CN108588260A - 桂郁金pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 - Google Patents

桂郁金pcr鉴定试剂盒及鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种桂郁金PCR鉴定试剂盒及鉴定方法，所述试剂盒中的特异性引物为GYJ1和GYJ2：GYJ1：5’‑CTTCAACAACAGCACGACAA‑‑3'，GYJ2：5’‑GGTTAAGCAATCTCTTCGGA‑3’；本发明提供了一种快速、准确鉴定桂郁金的方法，可以广泛应用于桂郁金中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。

Description

桂郁金PCR鉴定试剂盒及鉴定方法
(一)技术领域
本发明涉及一种DNA分子鉴定方法，特别涉及中药桂郁金PCR鉴定试剂盒、特异性引物、模板及鉴定方法。
(二)背景技术
桂郁金为广西莪术(Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang)的干燥块茎，道地产地为广西的横县和贵县等。郁金的其他品种还包括温郁金、黄丝郁金、桂郁金。郁金是一种传统中药，具有活血祛瘀的功效，用于治疗经闭痛经、胸腹胀痛、黄胆尿赤、癫痫发狂等疾病。近代研究表明郁金可以调节免疫功能、抗炎、抑制中枢神经、改善血液流动性等作用，亦可用于治疗癌症、胃炎、心脑血管疾病。不同的郁金品种，其有效成分和药效差别较大。由于郁金品种较多，来源多样，外观形态类似，单靠外形和传统中药检测方法较难区别，急需建立一种新型的鉴定方法。
本发明提供的PCR检测法是一种桂郁金的DNA分子鉴定方法，能够准确鉴定桂郁金。利用PCR检测法对桂郁金进行鉴定尚未见报道。该方法的建立对实现中药现代化，规范管理郁金的种植，采摘和销售，具有重要意义。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种能够准确鉴定中药桂郁金的PCR鉴定试剂盒和检测方法，包括PCR检测法关键试剂PCR引物、模板和PCR检测法的检测步骤。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种桂郁金PCR鉴定试剂盒，所述试剂盒中的特异性引物为GYJ1和GYJ2：
GYJ1:5’-CTTCAACAACAGCACGACAA-3’
GYJ2:5’-GCTCAACAAACCCAAATACG-3’。
进一步，所述的桂郁金PCR鉴定试剂盒的组成为：
本发明还涉及一种利用所述桂郁金PCR鉴定试剂盒对桂郁金进行鉴定的方法，所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量(检测方法同步骤(3))，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用桂郁金PCR鉴定试剂盒中的特异性引物GYJ1和GYJ2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性5min，94℃变性45s，50～58℃复性45s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物(即扩增反应后的反应液)5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在1049bp处出现扩增条带的为桂郁金，在1049bp处不出现扩增条带的不是桂郁金。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明根据凝胶电泳在1049bp处有无扩增条带作为鉴定桂郁金的依据，可以检测单个或者混合桂郁金DNA样品，检测准确、灵敏度高、操作简单、耗时短、重复性好；(2)利用桂郁金PCR鉴定试剂盒中引物GYJ1和GYJ2以及PCR反应溶液配方可以制造桂郁金鉴定试剂盒；(3)本发明提供了一种快速、准确鉴定桂郁金的方法，可以广泛应用于桂郁金中药选种育种、种植、采收储存、销售、临床应用各环节的品种鉴定，在鉴别中药真伪，打击伪品，加强中药质量监管，促进中药现代化发展方面具有重大意义。
(四)附图说明
图1为11种供试品经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道1～11分别为温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术，泳道M为marker。
图2为不同浓度的桂郁金经PCR检测法鉴定后的电泳图，泳道M为Marker，泳道1的桂郁金浓度为2ng/μL，泳道2的桂郁金浓度为4ng/μL，泳道3的桂郁金浓度为8ng/μL，泳道4的桂郁金浓度为20ng/μL。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明实施例所用温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术均按照《中国药典》2010版采集。
实施例1
1、桂郁金PCR检测法关键试剂PCR引物的获得
应用植物DNA快速提取试剂盒从温郁金、黄丝郁金、绿丝郁金和桂郁金中分别提取基因组DNA。使用RAPD扩增法对四种郁金进行RAPD分析，筛选获得一条桂郁金特异性扩增条带，这条特异性扩增条带只出现在桂郁金品种中，在其他郁金品种中没有，此条带中的DNA分子即是桂郁金特异性DNA分子标记。将桂郁金特异性DNA分子标记从琼脂糖凝胶中回收、克隆、测序，测序结果见SEQ ID NO.1所示，命名为GYJ1176。
根据GYJ1176序列，设计一对特异性引物GYJ1和GYJ2，引物序列为：
GYJ1:5’-CTTCAACAACAGCACGACAA-3’
GYJ2:5’-GCTCAACAAACCCAAATACG-3’
上下游引物选取的位点分别对应于GYJ1176序列位点上的5-24bp和1034-1053bp处。
SEQ ID NO.1为：
AAAACTTCAACAACAGCACGACAAAATCGTTTCACACTTTCAATGGCAGTCGATTCTTCTATTTTAATGTACTCATCAGTAGCATTTGCTGTAGACCATACACCGATATTTGAAATACAGCTGTTACTTTTTGTAAGCCAGATAAACCAAGTCTTCCAAGTCCATCTCTTTTCTGTATAAAATAGCTATCATGATTACTAACAACATCATAGATACGCATAAATAAATTCCGCCTCATTTAGAATCTTCTTAGAAATATTGCATCATTATACAAGGCATTTTCAGTGAAATAATCATTGAATAGATTACGATCAGCAGCTTCACGATTATGATTGATCACGTTGTGACCAGGAATTGAGCCTCGATACATGCGTTGGTTGTTTTCTTCGTTGAGATAATTCAAGATGATTTGATTATTGGTAGAAATCACCTGAGAGATCAGTTGTTGCATTGTGTCAAACTACATTGTGGCAAACATTTCTGTATAGTTATCATCATCAGAGCTTGAATATGATAAATTTAATCATTGGTGGTACCCATTTTTTGAGATAATTGAATGAATCAGGTATAGGCTGCGTATGGGGTATAAATTTATAATGTAAGTTATATCTTCACTTTTTCCACATATGACGTGACCTAATAATGAATACATTTCGATAAAAATTATACAGATGACATGACACAACAATGACAATATCGGGACAAGTTTGACAAGCGATGTGACCTGGCACTAAACACATATATTTTTTGTGTTTAGATGACATGACCTAACAATGGACACATTTGAACAAAATTATACAAATGACATGATACAACAATGATAACATCAAGATAAGTTAGGCAGGCGACGTGACATGACACTGAACATACTTTTTTTGTGCAGATGACATGACCTAATAATGAACACATTTGGACAAAATTACACAAATGACATGACACAACAATGACAGCATCAGGCCAAGTTAGGTGATATGTTGCTATTTGACAGGGTCAATTAGGGATTATTCTGGAATATATCGATCACATTTCATGTCGTATTTGGGTTTGTTGAGCTTAATTCTTATTTTGGATGAAATTATGCCTTCATTCTAATTTTTCATGATTTTTTGGATGATTATGGATATTAATTTTGTGATCTTTGATTTTTGTAGGAATTAGAATGAAGATAATGATAAT。
2、桂郁金的PCR检测法
(1)采用常规提取法提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法(同步骤(3))检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)按照GYJ1和GYJ2的序列用体外合成仪合成引物GYJ1和GYJ2。以GYJ1和GYJ2为引物进行PCR扩增。
按照下述配方配置PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：
94℃预变性5min，94℃变性45s，50～58℃复性45s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸10min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增后的反应液5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳(含0.5％溴化乙锭)检测扩增结果，在1049bp处出现扩增条带的样品为桂郁金，在1049bp处不出现条带的样品不是桂郁金。
实施例2：
1、桂郁金PCR检测法的准确性研究
从温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术植物中提取基因组DNA。以上述11份材料基因组DNA为模板，利用特异性引物“GYJ1/GYJ2”进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，只是更换DNA模板，以验证桂郁金PCR检测法的准确性和可靠性，结果见图1所示，泳道1～11分别为温郁金(浙江瑞安)、温郁金(浙江永嘉)、黄丝郁金(四川崇州)、黄丝郁金(四川双流)、绿丝郁金、桂郁金、生姜、海南三七、草果、浙白芍、安白术，泳道M为marker。
图1表明，桂郁金在1049bp处具有特异性的扩增条带，而其他品种没有。本发明的桂郁金PCR检测法经实验证明可以用于桂郁金的鉴定，方法准确性高，简单、效率高、重复性好。
2、桂郁金PCR检测法的灵敏度研究
将桂郁金模板DNA浓度(40ng/μL)经四个梯度进行稀释，配置四份不同浓度的桂郁金基因组DNA溶液：一份浓度为稀释一倍，即20ng/μL；一份浓度稀释为原始浓度的五分之一，即8ng/μL；一份浓度稀释为原始浓度的十分之一，即4ng/μL；一份浓度稀释为原始浓度的二十分之一，即2ng/μL。
分别以这四种不同浓度的桂郁金基因组DNA作为模板(1.0μL)，以“LSY1/LSY2”为引物进行PCR扩增，PCR反应液、扩增程序、检测方法同实施例1，以验证桂郁金PCR检测法的灵敏度，结果见图2所示，泳道M为Marker，泳道1为2ng/μL，泳道2为4ng/μL，泳道3为8ng/μL，泳道4为20ng/μL。
结果显示当桂郁金模板基因组DNA浓度为模板标准浓度的，即含量为时8ng/μL以上时，在1049bp处依然出现桂郁金的特异性条带，经过多次重复验证，结果保持稳定，证明本发明提供的桂郁金PCR检测法灵敏度很高，含量较微弱的桂郁金也能够鉴定出来。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 桂郁金PCR鉴定试剂盒及鉴定方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1176
<212> DNA
<213> 桂郁金(Curcuma rcenyujin )
<400> 1
aaaacttcaa caacagcacg acaaaatcgt ttcacacttt caatggcagt cgattcttct 60
attttaatgt actcatcagt agcatttgct gtagaccata caccgatatt tgaaatacag 120
ctgttacttt ttgtaagcca gataaaccaa gtcttccaag tccatctctt ttctgtataa 180
aatagctatc atgattacta acaacatcat agatacgcat aaataaattc cgcctcattt 240
agaatcttct tagaaatatt gcatcattat acaaggcatt ttcagtgaaa taatcattga 300
atagattacg atcagcagct tcacgattat gattgatcac gttgtgacca ggaattgagc 360
ctcgatacat gcgttggttg ttttcttcgt tgagataatt caagatgatt tgattattgg 420
tagaaatcac ctgagagatc agttgttgca ttgtgtcaaa ctacattgtg gcaaacattt 480
ctgtatagtt atcatcatca gagcttgaat atgataaatt taatcattgg tggtacccat 540
tttttgagat aattgaatga atcaggtata ggctgcgtat ggggtataaa tttataatgt 600
aagttatatc ttcacttttt ccacatatga cgtgacctaa taatgaatac atttcgataa 660
aaattataca gatgacatga cacaacaatg acaatatcgg gacaagtttg acaagcgatg 720
tgacctggca ctaaacacat atattttttg tgtttagatg acatgaccta acaatggaca 780
catttgaaca aaattataca aatgacatga tacaacaatg ataacatcaa gataagttag 840
gcaggcgacg tgacatgaca ctgaacatac tttttttgtg cagatgacat gacctaataa 900
tgaacacatt tggacaaaat tacacaaatg acatgacaca acaatgacag catcaggcca 960
agttaggtga tatgttgcta tttgacaggg tcaattaggg attattctgg aatatatcga 1020
tcacatttca tgtcgtattt gggtttgttg agcttaattc ttattttgga tgaaattatg 1080
ccttcattct aatttttcat gattttttgg atgattatgg atattaattt tgtgatcttt 1140
gatttttgta ggaattagaa tgaagataat gataat 1176
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 2
cttcaacaac agcacgacaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 未知(Unknown)
<400> 3
gctcaacaaa cccaaatacg 20

Claims (3)

1.一种桂郁金PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的特异性引物为GYJ1和GYJ2：
GYJ1:5’-CTTCAACAACAGCACGACAA-3’
GYJ2:5’-GCTCAACAAACCCAAATACG-3’。
2.如权利要求1所述桂郁金PCR鉴定试剂盒，其特征在于所述的桂郁金PCR鉴定试剂盒的组成为：
3.一种利用权利要求1所述桂郁金PCR鉴定试剂盒对桂郁金进行鉴定的方法，其特征在于所述方法为：
(1)模板DNA的提取和质量鉴定：提取供试品DNA作为PCR的模板；以电泳法检测模板DNA的质量，条带清晰无弥散的，即为符合PCR反应的模板DNA；
(2)PCR鉴定：利用桂郁金PCR鉴定试剂盒中的特异性引物GYJ1和GYJ2，进行PCR扩增：
PCR反应溶液：
将PCR反应溶液放入PCR自动扩增仪器中进行PCR扩增反应，反应程序设置为：94℃预变性5min，94℃变性45s，52～56℃复性45s，72℃延伸1min，32个循环，最后72℃延伸7min；
(3)PCR产物进行电泳检测：取出PCR扩增产物5μL与加样缓冲液1μL混合，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，在1049bp处出现扩增条带的为桂郁金。
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