CN108572224A - 一种生物组织中丙二醛含量的测定方法 - Google Patents

一种生物组织中丙二醛含量的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物组织中丙二醛含量的测定方法，包括使用吖啶酮乙酰肼作为荧光标记试剂在三氯乙酸溶液的催化作用下对生物组织提取液和丙二醛标准溶液中的丙二醛进行衍生化，后使用带有荧光检测器的高效液相色谱进行检测分析，以丙二醛标准溶液的进样量为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制丙二醛的标准工作曲线，将待测样品溶液的峰面积带入标准工作曲线得待测样品溶液中丙二醛的量，经核算后得到生物组织中丙二醛的含量。本发明的测定方法灵敏度高，选择性好，样品处理过程简单，可分别测定生物组织样品中游离丙二醛和总丙二醛的含量。

Description

一种生物组织中丙二醛含量的测定方法
技术领域
本发明涉及一种检测方法，尤其涉及一种生物组织中丙二醛的检测方法，属于生物标志物检测领域。
背景技术
丙二醛是生物体内的氧自由基攻击脂质中的不饱和脂肪酸而产生的一种重要代谢产物。丙二醛具有细胞毒性，会引起蛋白质等生命大分子的交联聚合，导致细胞膜的结构和功能发生改变，对细胞造成严重的伤害。近年来在许多疾病的发病机理研究中，发现脂质过氧化作用在多种心血管病、肾脏疾病、癌症、糖尿病等疾病的发生发展过程中起着重要作用，而丙二醛的含量能反应机体内脂质过氧化的程度，从而评价出细胞损伤的程度。因此测定丙二醛的含量可以间接的反映生物器官受损伤的程度，对于研究某些疾病的发展，是一个有重要意义的生物标志物。
目前丙二醛的含量测定方法主要是试剂盒法。这种方法采用硫代巴比妥酸作为衍生试剂对丙二醛进行标记，产物在532nm下有最大吸收波长，用酶标仪测定其含量。由于产物除具有紫外吸收外，还能发射较强荧光，因此也可采用紫外光谱法或荧光光谱法测定丙二醛的含量。这种方法虽然具有快速、简单的特点，但该方法的专属性较差。生物样品中的其它醛类化合物和糖类化合物，也能与硫代巴比妥酸发生反应，这些物质的存在会对丙二醛的测定有严重干扰，而且衍生反应在90～100℃的高温和强酸性条件下进行，能产生较大的副反应，这些因素都会造成测定结果偏大。
为避免干扰，丙二醛的测定也可采用高效液相色谱法，但是生物样品中丙二醛的含量较低，且丙二醛的紫外吸收比较弱，无法被高效液相色谱的紫外检测器检测到。高效液相色谱-荧光检测法可结合高效液相色谱的强大分离能力和荧光检测的高灵敏度的优点，是检测生物样品和食品中低含量丙二醛的可靠的方法。然而，丙二醛不产生荧光，无法被荧光检测器检测到，因此需要采用荧光标记试剂对丙二醛进行柱前荧光标记。
因此，开发一种新的适用于生物组织样品中的丙二醛含量的测定方法十分必要。
发明内容
本发明针对生物组织中丙二醛的现有检测方法所存在的不足，提供一种生物组织中丙二醛含量的测定方法。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种生物组织中丙二醛含量的测定方法，包括如下步骤：
1)生物组织的预处理及丙二醛标准溶液的准备：
将生物组织进行匀浆处理得匀浆液，匀浆液离心分离后取上清液为生物组织提取液，冷藏待用；制备一系列已知丙二醛浓度且具有浓度梯度的丙二醛标准溶液，冷藏待用；
2)生物组织提取液和丙二醛标准溶液的衍生化：
分别向生物组织提取液或丙二醛标准溶液中均加入三氯乙酸溶液和吖啶酮乙酰肼溶液，密封后置于60～100℃环境下反应20～40min,得衍生化的待测样品溶液和丙二醛标准溶液；
3)高效液相色谱检测：
将步骤2)所得的衍生化的待测样品溶液和丙二醛标准溶液经稀释后使用具有荧光检测器的高效液相色谱进样分析；
4)数据分析：
以步骤3)丙二醛标准溶液中丙二醛的进样量为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制丙二醛的标准工作曲线，将待测样品溶液的峰面积带入标准工作曲线得步骤3)稀释后的待测样品溶液中丙二醛的量，该丙二醛的量经换算后得到生物组织中丙二醛的总量，从而计算得到生物组织中丙二醛的含量。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述三氯乙酸溶液为1.0mol/L的三氯乙酸水溶液，所述吖啶酮乙酰肼溶液为吖啶酮乙酰肼溶于乙腈中所得的浓度为5×10-4mol/L的溶液。
进一步，步骤2)中生物组织提取液和丙二醛标准溶液衍生化的具体操作步骤为：将100μL生物组织提取液或丙二醛标准溶液、100～140μL浓度为1.0mol/L的三氯乙酸水溶液和250～300μL吖啶酮乙酰肼溶液依次加入到2mL的安瓿瓶中，密封后置于60～100℃环境下反应20～40min，得到待测样品溶液和衍生化的丙二醛标准溶液。
进一步，步骤3)中高效液相色谱的色谱条件为：反相硅胶键合相色谱柱，流动相由A相和B相组成，A相为含5vol％甲醇的水，B相为乙腈，采用梯度洗脱，流动相流速为1.0mL/min，柱温25～40℃，激发波长259nm，发射波长406nm。
进一步，流动相中B相的体积百分比为20～100％。
进一步，步骤1)中还包括对所得生物组织提取液除蛋白的步骤，具体操作过程为：向生物组织提取液中加入甲醇或乙腈，甲醇或乙腈与提取液的体积比为(2～5):1；后离心，取上清液用于下一步骤。
进一步，所述丙二醛标准溶液的制备方法如下：量取1,1,3,3-四甲氧基丙烷置于容量瓶中，向其中加入稀硫酸后稀释至刻度，室温下放置90～180min,得已知浓度的丙二醛标准贮备液，将丙二醛标准贮备液稀释不同倍数后即得一系列丙二醛浓度不同的丙二醛标准溶液。
进一步，丙二醛标准溶液的浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10μmol/L。
本发明提供的测定方法的有益效果是：
1)本发明的测定方法中使用新型的含酰肼基的荧光试剂，该荧光试剂在紫外光的照射下能够发出强烈的荧光，并且可与丙二醛在较温和的条件下快速发生反应生成丙二醛的荧光衍生物；
2)本发明的测定方法灵敏度高，选择性好，样品处理过程简单，可分别测定生物组织样品中游离丙二醛和总丙二醛的含量。
附图说明
图1为实施例1浓度为0.5μmol/L的丙二醛标准溶液的高效液相色谱图；
图2为实施例1丙二醛的标准曲线。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
本发明实施例中所使用的丙二醛标准溶液是通过如下方法制备而成的：
1)准确量取240μL1,1,3,3-四甲氧基丙烷于100mL具塞容量瓶内，用1wt％H2SO4稀释至刻度，室温放置120min后，得浓度为0.01mol/L的丙二醛标准贮备液；
2)将丙二醛标准储备液分别用水稀释得到浓度为0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10μmol/L的丙二醛标准溶液。
本发明实施例中所使用的吖啶酮乙酰肼的制备方法如下：
1)在250mL烧瓶中分别加入无水乙醇100mL、吖啶酮乙酸6g，最后加入浓硫酸5mL，以上混合物在电磁搅拌下加热回流5h，反应完成后，冷却至室温，把反应混合物到入到400mL冰水中，用氨水调节pH至中性，得黄色沉淀，抽滤，沉淀用水洗涤3次后晾干，得到产物A，产率85.6％；
2)在100mL烧瓶中分别加入无水乙醇30mL，产物A 2g，电磁搅拌下加热至产物A完全溶解，后加入水合肼(85％)10mL，加热回流3h，反应结束后，混合物到入到200mL冰水中，沉淀过滤，用水洗涤3次，晾干后，用甲醇重结晶得黄色晶体，产率65.9％；
反应方程式如下：
实施例1：
大鼠前列腺样品中丙二醛含量的测定方法，包括如下步骤：
1)大鼠前列腺样品处理：大鼠处死后，仔细分离前列腺组织并除掉附属结缔组织，准确称量重量后，按照1:9(g/mL)的比例加入生理盐水匀浆，用高速冷冻离心机在4℃下以10000rpm的转速离心10min，上清液为大鼠前列腺组织提取液，保存于-80℃冰箱中直到分析；
2)游离丙二醛提取液的获得：精密量取100μL步骤1)所得的前列腺组织提取液，向其中加入200μL乙腈，涡旋混匀后，用离心机在10000r/min转速下离心10min，取上清液作为游离丙二醛提取液；
3)衍生化：精密量取100μL的前列腺组织提取液、游离丙二醛提取液及丙二醛标准溶液分别置于2ml的安瓿瓶中，向以上溶液中均加入100μL浓度为1.0mol/L的三氯乙酸溶液和250μL浓度为5×10-4mol/L的吖啶酮乙酰肼的乙腈溶液，密封后在60℃水浴中加热40min,冷却至室温后，向每个安瓿瓶中加入550μL 50％的乙腈后进样分析；
4)高效液相色谱检测：色谱条件：色谱柱：Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；柱温30℃；流动相A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0-15min，20％B-100％B；流速为1.0mL/min；激发波长259nm，发射波长406nm；进样量10μL。
5)数据分析：记录每个丙二醛标准溶液色谱进样后所得的峰面积，以丙二醛进样量(pmol)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析，得线性方程为：Y＝53.71X-0.30，线性范围为0.02-10.0pmol，相关系数r＝0.9998，图1为初始浓度0.5μmol/L的丙二醛标准溶液的液相色谱图，图2为丙二醛标准溶液的标准曲线图，将游离丙二醛提取液和前列腺组织提取液中丙二醛的峰面积带入标准曲线中获得测试溶液中游离丙二醛和前列腺组织提取液中丙二醛的物质的量，乘以测试过程中稀释的倍数10即得100μL游离丙二醛提取液和大鼠前列腺组织提取液中丙二醛的总物质的量，从而计算得到大鼠前列腺组织中游离丙二醛和总丙二醛的含量。
本发明考察了方法的检出限和定量限，按照信噪比(S/N＝3)计算方法的检出限为2.5fmol；按照信噪比(S/N＝10)计算方法的定量限为8.3fmol。本发明考察了仪器的精密度和方法的精密度，取丙二醛浓度为125nmol/L的标准液100μL按照前述方法衍生并进样分析，计算丙二醛衍生物峰面积和保留时间的RSD值分别为0.72％和0.039％，说明仪器的精密度良好；取前列腺组织提取液，在一天内重复分析6次，计算日内精密度为1.24％，在6天内每天分析一次，计算日间精密度为2.51％，说明方法的精密度良好。
本发明考察了方法的加标回收率，在前列腺样品中添加三个浓度水平的丙二醛标准溶液，按照前述方法计算回收率，每个水平重复测定3次，结果显示，丙二醛回收率在95～102％范围内，相对标准偏差小于6％，本实施例所得结果如表1所示。
表1本实施例中所得测试结果
实施例2：
大鼠肝组织中丙二醛含量的测定方法，包括如下步骤：
1)大鼠肝组织样品的处理：：取大鼠肝左叶，按肝组织重量(g)与生理盐水体积(mL)比为1:9的比例加生理盐水，采用玻璃匀浆器研磨肝组织，制备肝组织匀浆，在4℃温度下以2500r/min的转速离心10min，分离上清液为大鼠肝组织提取液，放置于-20℃冰箱保存备用；
2)衍生化：精密量取100μL的大鼠肝组织提取液和丙二醛标准溶液分别置于2ml的安瓿瓶中，向每个安瓿瓶中均加入140μL浓度为1.0mol/L的三氯乙酸溶液和300μL浓度为5×10-4mol/L的吖啶酮乙酰肼的乙腈溶液，密封后在100℃水浴中加热20min,冷却至室温后，向每个安瓿瓶中加入460μL50％的乙腈后进样分析；
3)高效液相色谱检测：色谱柱为Eclipse XDB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相：A为水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0-15min，20％B-100％B，流速为1.0mL/min；激发波长259nm，发射波长406nm；柱温30℃；进样量10μL；
4)数据分析：记录每个丙二醛标准溶液色谱进样后所得的峰面积，以丙二醛进样量(pmol)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行线性回归分析，得线性方程为：Y＝53.71X-0.30，线性范围为0.02-10.0pmol，相关系数r＝0.9998，后将大鼠肝组织提取液中丙二醛的峰面积带入标准曲线的线性方程中获得测试溶液中丙二醛的摩尔量，乘以测试过程中稀释的倍数10即得100μL大鼠肝组织提取液中丙二醛的摩尔量，从而计算得到大鼠肝组织丙二醛的含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种生物组织中丙二醛含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)生物组织的预处理及丙二醛标准溶液的准备：
将生物组织进行匀浆处理得匀浆液，匀浆液离心分离后取上清液为生物组织提取液，冷藏待用；制备一系列已知丙二醛浓度且具有浓度梯度的丙二醛标准溶液，冷藏待用；
2)生物组织提取液和丙二醛标准溶液的衍生化：
分别向生物组织提取液或丙二醛标准溶液中均加入三氯乙酸溶液和吖啶酮乙酰肼溶液，密封后置于60～100℃环境下反应20～40min,得衍生化的待测样品溶液和丙二醛标准溶液；
3)高效液相色谱检测：
将步骤2)所得的衍生化的待测样品溶液和丙二醛标准溶液经稀释后使用具有荧光检测器的高效液相色谱进样分析；
4)数据分析：
以步骤3)丙二醛标准溶液中丙二醛的进样量为横坐标，以相应的峰面积为纵坐标，绘制丙二醛的标准工作曲线，将待测样品溶液的峰面积带入标准工作曲线得步骤3)稀释后的待测样品溶液中丙二醛的总量，该丙二醛的总量经换算后得到生物组织中丙二醛的总量，从而计算得到生物组织中丙二醛的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述三氯乙酸溶液为1.0mol/L的三氯乙酸水溶液，所述吖啶酮乙酰肼溶液为吖啶酮乙酰肼溶于乙腈中所得的浓度为5×10-4mol/L的溶液。
3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，步骤2)中生物组织提取液和丙二醛标准溶液衍生化的具体操作步骤为：将100μL生物组织提取液或丙二醛标准溶液、100～140μL浓度为1.0mol/L的三氯乙酸水溶液和250～300μL吖啶酮乙酰肼溶液依次加入到2mL的安瓿瓶中，密封后置于60～100℃环境下反应20～40min，得到待测样品溶液和衍生化的丙二醛标准溶液。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤3)中高效液相色谱的色谱条件为：反相硅胶键合相色谱柱，流动相由A相和B相组成，A相为含5vol％甲醇的水，B相为乙腈，采用梯度洗脱，流动相流速为1.0mL/min，柱温25～40℃，激发波长259nm，发射波长406nm。
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，流动相中B相的体积百分比为20～100％。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤1)中还包括对所得生物组织提取液除蛋白的步骤，具体操作过程为：向生物组织提取液中加入甲醇或乙腈，甲醇或乙腈与提取液的体积比为(2～5):1；后离心，取上清液用于下一步骤。
7.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述丙二醛标准溶液的制备方法如下：量取1,1,3,3-四甲氧基丙烷置于容量瓶中，向其中加入稀硫酸后稀释至刻度，室温下放置90～180min,得已知浓度的丙二醛标准贮备液，将丙二醛标准贮备液稀释不同倍数后即得一系列丙二醛浓度不同的丙二醛标准溶液。
8.根据权利要求7所述的测定方法，其特征在于，丙二醛标准溶液的浓度分别为0.02、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5、5和10μmol/L。
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