JPWO2017122829A1

JPWO2017122829A1 - 虚血性脳梗塞への多能性幹細胞の動員

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Publication number: JPWO2017122829A1
Application number: JP2017561211A
Authority: JP
Inventors: 敏黒田; 真理出澤
Original assignee: Toyama University; Life Science Institute Inc
Current assignee: Toyama University; Life Science Institute Inc
Priority date: 2016-01-15
Filing date: 2017-01-16
Publication date: 2018-11-08
Anticipated expiration: 2037-01-16
Also published as: KR102262248B1; EP3404415A1; AU2017207154A1; JP6940101B2; CN108603886B; US10641762B2; CA3011333C; US20190025290A1; EP3404415B1; CN108603886A; AU2017207154B2; CA3011333A1; AU2020226991A1; KR20180100337A; JP2020153991A; EP3404415A4; KR20200101991A; SG11201806045XA; WO2017122829A1

Abstract

被験者から採取された血液試料中に存在するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞の数を測定する工程を含む、多能性幹細胞の数の指標とした、被験者における脳梗塞の予後、一過性虚血発作後の脳梗塞リスク若しくは無症候性脳梗塞を予測又は診断するための検査方法。

Description

本発明は、被験者における脳梗塞の予後、一過性虚血発作後の脳梗塞リスク若しくは無症候性脳梗塞を予測又は診断するための検査方法、及び上記検査方法に用いられるキットに関する。

脳卒中は、ヒトの死の主要原因の１つである。すべての脳卒中患者のうち、８０％以上が虚血性脳梗塞を被っている［１］。多くの研究にもかかわらず、脳卒中の治療は、発症後４．５時間以内に組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を用いた血栓溶解療法に依然として限定されている。慢性期の虚血性脳梗塞の患者に対しては、支援的なケアとリハビリテーションのみが確立されている。したがって、患者の機能的転帰を改善するための代替治療アプローチが必要とされる。

最近の研究では、様々な幹細胞／前駆細胞が、虚血性脳梗塞を含む様々な障害において、骨髄から末梢血に動員されることが実証されている。該細胞には内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、造血幹細胞、ＣＤ３１陽性細胞（血管前駆細胞）などが含まれ、脳における血管新生に寄与する。また、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、神経栄養因子等を放出し、虚血性脳梗塞後の機能回復を高める［２］。より重要なことには、これらはまた、神経細胞に分化することができる少数の多能性細胞を含む［３］。最近、出澤らは、真皮線維芽細胞及びＭＳＣなどの成人ヒト間葉系細胞において、独自のタイプの幹細胞を発見した。これらは、ＭＳＣ全体の数パーセントを占め、ストレス耐性であることから、Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇＳｔｒｅｓｓＥｎｄｕｒｉｎｇ（Ｍｕｓｅ）細胞と命名されている［４］。それらは、周知のヒト胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーであるＳｔａｇｅＳｐｅｃｉｆｉｃＥｍｂｒｙｏｎｉｃＡｎｔｉｇｅｎ（ＳＳＥＡ）−３に陽性の細胞として効率的に単離することができる。ＳＳＥＡ−３抗体を用いて、ＦＡＣＳにより、ヒト骨髄及び線維芽細胞からＭｕｓｅ細胞を効率的に分離することができる［４］。Ｍｕｓｅ細胞は、自己複製することができ、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ３／４及びＳｏｘ２などの多能性に関連する遺伝子を発現し、単一細胞から内胚葉、外胚葉及び中胚葉系統の細胞に分化することができる。サイトカイン誘導下で、Ｍｕｓｅ細胞は、約９０％の非常に高い割合でニューロンマーカー陽性細胞に分化する［５］。動物実験では、インビボで移植されたときに組織修復細胞として作用する；それらは、損傷組織に向かって移動し、いくつかの障害の動物モデルにおいて、帰巣される組織に適合する細胞に自発的に分化する［４］。実際に、Ｍｕｓｅ細胞はマウスの梗塞脳に直接注入されると、宿主の脳に生着した後、組織に組み込まれ、ニューロンマーカーを発現し、顕著に機能回復を高める［６］。ＥＳ細胞や誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの周知の多能性幹細胞とは異なり、Ｍｕｓｅ細胞はテロメラーゼ活性が低く、免疫不全マウス精巣において奇形を形成しない［５、７］。

本発明者らは、虚血性脳梗塞の患者において、その急性期に骨髄から末梢血にＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）が動員されることを発見し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］被験者から採取された血液試料中に存在するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞の数を測定する工程を含む、多能性幹細胞の数を指標とした、被験者における脳梗塞の予後、一過性虚血発作後の脳梗塞リスク若しくは無症候性脳梗塞を予測又は診断するための検査方法。
［２］被験者から採取された血液試料が、脳梗塞様症状の発症直後から６０日までの期間に採取されたものである、上記［１］に記載の検査方法。
［３］多能性幹細胞が、虚血性脳梗塞の急性期において骨髄から末梢血に動員されたものである、上記［１］又は［２］に記載の検査方法。
［４］脳梗塞の予後と被験者の喫煙及び／又は飲酒の有無とを関連付けることを特徴とする、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の検査方法。
［５］カットオフ値と比較する工程をさらに含む、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の検査方法。
［６］被験者から採取された血液試料中に存在するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞の数を測定することができる試薬を含む、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の検査方法に使用するためのキット。
［７］被験者と脳梗塞の治療薬の候補化合物を接触させた後、該被験者由来の血液試料中のＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞の数を測定する工程を含む、脳梗塞の治療薬をスクリーニングする方法。
［８］カットオフ値と比較する工程をさらに含む、上記［７］に記載のスクリーニング方法。

本発明によれば、脳梗塞の予後を予測することができ、また、一過性虚血発作に起因した脳梗塞のリスクを診断することができ、さらには、無症候性脳梗塞の診断に有用である。

図１は、サイズが小、中及び大の脳梗塞（矢印）の代表的なＦＬＡＩＲ画像を示す。図２は、健常人（Ａ）及び虚血性脳梗塞（Ｂ）における代表的なＦＡＣＳデータを示す。上段パネルは対照の細胞計数データを表し、中段パネルは二次抗体のみを有する細胞計数データを表し、下段パネルは一次及び二次抗体を有する細胞計数データを表す。ＳＳＥＡ−３陽性細胞は下段パネルで同定される（矢印）。図３は、虚血性脳梗塞の発症後３０日間のＳＳＥＡ−３⁺細胞の時間的プロファイルを示す。Ａ）減少したグループ、Ｂ）未変化のグループ、及びＣ）増加したグループ。図４は、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の小画分（緑色）を示すヒト骨髄における蛍光免疫組織化学の顕微鏡写真を示す。スケールバー＝５０μｍ。図５は、年齢と骨髄中のＳＳＥＡ−３⁺細胞の割合の間の関係を示す。白丸は化学療法を受けていない患者のデータを表し、黒丸は化学療法を受けた患者のデータを表す。

以下、本発明の説明のために、好ましい実施形態に関して詳述する。なお、本発明は、以下の好ましい実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々の変形を行ってもよいことは当業者に理解される。

本発明は、被験者における骨髄から末梢血に動員された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）の数を測定することに基づいた、被験者における脳梗塞の予後を予測する検査方法、及び検査方法に用いられるキット等を提供する。

１．対象疾患
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）の血中の数を測定することにより、脳梗塞の予後、一過性虚血発作に基づく脳梗塞のリスク、及び無症候性脳梗塞の診断を目的とする。ここで、「脳梗塞」とは、脳血管の閉塞や灌流圧低下により、脳に局所的な虚血部分が生じ、神経細胞の不可逆的細胞死を呈した状態をいう。より具体的には、脳内小動脈が閉塞して発症するラクナ梗塞、脳内大動脈が粥腫で閉塞して発症するアテローム血栓性脳梗塞、心臓内の血栓が栓子となり脳内動脈を閉塞して発症する心原性脳塞栓症のいずれをも含む。また、脳梗塞でも急性期、亜急性期、回復期（慢性期）等のいずれをも含む。本発明においては、発症直後から６０日までの被験者の血液試料を測定対象とする。ここで、「発症」とは、患者の正常な状態を最後に見たとき、又は目撃者のいない就寝中に脳梗塞が起こった際の就寝時と定義される。脳梗塞には、血栓の由来により脳血栓と脳塞栓に分類され、本発明は、脳血栓及び脳塞栓の診断、さらには、脳梗塞の予後の診断に有用である。「一過性虚血発作」とは、脳循環における血栓塞栓症に起因する一過性の急性神経機能障害を指す。本発明によれば、このような一過性虚血発作後に脳梗塞を発症し得るかどうかのリスクを診断することができる。また、本明細書において使用するとき、「無症候性脳梗塞」とは、例えば、急性かつ顕性の脳卒中を特徴付ける症状、例えば片側不全麻痺、知覚減退、及び／又は失語症のない、脳組織における虚血の状態を指す。

２．多能性幹細胞
本発明の検査方法等に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇＳｔｒｅｓｓＥｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞であってもよい。一般的に、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＤｅｖ．，Ｎｏｖ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎＪａｎ１７，２０１４））や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｅｍｂｒｙｏｎｉｃａｎｔｉｇｅｎ−３）」陽性として、又は「ＳＳＥＡ−３」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、脳梗塞（後遺症を含む）を診断する方法に使用され得る、ＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指す。

簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。Ｍｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。

上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性、及びＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。

さらに、上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び／又は
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、Ｍｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥＸＬｔｅｌｏｍｅｒａｓｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、典型的には、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。

３．検査方法
本発明によれば、被験者から採取された血液試料中に存在するＭｕｓｅ細胞の数を測定する工程を含む、Ｍｕｓｅ細胞の数の指標とした、被験者における脳梗塞の予後を予測するための検査方法が提供される。

上記検査方法において、「被検者」は、脳梗塞を起こす可能性のある動物であれば如何なるものでもよく、より具体的には、ヒト、サル、又はラットなどのげっ歯類等が挙げられる。本発明の脳梗塞の検査方法は、このうち、脳梗塞の疑いのあるヒト、又は脳梗塞発症後のヒトにおいて特に好ましく行われる。

上記被検者から採取された「血液試料」としては、骨髄から末梢血に動員されたＭｕｓｅ細胞を含有し、その数を測定できるものであれば特に制限はないが、具体的には、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿などの血漿、血清、全血の何れでもよい。これらのうち、ＥＤＴＡ血漿が簡便に採取でき、保存が容易で且つ採取量が多いため好ましく用いられる。被検者から該血液試料を採取するために採血するタイミングは、脳梗塞の診断を行うタイミングであればいずれのタイミングでもよく、例えば、脳梗塞様症状の発症直後から６０日までの期間であることが好ましい。

血液試料中に含まれるＭｕｓｅ細胞数の測定方法としては、例えば、ＥＤＴＡ含有チューブに採取した又はそれを保存した溶液に含まれるＭｕｓｅ細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術を用いて容易に行うことができる。上記採取したＥＤＴＡ溶液には、Ｍｕｓｅ細胞の他に単核細胞を含まれることから、単核細胞におけるＳＳＥＡ−３陽性細胞の割合を算出して、Ｍｕｓｅ細胞の数を決定することができる。簡単には、単離された単核細胞に抗ＳＳＥＡ−３抗体を一次抗体として反応させ、その後、蛍光標識した二次抗体を反応させ、ＦＡＣＳ装置により細胞数を特定することができる。

上記の通り、本発明の検査方法においては、被検者から採取された血液試料（本明細書中では、これを「検体」と称することがある。）中のＭｕｓｅの含有数を測定し、これを指標として、脳梗塞又はその予後を検査することができる。また、既存の脳梗塞マーカーであるＣＲＰやＤ−ｄｉｍｅｒなどの検体中の含有量を組み合わせてもよく、あるいは臨床症候の観察と心エコー、ＭＲＩ、ＭＲＡ、頚部血管エコーなどの結果とを関連付けた複合指標を用いることで、より的確に検査することが可能である。

後述する実施例２に示されるように、脳梗塞の発症後の３０日以内では、骨髄から動員された血液中のＭｕｓｅ細胞の数の増減により、主に３つのパターンに分類することができる。具体的には、（ｉ）発症後から有意に細胞数が減少するパターン（図３Ａ）、（ｉｉ）発症後から細胞数の顕著な変化が見られないパターン（図３Ｂ）、及び（ｉｉｉ）発症後から有意に細胞巣が増加するパターン（図３Ｂ）に分けられる。これらのパターンは、多変量解析の結果（表１参照）と併せると、喫煙患者は、７日目及び／又は３０日目にＳＳＥＡ−３⁺細胞の数の増加を有意に妨げ、アルコール摂取患者は有意に促進する。このようにして、本発明の検査方法は、脳梗塞の予後と被験者における喫煙及び／又は飲酒の有無を関連付けることができる。ここで、本明細書で使用するとき、被験者における「禁煙」とは、発症又は入院前の３ヶ月以内に毎日を基準にしたタバコ喫煙をいう。また、「アルコール摂取」とは、被験者によるアルコール摂取量が、３ヶ月以内に週あたり１５０ｇ超のアルコール量を消費することをいう。

このように、本発明は、脳梗塞の予後を予測する検査方法を提供することができる。脳梗塞の予後は、脳梗塞の発症後、ある一定期間の後に、その被験者の脳梗塞による障害の程度にて示される。障害の程度は、それ自体公知であって、既に確定している指標を用いて評価することができる。指標として、例えば、日本版モディファイド・ランキン・スコア（ｍＲＳ）判定基準（篠原幸人ら、ｍＲＳ信頼性研究グループ、ｍｏｄｉｆｉｅｄＲａｎｋｉｎＳｃａｌｅの信頼性に関する研究−日本語版判定基準書及び問診表の紹介、脳卒中２００７；２９：６−１３）等が用いられる。ここで、「一定の期間の後」とは、発症後のいつの時点でもよいが、被験者の社会復帰の状態を評価する観点から、例えば、発症から３ヶ月〜１年後までの間に評価するのが一般的である。予後の予測においては、予想方法の有用性を考慮して、発症直後から６０日までの被験者から取得した血液試料中のＭｕｓｅ細胞の数で、限定されないが、例えば、発症後３ヵ月後の該被験者の状態を予測する方法などが好ましい。

なお、被験者から採取された血液試料中に存在するＭｕｓｅ細胞の数を指標として上記脳梗塞の予後等の検査を行う場合には、健常人の血液試料中のＭｕｓｅ細胞の数と比較してもよく、適切なカットオフ値を規定して検査する方法であってもよい。健常人のＭｕｓｅ細胞の数は、予め脳梗塞でないことを臨床的に確認された健常人から血液を採取し、被験者から採取した血液試料と同様の処理及び測定を行って定量することにより得ることができる。ここで、「カットオフ値」とは、一般的には、ある物質に着目して目的とする疾患群と非疾患群とを判定する場合に定める値をいう。目的とする疾患と非疾患とを判定する場合に、カットオフ値以下であれば陰性及びカットオフ値以上であれば陽性として、またはその反対に、カットオフ値以下であれば陽性及びカットオフ値以上であれば陰性として疾患を判定することができる。

後述する実施例２に示されるように、健常人においては血中のＭｕｓｅ細胞の数は、測定により平均３．５±４．３／μｌであることが判明したため、該数値をカットオフ値として用いることができる。図３には、いずれの脳梗塞患者も上記数値よりも高い数値で、患者の血中にはＭｕｓｅ細胞が存在していることが示されている。したがって、このようなカットオフ値を用いることにより、例えば、患者が無症候性脳梗塞であるという診断に応用することができ、また、脳梗塞治療薬の効果を評価することができる。

本発明の検査方法により脳梗塞の診断がなされた被験者は、それぞれの疾患に適した治療法を受けることにより、予後の経過や治療効果が非常に良好となると言える。

４．脳梗塞測定用キット
本発明は、さらに、被験者から採取された血液試料中に存在するＭｕｓｅ細胞の数を測定することができる試薬を含む、上記の検査方法で使用されるキット、脳梗塞の予防若しくは治療効果の評価、又は脳梗塞予防若しくは治療薬のスクリーニング方法を行うためのキットが提供される。キットの内容は、試薬又は測定機器の組み合わせにより構成されるが、後述する各構成要素と本質的に同一であるか、又はその一部と本質的に同一な物質が含まれていれば、構成及び形態が異なっていても、本発明のキットに包含される。試薬としては、例えば、免疫測定法によりＭｕｓｅ細胞の数を測定する場合には、抗ＳＳＥＡ−３抗体を含む。また、必要に応じ、生体試料の希釈液、抗体固定化固相、反応緩衝液、洗浄液、標識された二次抗体、標識体の検出用試薬、標準物質なども含まれる。生体試料の希釈液としては、ＥＤＴＡ溶液、界面活性剤、緩衝剤などにＢＳＡやカゼインなどのタンパク質を含む水溶液などが挙げられる。

反応緩衝液は、例えば、Ｍｕｓｅ細胞の表面抗原とそれに対する一次抗体が結合反応をする際の溶媒環境を提供するものであればいかなるものでもよい。標識された二次抗体は、上記一次抗体に対する抗体であって、ＦＩＴＣ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ウシ小腸アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどが標識された抗体が用いられる。

５．脳梗塞の治療効果を確認する方法
本発明の別の態様は、脳梗塞の治療薬が投与された被験者から採取された血液試料中のＭｕｓｅ細胞の数を測定する工程を含む、該被験者における脳梗塞の治療効果を確認する方法である。脳梗塞の治療薬とは、脳梗塞を治療し得る薬として用いられているものであればいずれのものでもよいが、例えば、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲンアクチベーターなどの血栓溶解剤、へパリンなどの抗凝固剤、サイクロオキシゲナーゼ阻害薬、フォスフォリジエステラーゼ阻害薬、スロンボキセンＡ２（ＴＡＸ２）合成阻害薬などの抗血小板剤、フリーラジカルスカベンジャーなどの脳保護薬等が挙げられる。

脳梗塞の治療薬が投与された被験者から採取された血液試料におけるＭｕｓｅ細胞の数が、投与前の量に比べて増加又は減少するか、あるいは、脳梗塞を発症していない対照の被験者（例えば、健常人）におけるＭｕｓｅ細胞の数に近づいた場合、治療効果があったと判定することができる。

６．脳梗塞予防もしくは治療薬のスクリーニング方法
本発明のさらに別の態様は、被験者と脳梗塞の治療薬の候補化合物を接触させた後、該被験者の血液試料中のＭｕｓｅ細胞の数を測定する工程を含む、脳梗塞の治療薬のスクリーニング方法である。このスクリーニング方法における被験者とは、血液試料におけるＭｕｓｅ細胞の数が、脳梗塞状態と同様の異常を示す非ヒト動物個体であり得る。脳梗塞の症状を有する動物としては、例えば、外科的手法等で脳梗塞状態を形成させた脳梗塞モデル非ヒト動物（ＹｕｊｉＫｕｇｅ，ＫａｚｕｏＭｉｎｅｍａｔｓｕｅｔａｌ．ＮｙｌｏｎＭｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔｆｏｒＩｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌＭｉｄｄｌｅＣｅｒｅｂｒａｌＡｒｔｅｒｙＯｃｃｌｕｓｉｏｎｉｎＲａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ，２６，１６５５（１９９５））などが挙げられる。血液試料中のＭｕｓｅ細胞の数をもとに、脳梗塞状態の非ヒト動物個体（例えば、マウスやラット）でヒトにおけるある病型に類似した病態を構築できれば、ある病型の脳梗塞患者における治療薬を開発するための実験系を確立することができる。また、非ヒト動物個体の予後をＭｕｓｅ細胞の数をモニタリングすることにより、ヒトの脳梗塞の予後に有効な治療薬を開発することが可能となる。

これらの被験者に接触させる脳梗塞の治療薬候補化合物（以下、「候補化合物」と称することがある。）としては、例えば、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、低分子合成化合物などが挙げられ、これらの化合物は新規な化合物であってもよく、又は公知の化合物であってもよい。候補化合物と接触させた被験者におけるＭｕｓｅ細胞の数が、接触前の数に比べて増加又は減少するか、あるいは、対照の被験者におけるＭｕｓｅ細胞の数に近づいた場合、該候補化合物は、脳梗塞に対して治療効果を有すると判定することができる。

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

材料及び方法
（１）被験者
本研究には、発症後、２４時間以内にテント上領域の虚血性脳梗塞を理由に病院に入院した２９人の成人患者が含まれた。ラクナ梗塞の患者は除外された。男性１６名、女性１３名であった。平均年齢は７１．４±１３．３歳であり、４１歳から９３歳であった。本研究は、富山大学病院及び済生会富山病院の倫理審査委員会により承認され、各参加者からインフォームドコンセントを得た。

本発明者らは、年齢、性別、入院時のＮＩＨＳＳ、過去の病歴、喫煙、アルコール摂取、虚血性脳梗塞のサブタイプ、脳梗塞の位置と大きさ、発症後１ヶ月でのモディファイド・ランキン・スコアを含む臨床データを各患者において収集した。過去の病歴には、虚血性及び出血性脳卒中、高血圧、真性糖尿病及び高脂血症が含まれる。高血圧は、１４０／９０ｍｍＨｇより高い血圧又は降圧剤が現在使用されるものとして定義された。真性糖尿病は、６．５％より高いヘモグロビンＡ１Ｃ値又は現在の抗糖尿病薬の使用として定義された。１４０ｍｇ／ｄｌより高い血清低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールレベル又は脂質低下剤の現在の使用を有する患者は、高脂血症とみなされた。現在の喫煙は、入院前の３ヶ月以内に毎日を基準にした任意のタバコ喫煙と定義された。現在のアルコール摂取量は、３ヶ月以内に週あたり１５０ｇ超のアルコール消費量と定義された。

（２）生理学的及び実験的データ
入院時には、すべての患者において、血圧、ＥＣＧ、及び実験データが記録された。これらの試験は、発症の７日後及び３０日後に繰り返された。

（３）放射線検査
入院時に、１．５テスラのＭＲ装置を用いて、拡散強調画像、Ｔ２強調画像、及び流体減衰反転回復（ＦＬＡＩＲ）画像、並びにＭＲ血管造影がすべての患者において得られた。脳梗塞の大きさを小、中、及び大の３グループに分けられた。脳梗塞の大きさは、２つを超える皮質枝の領域に病変が位置する場合に大、病変が１つの皮質枝の領域に位置する場合に中、及び病変がより小さくなる場合に小として等級分けした（図１）。

（４）循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の定量
循環ＳＳＥＡ−３⁺細胞を定量するために、入院時及び７日目と３０日目にすべての患者から末梢血を全３ｍｌ得た。血液をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有チューブ中で保存した。単核細胞を単離するために、血液を等容量の生理食塩水で希釈し、２ｍｌのＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−ＳｈｉｅｌｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＬｔｄ．、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）上に重層し、室温で１５分間、８００ｇで遠心分離した。次に、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）技術を用いて、単核細胞におけるＳＳＥＡ−３陽性細胞の割合を決定した。簡潔には、単離された単核細胞（約１×１０⁶）を０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭＥＤＴＡ（ＦＡＣＳ緩衝液）を含有する１００μｌの氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。ＳＳＥＡ−３（１：５０希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ４３０３）に対する一次抗体を添加し、穏やかに揺動しながら４℃で６０分間インキュベートした。一次抗体結合後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１：１００のＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＭ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＰＡ）を含有する１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、穏やかな揺動しながら４℃の暗所にて６０分間インキュベートした。二次抗体結合後、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、１ｍｌの氷冷ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、細胞ストレーナーチューブ（Ｎｏ．３５２２３５、ＢＤＦａｌｃｏｎ）に通し、すぐにＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。すべてのＦＡＣＳ分析において、非特異的結合及び／又は自家蛍光の可能性を排除するために、細胞の対照試料（二次抗体のみに曝露された）を使用した。ＢＤＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＦＩＴＣ陽性細胞の数をカウントした。ＳＳＥＡ−３⁺細胞の絶対数は、以下の式に従って計算された：
ＦＡＣＳ上のＳＳＥＡ−３⁺細胞数（／μｌ）＝（全ＷＢＣの数−ＰＭＮの数）（／μｌ）×ＳＳＥＡ−３⁺細胞（％）（式中、ＰＭＮは多形核細胞を表す）

本研究では、心血管障害の既往歴がない健常人５名のＳＳＥＡ−３⁺細胞の対照値を決定するために、末梢血を得た。男性２名、女性３名であり、平均年齢５６．２±４．２歳であった。本研究では、ＳＳＥＡ−３⁺細胞の絶対数は、７日目又は３０日目で入院時の対照の２倍以上に増加したときは増えたと判断され、７日目又は３０日目で入院時の対照の半減未満に減少したときは減少したと判定された。

（５）組織学的分析
ヒト骨髄におけるＳＳＥＡ−３⁺細胞の割合及び分布を明らかにするために、脳血管疾患の既往のない８人の剖検患者から検体を得た。男性は５人、女性は３人であった。平均年齢は６３．９±９．０歳であり、５７歳から７３歳までの範囲であった。彼らは、心筋梗塞、悪性腫瘍、心不全などの様々な疾患のために死亡した。検体を緩衝化されたホルマリン（４％）中で固定し、パラフィンに包埋した。その後、厚さ４μｍの切片を次の染色のために調製した。脱パラフィン化された切片を圧力ポットで２分間、抗原回収することによって処理した。免疫組織化学を用いて、ヒト骨髄中のＳＳＥＡ−３⁺細胞を同定した。簡単には、各切片を４℃で一晩、ＳＳＥＡ−３に対する一次抗体（ラットモノクローナル、１：１００希釈、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ４３０３）で処理し、次に、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）ＳｆｆｉｎｉＰｕｒｅ（ヤギ抗ラットＩｇＭ、１：５０希釈、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに、室温にて１時間インキュベートした。最後に、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇＧｏｌｄＡｎｔｉｆａｄｅ試薬を用いて室温で２４時間、切片を染色した。骨髄細胞全体のＳＳＥＡ−３⁺細胞の割合を２０×の倍率で顕微鏡（ＢＺ９０００、ＫｅｙｅｎｃｅＣｏ．、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）下で無作為に５視野において計算した。

（６）統計分析
データを平均±ＳＤとして表した。χ²検定を用いて分類変数を比較した。連続変数は、２つのグループ間の両側不対ｔ検定及び３つのグループ間の１因子ＡＮＯＶＡを用いて比較された。Ｐ値が０．０５未満では、差異は統計的に有意であるとみなされた。

複数の線形回帰分析を行って、入院時の循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の数を予測する重要な因子を同定した。さらに、多変量ロジスティック回帰分析を行って、虚血性脳梗塞の発症後、７日目又は３０日目に循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の増加を決定するための独立した因子を同定した。単変量解析で得られたＰ＜０．４０を用いて、前進段階的モデルの作成手法をパラメーターについて実施した。最終多変量解析では、統計的有意水準をＰ＜０．０５に設定した。結果は、調整されたオッズ比（ＯＲ）及び対応する９５％信頼区間（ＣＩ）として表した。

実施例１：臨床的特徴
入院時の平均ＮＩＨＳＳは８．６±７．４であり、０〜２４の範囲であった。臨床診断には、１７人の心臓塞栓症、７人のアテローム血栓性脳卒中、３人の大動脈塞栓症、及び２人の他の患者が含まれた。過去の病歴には、１６人において高血圧症、３人において糖尿病、４人において高脂血症、７人において喫煙、及び１０人においてアルコール摂取であった。

３０日目の平均ｍＲＳは２．３±２．２であり、０〜６の範囲であった。発症後、８〜３０日の間に２人の患者（６．９％）が死亡し、入院時及び７日目のみのデータを本研究において分析した。脳梗塞の大きさは、１３人の患者において小、１０人において中、及び６人おいて大に分けられた。

実施例２：循環するＳＳＥＡ−３ ⁺ 細胞
図２は、対照及び虚血性脳梗塞を有する患者におけるＦＡＣＳ分析の代表的な結果を示す。健常対照において、ＳＳＥＡ−３⁺細胞の数は、０〜１０μｌの範囲で非常に少なかった。平均値は３．５±４．３／μｌであった。一方、入院時のＳＳＥＡ−３⁺細胞のベースライン数は、患者間で大きく異なっていた。ＳＳＥＡ−３⁺細胞の平均数は、８１．９±７８．０／μｌであり、４．７〜２４９．１／μｌの範囲であった。したがって、２９人の被験者のうち２２人（７５．９％）において、虚血性脳梗塞が発症してから２４時間以内にＳＳＥＡ−３⁺細胞の数が顕著に増加した。単変量解析では、入院時のＳＳＥＡ−３⁺細胞の数と、年齢、性別、入院時のＮＩＨＳＳ、過去の履歴、虚血性脳梗塞のサブタイプ、脳梗塞のサイズ、及び３０日目のｍＲＳの間に有意な関係がないことを検出した。多重線形回帰分析はまた、入院時に循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の絶対数を予測する重要な因子を同定しなかった。

循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の数を、発症後、３０日以内に連続的に評価した。それらの数は、７日目及び３０日目に、それぞれ８１．９±７８．０／μｌから８６．９±８０．８／μｌ及び６８．７±６４．９／μｌに変化した。３つの時点間に有意差はなかった。図３は、循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の数の時間的プロファイルを示す。動態は３つのパターンに分けることができた；２９人の患者のうち８人（２７．６％）において、循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の数は、７日目に有意に減少した。それらの数は、８人の患者のうち７人において３０日目に回復しなかった。２９人の患者のうち１３人（４４．８％）では、発症後、３０日以内にその数は有意に変化せず、対照より高いレベルを維持した。しかしながら、２９人の患者の他の８人（２７．６％）では、循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の数は、７日目及び／又は３０日目に有意に増加し続けた。表１に示されるように、単変量解析では、虚血性脳梗塞の発症後、３０日間に循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の持続的な増加を予測するための重要な因子が同定されなかった。しかしながら、多変量ロジスティック回帰分析により、発症後３０日以内に、虚血性脳梗塞患者における循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の継続的な増加に、現在の喫煙及びアルコール摂取が有意に影響することが示された。オッズ比は、現在の喫煙では０．００２７（Ｐ＝０．０３３６、９５％ＣＩ＝０−０．６３３）、アルコール摂取では１，６８８（Ｐ＝０．０２２０、９５％ＣＩ＝２．９１−９７８，０４６）であった。

虚血性脳梗塞後の循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の増加に対する独立した予測因子。
ＯＲ：オッズ比、ＣＩ：信頼区間。

実施例３：ヒト骨髄におけるＳＳＥＡ−３ ⁺ 細胞の分布
骨髄細胞の小画分はＳＳＥＡ−３に対して陽性であった。図４に示されるように、ＳＳＥＡ−３⁺細胞の分布は均一ではなかった。それらはクラスターのように分布していた。ＳＳＥＡ−３＋細胞の割合は、０％から０．５％まで変化し、平均値は０．２±０．１７％であった。図５に示されるように、ＳＳＥＡ−３⁺細胞の割合は、悪性腫瘍のために化学療法を処置された３人の患者において０．１％未満であった。これらの３人の患者を除くと、統計学的に有意ではないが、患者の年齢と骨髄中のＳＳＥＡ−３⁺細胞の割合との間に負の相関が生じる傾向にあった。

考察
この研究では、ＳＳＥＡ−３に対する一次抗体を用いて骨髄の検体を染色した。これは、以前の研究では、骨髄におけるＭｕｓｅ細胞の局在を示していないためである。結果として、この研究は、ＳＳＥＡ−３⁺細胞が骨髄細胞全体の約０．２％に相当することを示している。以前の研究によれば、Ｍｕｓｅ細胞は、ヒト骨髄の吸引液中に０．０３％の割合で同定され、ＭＳＣでは５〜６％の割合で同定される［５］。それらの集団は、年齢とともに徐々に減少する傾向があるが、おそらく試料のサイズが小さいために統計的有意性が得られない。興味深いことに、化学療法と放射線照射が、幹細胞／前駆細胞及びＭＳＣを含む骨髄細胞の長期的な損傷を引き起こす可能性があるため、悪性腫瘍に対する化学療法で処置された患者では、Ｍｕｓｅ細胞の集団は非常に小さかった［８］。したがって、化学療法後に、ＳＳＥＡ−３⁺細胞でさえ不可逆的又は持続的な損傷を被る場合がある。

現在、骨髄中の幹細胞／前駆細胞は、虚血性脳梗塞を含む様々な疾患において末梢血に迅速に動員されることがよく知られている［２］。早期前駆マーカーを発現する非造血幹細胞は、急性心筋梗塞［９，１０］及び虚血性脳梗塞［１１］後に、骨髄から末梢血に動員される。最近、Ｙｕら（２０１３）は、急性心筋梗塞の患者から０日目、１日目及び７日目に末梢血単核細胞を単離し、胚性幹細胞マーカーのｍＲＮＡ発現を測定した。彼らは、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、ＣＤ３１、及びＶＥ−カドヘリンのｍＲＮＡレベルが０日目及び１日目に末梢血において有意に高かったと報告している［１２］。さらに、虚血性脳梗塞の患者でも同様の現象が観察されている［１３、１４］。現在の知見は、これらの以前のデータを模倣している。したがって、循環するＳＳＥＡ−３⁺細胞の数は、２９人の虚血性脳梗塞患者のうち２２人において、対照よりも入院時に非常に多かった。

この研究では、虚血性脳梗塞の患者の間で、入院時のＳＳＥＡ−３⁺細胞のベースライン数が大きく異なっていた。臨床パラメーターは、ＳＳＥＡ−３⁺細胞のベースライン数を予測しなかった。３０日以内の動態も患者によって大きく異なる。結果は以前の研究とよく相関している。したがって、Ｄｕｎａｃら（２００７）は、２５人の虚血性脳梗塞の患者におけるＣＤ３４陽性細胞の動員を評価し、患者ごとに、及び１人の患者について１日ごとに細胞数に大きな変動があることを見出した［１５］。しかしながら、本研究は、２９人の患者のうち８人（２７．６％）が、虚血性脳梗塞を発症後、３０日間に末梢血中にＳＳＥＡ−３⁺細胞を着実かつ連続的に動員したことを示した（図２）。これに対して、以前の研究では、内皮前駆細胞を含む幹細胞／前駆細胞の動員は、発症後の２４〜４８時間でピークに達し、急性心筋梗塞の患者における対照レベルに戻ることが示されている［１６］。Ｔａｇｕｃｈｉら（２００４）はまた、ＣＤ３４陽性細胞が７日間持続して増加し、その後、３０日目にベースラインレベルまで減少することを報告している［１３］。したがって、幹細胞／前駆細胞の動員の時間的プロファイルは、患者の状態及び動員された細胞のタイプに大きく依存し得る。

以前の研究は、内皮前駆細胞の動員が、加齢及び真性糖尿病を含む様々な要因によって制御されることを示した。反対の結果も報告されているが、それらのすべての要因が動員を阻害すると考えられている［１７、１８］。しかしながら、この研究では、これらの要因のいずれも、ＳＳＥＡ−３⁺細胞の時間的プロファイルに関連しなかった。代わりに、本研究は、喫煙及びアルコール摂取が、虚血性脳梗塞後のＳＳＥＡ−３⁺細胞動員の動態に大きく影響することを明確に示している。したがって、喫煙は、７日目及び／又は３０日目にＳＳＥＡ−３⁺細胞の数の増加を有意に妨げ、アルコール摂取は有意に促進する。実際に、多数の以前の研究は、喫煙及びアルコールによる幹細胞／前駆細胞の生物学的特徴に及ぼす影響を強く示唆している。Ｌｕｄｗｉｇら（２０１０）は、循環するＣＤ３４陽性細胞の数は、非喫煙者よりも喫煙者において有意に低いことを報告している［１９］。Ｌａｍｉｒａｕｌｔら（２０１３）もまた、能動喫煙と骨髄及び血液中の低ＣＤ３４陽性細胞との間の関連を報告している［２０］。幹細胞／前駆細胞に対する喫煙の有害な影響には、細胞及びそれらの制御機構に対する直接的な影響、並びにそれらの微小環境の変化が含まれる。幹細胞／前駆細胞の煙成分への曝露は、組織リザーバーにおけるそれらの細胞の数と質の低下をもたらす可能性がある［２１］。作用機序を説明するためのいくつかの仮説がある。これらのうち、喫煙に関連した活性酸素種（ＲＯＳ）の産生は、一酸化窒素（ＮＯ）の生物学的利用能を低下させ、骨髄からの動員を減少させる可能性がある［２２］。アルコール乱用もまたヒトの健康に悪影響を及ぼす。しかしながら、疫学的研究は、エタノールの適度な消費が、冠状動脈性心疾患、突然の心臓死、及び虚血性脳梗塞のリスクを低下させることを示している。実際に、中程度の量のエタノールは培養細胞において血管新生を増強する［２３］。さらに、Ｃｈｉｖａ−Ｂｌａｎｃｈら（２０１４）は、ビールの非アルコール分画が、心血管リスクの高い患者の循環する内皮細胞の数を増加させると報告している［２４］。赤ワインの中程度の摂取もまた、糖尿病マウスにおいて細胞の動員を向上させる［２５］。したがって、アルコールに含まれるいくつかの成分は、幹細胞／前駆細胞の動員並びにエタノール自体に寄与し得る。

本研究では、循環するＭｕｓｅ細胞の連続的な増加は、より良好な機能的転帰に直接関連していなかった。しかしながら、最近の観察によると、末梢血中の幹細胞／前駆細胞の動態は、虚血性脳病変で起こる過程において重要な役割を果たす可能性がある［１４］。したがって、Ｄｕｎａｃら（２００７）は、循環するＣＤ３４陽性細胞を測定し、それらの動員の程度は虚血性脳梗塞後に機能回復に直接関係していると結論づけた［１５］。Ｇｏｊｓｋａ−Ｇｒｙｍａｊｉｏら（２０１２）はまた、ＣＤ３４陽性及びＣＤ３４／ＣＸＣＲ４陽性細胞の動員の増加は、より良好な機能的転帰に関係していると報告している［１４］。したがって、これらの「高応答者」患者は、虚血性脳梗塞後の良好な機能的転帰によって特徴付けることができるが、これらの動員された細胞は、梗塞病変に向かって移動し、ヒトにおいて損傷した脳を再生することを証明する必要がある。より幅広い研究により、ＳＳＥＡ−３⁺細胞の動員が、虚血性脳梗塞後の機能回復に寄与し得るかどうかを明らかにされるであろう。

結論
本研究は、虚血性脳梗塞の急性期に、多能性のＭｕｓｅ細胞が骨髄から末梢血に動員されていることを明確に示している。喫煙及びアルコール摂取は、Ｍｕｓｅ細胞の時間的プロファイルに有意に影響を及ぼす。この研究では、ＳＳＥＡ−３⁺細胞のベースライン数及び動態は、おそらく末梢血中の量が少ないため、機能的転帰と関連していない。しかしながら、内因性のＭｕｓｅ細胞を増加させる治療的介入、又はＭｕｓｅ細胞の外因的投与は、虚血性脳梗塞後の機能的転帰を改善するための新規な治療戦略となる。

上述された全ての参考文献、及び対応する出願の全開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

参考文献
[1] Strong K, Mathers C, Bonita R. Preventing stroke: saving lives around the world. Lancet Neurol. 2007;6:182-7.
[2] Borlongan CV, Glover LE, Tajiri N, Kaneko Y, Freeman TB. The great migration of bone marrow-derived stem cells toward the ischemic brain: therapeutic implications for stroke and other neurological disorders. Progress in neurobiology. 2011;95:213-28.
[3] Kuroda S. Bone marrow stromal cell transplantation for Ischemic Stroke -- its multi-functional feature. Acta Neurobiol Exp (Wars). 2013;73:57-65.
[4] Kuroda Y, Kitada M, Wakao S, Nishikawa K, Tanimura Y, Makinoshima H, et al. Unique multipotent cells in adult human mesenchymal cell populations. Proc Natl Acad Sci USA. 2010;107:8639-43.
[5] Wakao S, Kitada M, Kuroda Y, Shigemoto T, Matsuse D, Akashi H, et al. Multilineage-differentiating stress-enduring (Muse) cells are a primary source of induced pluripotent stem cells in human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108:9875-80.
[6] Yamauchi T, Kuroda Y, Morita T, Shichinohe H, Houkin K, Dezawa M, et al. Therapeutic effects of human multilineage-differentiating stress enduring (MUSE) cell transplantation into infarct brain of mice. PLoS One. in press.
[7] Ogura F, Wakao S, Kuroda Y, Tsuchiyama K, Bagheri M, Heneidi S, et al. Human adipose tissue possesses a unique population of pluripotent stem cells with nontumorigenic and low telomerase activities: potential implications in regenerative medicine. Stem Cells Dev. 2014;23:717-28.
[8] Kemp K, Morse R, Wexler S, Cox C, Mallam E, Hows J, et al. Chemotherapy-induced mesenchymal stem cell damage in patients with hematological malignancy. Annals of hematology. 2010;89:701-13.
[9] Kucia M, Dawn B, Hunt G, Guo Y, Wysoczynski M, Majka M, et al. Cells expressing early cardiac markers reside in the bone marrow and are mobilized into the peripheral blood after myocardial infarction. Circ Res. 2004;95:1191-9.
[10] Wojakowski W, Tendera M, Michalowska A, Majka M, Kucia M, Maslankiewicz K, et al. Mobilization of CD34/CXCR4+, CD34/CD117+, c-met+ stem cells, and mononuclear cells expressing early cardiac, muscle, and endothelial markers into peripheral blood in patients with acute myocardial infarction. Circulation. 2004;110:3213-20.
[11] Paczkowska E, Kucia M, Koziarska D, Halasa M, Safranow K, Masiuk M, et al. Clinical evidence that very small embryonic-like stem cells are mobilized into peripheral blood in patients after stroke. Stroke. 2009;40:1237-44.
[12] Yu CW, Choi SC, Hong SJ, Choi JH, Park CY, Kim JH, et al. Cardiovascular event rates in patients with ST-elevation myocardial infarction were lower with early increases in mobilization of Oct4(high)Nanog(high) stem cells into the peripheral circulation during a 4-year follow-up. International journal of cardiology. 2013;168:2533-9.
[13] Taguchi A, Matsuyama T, Moriwaki H, Hayashi T, Hayashida K, Nagatsuka K, et al. Circulating CD34-positive cells provide an index of cerebrovascular function. Circulation. 2004;109:2972-5.
[14] Gojska-Grymajlo A, Nyka WM, Zielinski M, Jakubowski Z. CD34/CXCR4 stem cell dynamics in acute stroke patients. Folia neuropathologica / Association of Polish Neuropathologists and Medical Research Centre, Polish Academy of Sciences. 2012;50:140-6.
[15] Dunac A, Frelin C, Popolo-Blondeau M, Chatel M, Mahagne MH, Philip PJ. Neurological and functional recovery in human stroke are associated with peripheral blood CD34+ cell mobilization. Journal of neurology. 2007;254:327-32.
[16] Adams V, Lenk K, Linke A, Lenz D, Erbs S, Sandri M, et al. Increase of circulating endothelial progenitor cells in patients with coronary artery disease after exercise-induced ischemia. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2004;24:684-90.
[17] Vasa M, Fichtlscherer S, Aicher A, Adler K, Urbich C, Martin H, et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ Res. 2001;89:E1-7.
[18] Liu Z, Ding X, Fang F, Wang R, Chen Y, Ma Y, et al. Higher numbers of circulating endothelial progenitor cells in stroke patients with intracranial arterial stenosis. BMC neurology. 2013;13:161.
[19] Ludwig A, Jochmann N, Kertesz A, Kuhn C, Mueller S, Gericke C, et al. Smoking decreases the level of circulating CD34+ progenitor cells in young healthy women--a pilot study. BMC women's health. 2010;10:20.
[20] Lamirault G, Susen S, Forest V, Hemont C, Parini A, Le Corvoisier P, et al. Difference in mobilization of progenitor cells after myocardial infarction in smoking versus non-smoking patients: insights from the BONAMI trial. Stem cell research & therapy. 2013;4:152.
[21] Jedrzejas M, Skowron K, Czekaj P. Stem cell niches exposed to tobacco smoke.
Przeglad lekarski. 2012;69:1063-73.
[22] Aicher A, Heeschen C, Mildner-Rihm C, Urbich C, Ihling C, Technau-Ihling K, et al. Essential role of endothelial nitric oxide synthase for mobilization of stem and progenitor cells. Nat Med. 2003;9:1370-6.
[23] Gu JW, Elam J, Sartin A, Li W, Roach R, Adair TH. Moderate levels of ethanol induce expression of vascular endothelial growth factor and stimulate angiogenesis. American journal of physiology Regulatory, integrative and comparative physiology. 2001;281:R365-72.
[24] Chiva-Blanch G, Condines X, Magraner E, Roth I, Valderas-Martinez P, Arranz S, et al. The non-alcoholic fraction of beer increases stromal cell derived factor 1 and the number of circulating endothelial progenitor cells in high cardiovascular risk subjects: a randomized clinical trial. Atherosclerosis. 2014;233:518-24.
[25] Huang PH, Tsai HY, Wang CH, Chen YH, Chen JS, Lin FY, et al. Moderate intake of red wine improves ischemia-induced neovascularization in diabetic mice--roles of endothelial progenitor cells and nitric oxide. Atherosclerosis. 2010;212:426-35.

Claims

被験者から採取された血液試料中に存在するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞の数を測定する工程を含む、多能性幹細胞の数を指標とした、被験者における脳梗塞の予後、一過性虚血発作後の脳梗塞リスク若しくは無症候性脳梗塞を予測又は診断するための検査方法。
被験者から採取された血液試料が、脳梗塞様症状の発症直後から６０日までの期間に採取されたものである、請求項１に記載の検査方法。
多能性幹細胞が、虚血性脳梗塞の急性期において骨髄から末梢血に動員されたものである、請求項１又は２に記載の検査方法。
脳梗塞の予後と被験者の喫煙及び／又は飲酒の有無とを関連付けることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の検査方法。
カットオフ値と比較する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検査方法。
被験者から採取された血液試料中に存在するＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞の数を測定することができる試薬を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の検査方法に使用するためのキット。
被験者と脳梗塞の治療薬の候補化合物を接触させた後、該被験者由来の血液試料中のＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞の数を測定する工程を含む、脳梗塞の治療薬をスクリーニングする方法。
カットオフ値と比較する工程をさらに含む、請求項７に記載のスクリーニング方法。