CN108530538A

CN108530538A - EpCAM单域抗体E6

Info

Publication number: CN108530538A
Application number: CN201810371904.3A
Authority: CN
Inventors: 季晨博
Original assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Current assignee: Nanjing Maternity and Child Healthcare Hospital
Priority date: 2018-04-24
Filing date: 2018-04-24
Publication date: 2018-09-14
Anticipated expiration: 2038-04-24
Also published as: CN108530538B

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及EpCAM单域抗体E6，利用噬菌体展示技术，通过从驼源免疫的单域重链抗体库中筛选能与靶标抗原EpCAM特异性结合的单域重链抗体库，并进一步将编码该抗体的基因序列克隆至原核表达载体中，获得高效表达的EpCAM单域抗体。能够显著提高单域抗体的特异性结合性能，为EpCAM的免疫导向治疗临床提供基础。

Description

EpCAM单域抗体E6

技术领域

本发明涉及EpCAM单域抗体及其制备方法，属于分子生物学领域。

背景技术

EpCAM是指上皮细胞黏附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule,)，又称CD326，是一类广泛表达于人上皮组织的糖蛋白，具有非常强效的抗原表位。EpCAM不仅具有表皮细胞黏附分子功能，还参与加快细胞周期，促进细胞增殖、分化、迁移以及免疫逃逸等多重生命活动。

研究表明，EpCAM通过参与β-catenin依赖的Wnt级联反应激活c-myc、cyclinA/E等原癌基因的表达，导致肿瘤发生。

生理状态下，EpCAM不同程度地表达于除鳞状上皮细胞之外的所有的正常上皮中，且多位于细胞间紧密连接处。病理状态下，EpCAM几乎表达于所有的腺癌中，包括结直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌等。EpCAM的表达与肿瘤的进展及预后相关，可作为肿瘤诊断的可靠标志和治疗靶点。

EpCAM是目前表达最强和最广泛的肿瘤表面抗原之一，所以EpCAM可能作为大多数肿瘤的免疫治疗靶点，引发广泛关注。由于EpCAM抗体特异性差、结合力低等原因，EpCAM的免疫导向治疗临床试验结果不甚理想，目前还处在初期阶段。因此，高质量特异性抗体的研发是EpCAM能够用于肿瘤诊断、治疗的关键。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中EpCAM的免疫导向治疗临床试验结果不甚理想等问题，公开一种EpCAM单域抗体。

本发明的另一目的是，提供一种EpCAM单域抗体的制备方法。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

EpCAM单域抗体，其包括两条如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VHH链。

其中EpCAM单域抗体是指针对EpCAM的能与EpCAM特异性结合的单域抗体。

本发明同时还公开如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VHH链。并且进一步公开该序列包括框架区FR和互补决定区CDR，其中框架区FR包括SEQ ID NO:2所示的FR1、SEQ ID NO:3所示的FR2、SEQ ID NO:4所示的FR3、以及SEQ ID NO:5所示的FR4；互补决定区CDR包括SEQID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2、以及SEQ ID NO:8所示的CDR3。

并且本发明进一步公开能够用于编码上述的如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的VHH链及该VHH链组成的EpCAM单域抗体的多核苷酸，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示；或者该多核苷酸的核苷酸序列与SEQ ID NO：9具有60%以上同一性，且可用于编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的VHH链及该VHH链组成的EpCAM单域抗体。

这里所说的与SEQ ID NO：9具有60%以上同一性，且可用于编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的VHH链及该VHH链组成的EpCAM单域抗体是指：该核苷酸序列与SEQ ID NO：9具有70%、80%、85%、88%、90%、95%、99%以上同一性，并且所形成的核苷酸序列可以用以编码形成SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

本发明中SEQ ID NO：9这一核苷酸序列是具有示例性的。其他的核苷酸序列能够在本发明所公开的或者未公开的宿主细胞中表达具有SEQ ID NO：1氨基酸序列的VHH链或EpCAM单域抗体，他们可以根据需要被设计出来。在本发明中同时公开这些核苷酸序列与本发明示例的SEQ ID NO：9表现至少70%、或者至少80%、或者至少85%、或者至少88%、或者至少90%、或者至少95%、甚至至少99%的核苷酸序列同一性。由于遗传密码的具有冗余，因此，核苷酸序列可以发生变化，基于这些变化可能产生任意数量的能够编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核酸序列，这些序列应理解为本发明的公开范围内。

同时，本发明公开含有上述多核苷酸的DNA分子。这里的多核苷酸包括如SEQ IDNO：9所示的核苷酸序列，也包括与SEQ ID NO：9具有60%以上同一性，且可用于编码如SEQID NO：1所示氨基酸序列的VHH链及该VHH链组成的EpCAM单域抗体的核苷酸序列。应当理解，这里所说的与SEQ ID NO：9具有60%以上同一性的核苷酸序列包括但是不限于与SEQ IDNO：9具有70%、80%、85%、88%、90%、95%、99%以上同一性的核苷酸序列。基于遗传密码的冗余以及SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的公开，任意数量的能够编码SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核酸序列均应作为此处多核苷酸的核苷酸序列予以理解。

进一步地，本发明还公开一种表达载体，该载体中包含有前述的核苷酸序列。

同时，如果将前述的的如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，或者是与SEQ ID NO：9具有60%以上同一性，且可用于编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的VHH链及该VHH链组成的EpCAM单域抗体的核苷酸序列命名为Ec。

则本发明优选该表达载体为pET28a-Ec。

并且进一步地，在本发明中还公开一种宿主细胞，该宿主细胞能够表达前述EpCAM单域抗体，该EpCAM单域抗体由两条如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VHH链组成。

基于本发明所公开的EpCAM单域抗体具有显著的与EpCAM特异性结合的能力，因此其具有下述用途。

首先，EpCAM单域抗体可以应用于制备结合吸附EpCAM试剂中。

进一步地， EpCAM单域抗体可以作为治疗药物，应用于抗肿瘤药物的制备中，或者作为能够与EpCAM具有特异性结合的单域抗体，同应用于具有EpCAM靶点的肿瘤的检测试剂或诊断试剂的制备中。

并且，本发明中还进一步公开上述用途形成的产品制剂，所述制剂为抗肿瘤药物制剂或者为肿瘤检测试剂或者为肿瘤诊断试剂，该试剂中含有前述的具有两条如SEQ IDNO:1所示氨基酸序列的VHH链的EpCAM单域抗体。

作为另一方面，本发明公开所述的EpCAM单域抗体是由以下步骤制备得到：

S1：提取经EpCAM重组蛋白免疫后的羊驼外周血淋巴细胞中总RNA，逆转录为cDNA，PCR扩增纯化EpCAM单域抗体VHH基因片段；

S2：将EpCAM单域抗体VHH基因片段与噬菌体展示系统载体质粒连接构建噬菌体展示系统载体质粒重组载体，电转化感受态细胞E.coli TG1，构建EpCAM噬菌体单域抗体库；

S3：将EpCAM重组蛋白加入至EpCAM噬菌体单域抗体库中，用PBST洗掉未结合的噬菌体，并以三乙胺将EpCAM特异性结合的噬菌体洗脱下来，富集，感染处于对数生长期的E.coli TG1；

S4：噬菌体ELISA筛选阳性克隆；

S5：将阳性克隆基因序列构建至原核表达载体中，转化感受态细胞E.coli BL21菌株中，IPTG诱导产生抗EpCAM单域抗体。

其中，S1步骤中PCR是指巢式PCR。

优选地，S2步骤中噬菌体展示系统载体质粒为pHEN1噬菌体展示系统载体质粒。构建形成的重组载体为pHEN1-VHH。

更为优选地，S5步骤中原核表达载体为pET28a。

进一步地，本发明中公开包括库容推算步骤，具体为，在S1步骤后，将复苏的菌液梯度稀释后进行平板培养，随机选取24个克隆，菌液PCR后进行电泳，根据电泳结果计算PCR阳性率并按照公式推算库容：库容量=克隆数×稀释倍数×阳性率×10。

优选地，所述的步骤S3重复2次。

同时，本发明还进一步公开S3中能与EpCAM特异性结合的单域抗体库的筛选方法为：

A1：将100µlPBS溶解的EpCAM重组蛋白包被96孔酶标板（10µg/孔），４℃孵育过夜，PBST洗涤2次后，加入200µl 5%BSA于37℃封闭3 h；

A2：3h后加入100µl噬菌体（EpCAM免疫单域抗体噬菌体展示文库）；室温赋予2 h，用PBST洗涤5次，以洗掉不结合的噬菌体；

A3：用100mM三乙胺（TEA）将EpCAM特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的E. coli TG1，37℃培养2h，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选，重复上述筛选过程2次。

更为优选地，本发明进一步公开S4中噬菌体ELISA筛选阳性克隆的步骤为：

B1：对上述筛选后的TG1进行平板培养，挑取96个单克隆接种于含Amp（10 µg/ml）抗生素的LB培养基（10g Tryptone、5gYeast extract和10g NaCl）。待细胞生长至对数生长期时，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1mM，37℃过夜；

B2: 将EpCAM抗原赋予的ELISA板4℃包被过夜，用PBST洗去未结合的抗体，加入5%的脱脂奶粉进行封闭；

B3：利用渗透法获取粗提抗体，加入ELISA板中37℃赋予1h，PBST洗涤后加入抗His标签抗体，每孔加入100 µl，37℃赋予1h；

B4：PBST洗涤后加入显色液，37℃赋予5min，PBST洗涤后加入终止液，酶标仪检测吸光度值，阳性克隆送测序分析。

更为优选地，本发明进一步公开S5中将阳性克隆基因序列构建至原核表达载体的步骤为：

C1：将阳性克隆基因序列构建至原核表达载体pET28a中，转化E. coliBL21感受态细胞，以制备单域抗体的原核系统。

C2：将抗EpCAM单域抗体菌液进行平板划线，挑取单克隆接种到5ml LB培养基中，37℃培养过夜；

C3：将5 mL培养液加入到1 L 培养基中37℃培养至OD600 = 0.5左右加入终浓度为1mM的IPTG，转为16℃培养12 h；

C4：离心收集菌液沉淀，采用PBS重悬，超声破碎30 min后，12000 rpm，离心20 min，收集上清；上清经Ni柱纯化后收集抗EpCAM单域抗体。

本发明利用噬菌体展示技术，通过从驼源免疫的单域重链抗体库中筛选能与靶标抗原EpCAM特异性结合的单域重链抗体库，并进一步将编码该抗体的基因序列克隆至原核表达载体中，获得高效表达的EpCAM单域抗体。能够显著提高单域抗体的特异性结合性能，为EpCAM的免疫导向治疗临床提供基础。

羊驼抗体是一种独特的抗体，其抗体结构域天然缺失轻链，只由一个重链可变区（VHH）组成，直径2.5 nm，长4nm。

本发明中将市售的EpCAM重组蛋白与弗氏不完全佐剂混合后，通过皮下多点免疫法对健康成年羊驼进行EpCAM免疫，5个免疫周期后，抗血清效价高于1:64。

本发明所制备的基于羊驼重链抗体表达的EpCAM单域抗体具有分子量小，可穿透血脑屏障，特异性强，亲和力高，对人的免疫原性弱等优点。通过本发明获得的抗体SDS-PAGE电泳条带单一。且制备方法易于在原核表达系统和各种真核表达系统中大量制备，生产成本低，易于工业化推广、普及。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明做进一步的详细说明。应该理解的是，下述实施例仅用于更加清楚的解释本发明，但不能以此限定本发明的保护范围。在本发明权利要求所限定的保护范围内，对其进行的无实质性变化的改变、修改、或者等效变更，都应落入本发明的保护范围内。

在本实例中，除非特殊说明，否则均为市售的一般产品。

实施例1

1. 构建EpCAM的单域抗体文库

(1)购买市售的EpCAM重组蛋白（ORIGENE公司）这里可以采用其他市售EpCAM重组蛋白，EpCAM重组蛋白购买途径不影响后续实验目的是实现。按照说明将购买的重组蛋白取出，并与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，以此作为疫苗对羊驼进行免疫。

(2)采用皮下多点注射的方法，免疫成年雄性羊驼两头，连续免疫5次，每次间隔一周，以促进EpCAM抗原特异性单域抗体的产生；

(3)5次免疫后，依据检测效价（每次免疫前颈总动脉取血5ml，离心收集上层血清，4℃保存；每次免疫后，通过血凝实验测抗体效价，当效价高于1:64后），取50 ml羊驼外周血准备建库；按照血量4倍体积的量加入红细胞裂解液，12000r/min离心，获得分离羊驼外周血淋巴细胞，Trizol法抽提细胞总RNA，并以RNA为模板逆转录生成cDNA，采用巢式PCR法扩增VHH基因片段；

巢式PCR扩增方法参考文献：Pardon E, Laeremans T, Triest S, Rasmussen SG,Wohlkönig A, Ruf A, Muyldermans S, Hol WG, Kobilka BK, Steyaert J. A generalprotocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nat Protoc.2014 Mar;9(3):674-93。

(4)利用酶切法将PCR扩增产物克隆至pHEN1噬菌体展示系统载体质粒中，电转化感受态细胞E. coli TG1，复苏的菌液梯度稀释后进行平板培养，随机选取24个克隆，菌液PCR后进行电泳，根据电泳结果计算PCR阳性率并推算库容（库容量=克隆数×稀释倍数×阳性率×10）。PCR鉴定阳性率为100%，有效库容10⁷-10⁸。

2. 抗EpCAM单域抗体的筛选

(1)将100µlPBS溶解的EpCAM重组蛋白包被96孔酶标板（10µg/孔），４℃孵育过夜，PBST洗涤2次后，加入200µl 5%BSA于37℃封闭3 h。

(2)3h后加入100µl噬菌体（EpCAM免疫单域抗体噬菌体展示文库）；室温赋予2 h，用PBST洗涤5次，以洗掉不结合的噬菌体。

(3)用100mM三乙胺（TEA）将EpCAM特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数生长期的E. coli TG1，37℃培养2h，产生并纯化噬菌体用于下一轮筛选，重复上述筛选过程（1）和（2）2次。

3. 噬菌体ELISA筛选单个阳性克隆

(1)对上述筛选后的TG1进行平板培养，挑取96个单克隆接种于含Amp（10 µg/ml）抗生素的LB培养基（10g Tryptone、5gYeast extract和10g NaCl）。待细胞生长至对数生长期时，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度1mM，37℃过夜

(2)将EpCAM抗原赋予的ELISA板4℃包被过夜，用PBST洗去未结合的抗体，加入5%的脱脂奶粉进行封闭。

(3)利用渗透法获取粗提抗体，加入ELISA板中37℃赋予1h，PBST洗涤后加入抗His标签抗体，每孔加入100 µl，37℃赋予1h。

(4)PBST洗涤后加入显色液，37℃赋予5min，PBST洗涤后加入终止液，酶标仪检测吸光度值，吸光度值为3Abs；阳性克隆送测序分析，序列如SEQ ID NO：9所示。

4. 单域抗体原核表达载体的构建与表达

(1)将阳性克隆基因序列构建至原核表达载体pET28a中，转化E. coliBL21感受态细胞，以制备单域抗体的原核系统。

(2)将抗EpCAM单域抗体菌液进行平板划线，挑取单克隆接种到5ml LB培养基中，37℃培养过夜；

(3)将5 mL培养液加入到1 L 培养基中37℃培养至OD600 = 0.5左右加入终浓度为1mM的IPTG，转为16℃培养12 h；

(4)离心收集菌液沉淀，采用PBS重悬，超声破碎30 min后，12000 rpm，离心20 min，收集上清；上清经Ni柱纯化后收集抗EpCAM单域抗体。

得到的单域抗体产品可以真空冷冻干燥后，分装保存。

序列表

<110> 南京市妇幼保健院

<120> EpCAM单域抗体E6

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Gln Val Leu Ala Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Val Met Gly

20 25 30

Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile

35 40 45

Arg Arg Pro Gly Lys Thr Phe Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

50 55 60

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Gly Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala Gln Leu

85 90 95

Val Ser Leu Gly Tyr Val Val Thr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro

115 120 125

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Gln Val Leu Ala Gly Gly Ser Leu Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ala Ser Gly Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Val Met Gly Trp Tyr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Arg Gln Pro Pro Gly

1 5

<210> 5

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Arg Arg Pro Gly Lys Thr Phe

1 5 10 15

Tyr Thr Asp

<210> 6

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Lys Asn Thr

1 5 10 15

Ile Tyr Leu Gln Met Asn Gly Leu Lys Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr

20 25 30

Phe Cys

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Asn Ala Gln Leu Val Ser Leu Gly Tyr Val Val Thr Asp

1 5 10

<210> 8

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr

1 5 10 15

Pro Lys Pro Gln Pro

20

<210> 9

<211> 387

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggtgcaac tgcaggagtc tgggggaggc caggtgctgg ctggcgggtc tctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggaag caagttcagt gaatatgtca tgggctggta ccgccagcct 120

ccagggaaac agcgcgaatt ggtcgcgact attcgtaggc ctggtaagac gttctataca 180

gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg acaagaacac gatttatctg 240

caaatgaacg gcctgaaacc tgaggactca gccgtctatt tttgtaatgc tcagctagtt 300

tccctagggt acgtggtgac tgactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 360

gaacccaaga caccaaaacc acaacca 387

Claims

1.EpCAM单域抗体E6，其特征是：包括两条如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的VHH链。

2. 针对EpCAM单域抗体E6的VHH链，其特征是：该VHH链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求2所述的针对EpCAM单域抗体E6的VHH链，其特征是：该序列包括框架区FR和互补决定区CDR，其中框架区FR包括SEQ ID NO:2所示的FR1、SEQ ID NO:3所示的FR2、SEQ ID NO:4所示的FR3、以及SEQ ID NO:5所示的FR4；互补决定区CDR包括SEQ ID NO:6所示的CDR1、SEQ ID NO:7所示的CDR2、以及SEQ ID NO:8所示的CDR3。

4.多核苷酸，其特征是：

（i）核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

或者（ii）核苷酸序列与SEQ ID NO：9具有60%以上同一性，且可用于编码如SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的VHH链及该VHH链组成的EpCAM单域抗体。

5.含有权利要求4所述的多核苷酸的DNA分子。

6.一种表达载体，其特征是：该载体中包含有权利要求4或5所述的核苷酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征是：该宿主细胞能够表达权利要求1所述的EpCAM单域抗体E6。

8.权利要求1中所述的EpCAM单域抗体E6在制备结合吸附EpCAM试剂中的应用。

9. EpCAM单域抗体E6在抗肿瘤药物制备，以及在具有EpCAM靶点的肿瘤的检测试剂或诊断试剂制备中的应用。

10.一种制剂，所述制剂为抗肿瘤药物制剂或者为肿瘤检测试剂或者为肿瘤诊断试剂，其特征是：该试剂中含有权利要求1所述的EpCAM单域抗体。