核白细胞)

在本研究中，为了确定5名没有心血管障碍既往史的健康的人的SSEA-3⁺细胞的对照值，采取了外周血。男性为2名，女性为3名，平均年龄为56.2±4.2岁。在本研究中，SSEA-3⁺细胞的绝对数值在第7天或者第30天增加到入院时对照组的2倍以上时判断为增加，在第7天或者第30天减少到入院时的对照的一半以下时判断为减少。

(5)组织学分析

为了弄清楚人骨髄的SSEA-3⁺细胞的比例及分布，取得8名没有脑血管疾病既往的病理解剖患者的检测体。男性为5人，女性为3人。平均年龄为63.9±9.0岁，在57岁到73岁的范围内。他们均由于心肌梗塞、恶性肿瘤、心力衰竭等各种疾病而死亡。将检测体固定在经缓冲化的福尔马林(4％)中，包埋于石蜡中。然后，为了之后的染色制作了厚度4μm的切片。通过抗原回收使用压力釜对脱石蜡化了的切片处理2分钟。使用免疫组织化学，鉴定了人骨髄中的SSEA-3⁺细胞。简单而言，利用与SSEA-3相对应的一级抗体(大鼠单克隆，1：100稀释，密理愽(Millipore)，MAB4303)在4℃对各切片处理一晚，接下来，在室温下与荧光素(FITC)Sffini Pure(山羊抗大鼠IgM，1：50稀释，杰克逊免疫研究实验室有限公司(JacksonImmunoresearch))一起温育了1小时。最后，使用含有DAPI的ProLong Gold Antifade试剂在室温对切片染色24小时。在显微镜(BZ9000，基恩士株式会社(Keyence Co.)、大阪、日本)下以20×的倍率在随机的5个视野中计算了骨髄细胞整体的SSEA-3⁺细胞的比例。

(6)统计分析

将数据作为平均±SD进行表示。使用χ²检验比较了分类变量。连续变量使用2个组间的两侧不对称t检验及3个组间的单因素方差分析(ANOVA)进行了比较。当P值小于0.05时，则认为差别有统计学意义。

进行多个线性回归分析，确定了预测入院时循环的SSEA-3⁺细胞数量的重要因素。此外，进行多变量逻辑回归分析，确定了在缺血性脑梗塞的发病后，在第7天或者第30天用于决定循环的SSEA-3⁺细胞增加的独立因素。利用通过单变量分析得到的P＜0.40，就参数实施了进展阶段性模型的制造方法。在最终多变量解析中，将统计学有意水平设为P＜0.05。结果作为经调整的优势比(OR)及与其对应的95％置信区间(CI)进行表示。

实施例1：临床特征

入院时的平均NIHSS为8.6±7.4，在0～24的范围。在临床诊断方面，包括17名心脏栓塞症患者、7名动脉粥样化血栓性中风患者、3名大动脉栓塞症患者、以及2名其他患者。在过去的病历方面，为16个高血压、3个糖尿病、4个高脂血症、7个吸烟、以及10个酒精摄取病历。

第30天的平均mRS为2.3±2.2，在0～6的范围。在发病后，在8～30天期间有2名患者(6.9％)死亡，在本研究中仅分析了入院时及第7天的数据。针对脑梗塞的大小，13名患者被划分为小、10名患者被划分为中、以及6名患者被划分为大。

实施例2：循环的SSEA-3⁺细胞

图2表示对照及具有缺血性脑梗塞的患者的代表性FACS分析结果。在健康对照中，SSEA-3⁺细胞的数量在0～10μl的范围内，非常少。平均值为3.5±4.3/μl。另一方面，患者之间入院时的SSEA-3⁺细胞的基线数量差异较大。SSEA-3⁺细胞的平均数量为81.9±78.0/μl，在4.7～249.1/μl的范围内。由此，在29名受试者中的22人(75.9％)中，在从缺血性脑梗塞发病开始的24小时以内SSEA-3⁺细胞的数量显著增加。通过单变量分析，检测出了入院时的SSEA-3⁺细胞的数量和年龄、性别、入院时的NIHSS、过去的经历、缺血性脑梗塞的亚型、脑梗塞的尺寸、以及第30天的mRS之间没有显著关系。在多元线性回归分析中，未鉴定出在入院时预测循环的SSEA-3⁺细胞的绝对数量的重要因素。

在发病后30天以内连续评价了循环的SSEA-3⁺细胞的数量。这些数量在第7天及第30天，分别从81.9±78.0/μl变化为86.9±80.8/μl以及68.7±64.9/μl。在3个时间点间没有显著性差异。图3表示循环的SSEA-3⁺细胞的数量随时间变化的曲线图。能将动态分为3种类型；在29名患者中的8人(27.6％)中，循环的SSEA-3⁺细胞的数量在第7天显著减少。在8名患者中的7人中，这些数量在第30天没有得到恢复。在29名患者中的13人(44.8％)中，在发病后，30天以内其数量没有显著变化，维持了比对照组高的水平。然而，在29名患者中的其他8人(27.6％)中，循环的SSEA-3⁺细胞的数量在第7天和/或第30天显著持续增加。如表1所示，在单变量分析中，未鉴定出在缺血性脑梗塞发病后、30天期间用于预测循环的SSEA-3⁺细胞的持续增加的重要因素。然而，在多变量逻辑回归分析中，在发病后30天以内，显示出正在吸烟及酒精摄取显著影响缺血性脑梗塞患者的循环的SSEA-3⁺细胞的持续增加。正在吸烟的情况下优势比为0.0027(P＝0.0336，95％CI＝0-0.633)，酒精摄取的情况下优势比为1688(P＝0.0220，95％CI＝2.91-978046)。

[表1]

表1.

对于缺血性脑梗塞后的循环的SSEA-3⁺细胞增加的独立的预测因素。

OR：优势比，CI：置信区间。

实施例3：人骨髄的SSEA-3⁺细胞的分布

骨髄细胞的小部分相对于SSEA-3为阳性。如图4所示，SSEA-3⁺细胞的分布不均匀。它们如簇状分布。SSEA-3⁺细胞的比例从0％变化到0.5％，平均值为0.2±0.17％。如图5所示，SSEA-3⁺细胞的比例在因恶性肿瘤而进行了化学疗法处理的3名患者中低于0.1％。如果去除这3名患者，就没有了统计学意义，但在患者的年龄和骨髄中的SSEA-3⁺细胞的比例之间具有产生负相关的倾向。

考察

在该研究中，使用与SSEA-3相对应的一级抗体对骨髄的检测体进行染色。这是因为在以前的研究中，没有显示出骨髄Muse细胞的局部存在。其结果是，本研究显示出SSEA-3⁺细胞相当于骨髄细胞整体的大约0.2％。根据以前的研究，确认到Muse细胞在人骨髄的吸取液中的比例为0.03％，在MSC中确认到比例为5～6％[5]。这些集团具有随着年龄缓慢减少的倾向，但可能是由于样本数量少而无法获得统计学意义。颇有意思的是，由于化学疗法和放射线照射有可能引起干细胞/前体细胞、以及含有MSC的骨髄细胞的长期损伤，因此在对恶性肿瘤进行了化学疗法处理的患者中，Muse细胞的集团非常小[8]。因此，在化学疗法后，就连SSEA-3⁺细胞也有可能受到不可逆的或者持续的损伤。

目前，已知骨髄中的干细胞/前体细胞在包括缺血性脑梗塞的各种疾病中会迅速地向外周血动员[2]。表达早期前体标记物的非造血干细胞在急性心肌梗塞[9，10]及缺血性脑梗塞[11]后，从骨髄向外周血动员。最近，Yu等人(2013)对急性心肌梗塞的患者在第0天、第1天以及第7天分离了外周血单核细胞，测定了胚胎干细胞标记物的mRNA表达。他们报告了在第0天及第1天Oct4、Nanog、CD31、以及VE-钙粘蛋白(Cadherin)的mRNA水平在外周血中显著高[12]。此外，在缺血性脑梗塞的患者中也观察到了相同的现象[13，14]。现在的见解是对以前这些数据的模仿。因此，在29名缺血性脑梗塞患者中的22人中，循环的SSEA-3⁺细胞的数量与对照相比在入院时非常多。

在该研究中，在缺血性脑梗塞的患者间，入院时的SSEA-3⁺细胞的基线数量差异较大。临床参数预测不了SSEA-3⁺细胞的基线数量。30天以内的动态也因患者而大不相同。结果与以前的研究密切相关。因此，Dunac等人(2007)评价了25名缺血性脑梗塞患者的CD34阳性细胞的动员，发现了对于每个患者及1名患者每一天细胞数量都有较大的变动[15]。然而，本研究显示出29名患者中的8人(27.6％)在缺血性脑梗塞发病后，在30天期间内确实并且连续动员了外周血中的SSEA-3⁺细胞(图2)。与此相对，在以前的研究中，显示出含有内皮前体细胞的干细胞/前体细胞的动员在发病后的24～48小时达到顶峰，回到急性心肌梗塞患者的对照组水平[16]。Taguchi等人(2004)还报告了CD34阳性细胞持续增加七天，然后，在第30天减少到基线水平[13]。因此，干细胞/前体细胞的动员的随时间变化的曲线图较大依赖于患者的状态以及动员的细胞的种类。

以前的研究显示出内皮前体细胞的动员通过包括年龄的增加以及真性糖尿病的各种因素得到控制。虽然也报告有相反的结果，但可以认为这些所有因素都阻碍动员[17，18]。然而，在该研究中，这些因素均与SSEA-3⁺细胞的随时间变化的曲线图不相关。相反，本研究明确显示出吸烟及酒精摄取对缺血性脑梗塞后的SSEA-3⁺细胞动员的动态有较大影响。因此，吸烟显著妨碍在第7天和/或第30天SSEA-3⁺细胞数量的增加，酒精摄取显著促进SSEA-3⁺细胞数量的增加。实际上，以前的多数研究强烈提示了由吸烟及酒精引起的对干细胞/前体细胞的生物学特征造成的影响。Ludwig等人(2010)报告了与非吸烟者相比吸烟者的循环CD34阳性细胞的数量显著较低[19]。另外Lamirault等人(2013)还报告了主动吸烟和骨髄及血液中的低CD34阳性细胞之间的关系[20]。对于干细胞/前体细胞的吸烟的有害影响，包括对于细胞及它们的控制机理的直接影响，以及它们的微小环境的变化。将干细胞/前体细胞暴露于烟成分有可能带来组织储药器的干细胞/前体细胞的细胞的数量和品质的降低[21]。有几种说明作用机理的假说。其中，与吸烟相关的活性氧类(ROS)的产生有可能使一氧化氮(NO)的生物学利用能力降低，减少来自骨髄的动员[22]。另外酒精的乱用也对人的健康造成不良影响。然而，流行病学的研究显示出乙醇的适度消耗可以降低冠状动脉性心脏疾病、突然的心脏死以及缺血性脑梗塞的风险。实际上，中等程度量的乙醇增强培养细胞的血管新生[23]。此外，Chiva-Blanch等人(2014)报告了啤酒的非酒精成分使心血管风险高的患者的循环内皮细胞的数量增加[24]。另外，红葡萄酒的中等程度的摄取也提高糖尿病小鼠的细胞动员[25]。因此，酒精中所含有的一些成分可能有助于干细胞/前体细胞的动员以及乙醇本身。

在本研究中，循环Muse细胞的连续增加与更好的功能转换没有直接关系。然而，根据最近的观察，外周血中的干细胞/前体细胞的动态有可能在由缺血性脑病变引起的过程中发挥重要的作用[14]。因此，Dunac等人(2007)测定了循环CD34阳性细胞，并得出了它们的动员程度在缺血性脑梗塞后与功能恢复直接相关[15]。另外Gojska-Grymajio等人(2012)报告了CD34阳性及CD34/CXCR4阳性细胞的动员的增加与更好的功能转换有关系[14]。因此，这些“高应答者”患者由于缺血性脑梗塞后的良好的功能的转换可以被赋予特征，但需要证明这些动员了的细胞向梗塞病变移动，并使人损伤的大脑再生。根据更广泛的研究，仍需证明SSEA-3⁺细胞的动员是否有助于缺血性脑梗塞后的功能恢复。

结论

本研究明确显示出在缺血性脑梗塞的急性期多能性Muse细胞从骨髄向外周血动员。吸烟及酒精摄取显著影响Muse细胞的随时间变化的曲线图。在该研究中，SSEA-3⁺细胞的基线数量及动态可能是由于在外周血中的数量少，因此与功能的转换没有关系。然而，使内源性的Muse细胞增加的治疗的介入、或者Muse细胞的外援性给与成为用于改善缺血性脑梗塞后的功能的转换的新型治疗策略。

上述所有参考文献、以及与其对应的申请的全部公开，作为参照其整体被编入本说明书中。

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Claims

1.一种检测方法，其特征在于，包括测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的步骤，将多能干细胞的数量作为指标用于预测或者诊断受试者的脑梗塞的预后、短暂性缺血发作后的脑梗塞风险或者无症状性脑梗塞。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，从受试者采取的血液样本是在从脑梗塞样症状刚刚发病到60天内所采取的。

3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，多能干细胞为在缺血性脑梗塞的急性期从骨髄向外周血动员的干细胞。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测方法，其特征在于，将脑梗塞的预后与受试者有无吸烟和/或饮酒相互关联。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的检测方法，其特征在于，还包括与截断值进行比较的步骤。

6.一种用于权利要求1～5中任一项所述的检测方法的试剂盒，其特征在于，包括能够测定从受试者采取的血液样本中所存在的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的试剂。

7.一种筛选脑梗塞的治疗药物的方法，其特征在于，包括使受试者和脑梗塞的治疗药物的候选化合物接触后，测定来源于该受试者的血液样本中的SSEA-3阳性多能干细胞的数量的步骤。

8.根据权利要求7所述的筛选方法，其特征在于，还包括与截断值进行比较的步骤。