CN108519360B - 一种检测水中土霉素的试剂盒的使用方法 - Google Patents

一种检测水中土霉素的试剂盒的使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测水中土霉素的试剂盒，包括一发光纳米材料溶液、一A溶液和一缓冲液，发光纳米材料溶液的溶质为纳米材料碳点；A溶液为寡核苷酸溶液，其中的寡核苷酸的序列如SEQ ID NO 01所示，溶剂为45～55mM Tris‑HCl溶液；缓冲液为450～520mM NaCl‑MgCl2‑CaCl245～55mM Tris‑HCl溶液。本发明在发光纳米材料溶液\A溶液和缓冲液的共同作用下，经过简单预处理的水样经处理后即可以进入荧光分光仪进行检测。由于A溶液中的寡核苷酸与土霉素能进行特异性结合形成复合体，再与纳米材料碳点反应，促进了发光强度的下降。随着土霉素含量的增加，发光强度逐渐的下降。

Description

一种检测水中土霉素的试剂盒的使用方法
技术领域
本发明属于膜清洗技术领域，具体涉及一种检测水中土霉素的试剂盒。
背景技术
随着抗生素的普遍使用，导致环境中存在各种人为产生的各种抗生素，长期饮用含抗生素自来水，细菌会产生耐药基因，势必影响生态环境平衡和人体健康。我国是抗生素生产和使用大国，占世界土霉素生产总量的65％，随着环境中微量污染物问题被不断提出，对这些抗生素的检测就越来越重要，而抗生素的检测方法称为相关研究的重点。
土霉素Oxytetracycline(OTC)，别名地霉素，氧四环素，四环素等，属四环素(TC)类光谱抗生素，具有良好的抑菌杀菌作用和促进动物生长发育作用，被应用于水产养殖和畜牧业中，随着养殖用水排放流入自然环境中，污染水资源，由于四环素类抗生素往往同时存在饮用水中，因此建立四环素类抗生素的检测方法，防止抗生素被滥用，具有十分重要的意义。
传统检测水中抗生素技术主要有色谱法和其联用技术、酶免疫分析法。其中液相色谱法(LC)在废水抗生素的检测中是最常见的，但常需与其他技术其配合使用，需要昂贵的仪器和较长的检测时间。其次，酶免疫分析方法对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉，分析分子量很小的化合物和不稳定的化合物有一定的困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测水中土霉素的试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种检测水中土霉素的试剂盒，包括：
一发光纳米材料溶液，其溶质为纳米材料碳点，浓度为0.8～1.2mg/mL，该纳米材料碳点的激发波长为358nm，发射波长为455nm；
一A溶液，为寡核苷酸溶液，浓度为8～12μM，其中的寡核苷酸的序列如SEQ ID NO01所示，溶剂为45～55mM Tris-HCl溶液；
和一缓冲液，为450～520mM NaCl-MgCl2-CaCl245～55mM Tris-HCl溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，所述发光纳米材料溶液的浓度为1mg/mL。
在本发明的一个优选实施方案中，所述A溶液的浓度为10μM，溶剂为50mM Tris-HCl 溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，所述缓冲液为500mM NaCl-MgCl2-CaCl250mMTris-HCl溶液。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将所述发光纳米材料溶液、A溶液和缓冲液以2∶1～5∶360的体积比充分混合，得混合溶液；
(2)将预处理过的水样与上述混合溶液以1∶97～99的体积比混合均匀后，用荧光分光光度计进行检测，检测的激发波长为为358nm，发射波长为455nm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(1)为：将所述发光纳米材料溶液、A溶液和缓冲液以2∶5∶360的体积比充分混合，得混合溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(2)为：将预处理过的水样与上述混合溶液以1∶98的体积比混合均匀后，用荧光分光光度计进行检测，检测的激发波长为为358nm，发射波长为455nm。
进一步优选的，所述水样的预处理为：经过2.5微米孔径的滤膜过滤，再通过C18固相萃取柱处理。
本发明的有益效果是：
1、本发明所提供的试剂盒，在发光纳米材料溶液、A溶液和缓冲液的共同作用下，经过简单预处理的水样经处理后即可以进入荧光分光仪进行检测。由于A溶液中的寡核苷酸与土霉素能进行特异性结合形成复合体，再与纳米材料碳点反应，促进了发光强度的下降。随着土霉素含量的增加，发光强度逐渐的下降。
2、本发明对于不同来源水质中的土霉素进行检测，线性检测范围为5μg/mL到2mg/mL， RSD％＜10％。
附图说明
图1为本发明的纳米材料碳点的激发波长、发射波长和紫外可见吸收光谱图。
图2为本发明的纳米材料碳点的透射电子显微镜图(A)和粒径分布(B)。
图3为本发明在缓冲液作用下的纳米材料碳点、A溶液以及土霉素的发光光谱图。
图4为本发明的试剂盒在高盐作用下对水中土霉素检测的发光光谱图。
图5为本发明的试剂盒对土霉素特异性选择示意图。
图6为本发明的试剂盒对水中土霉素的线性检测范围：(A)土霉素为 0.00000-3.00000mg/mL的发光光谱图；(B)土霉素为0-3mg/mL的曲线，内含 0.00500mg/mL-2.00000mg/mL的标准曲线。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
一种检测水中土霉素的试剂盒，包括：
一发光纳米材料溶液，其溶质为如图1和图2所示的纳米材料碳点，浓度为1mg/mL，该纳米材料碳点的激发波长为358nm，发射波长为455nm；该纳米材料碳点的制备方法如下：向反应容器中加入甘油和乙二胺，摇匀微波炉加热2min后，加入磷酸、一水合柠檬酸、纯净水，微波加热2min，摇匀重复加热三次，冷却至室温，加入无水乙醇，充分震荡、静置。取上清液透析袋透析2d，即得，并根据需要进行稀释到所需浓度。上述甘油、乙二胺、磷酸、一水合柠檬酸、纯净水和无水乙醇的比例为12～17mL∶2～4mL∶1～2 mL∶0.5～1.5g∶4～6mL∶12～17mL，进一步优选为15mL∶3mL∶1.5mL∶1g∶5mL∶15mL。
一A溶液，为寡核苷酸溶液，浓度为10μM，其中的寡核苷酸的序列如SEQ ID NO 01(CGTACGGAATTCGCTAGCGGGCGGGGGTGCTGGGGGAATGGAGTGCTGCGTGCTGCGGGGATCCGAGCTCCACGTG)所示，溶剂为50mM Tris-HCl溶液；
和一缓冲液，为500mM NaCl-MgCl2-CaCl250mM Tris-HCl溶液。
上述纳米材料碳点、A溶液以及土霉素在上述缓冲液作用下的发光光谱如图3所示。
上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)将所述发光纳米材料溶液、A溶液和缓冲液以2∶5∶360的体积比充分混合，得混合溶液；
(2)将预处理过的水样与上述混合溶液以1∶98的体积比混合均匀后，用荧光分光光度计进行检测，检测的激发波长为为358nm，发射波长为455nm。上述水样的预处理为：经过2.5微米孔径的滤膜过滤，再通过C18固相萃取柱处理(C18固相萃取柱分别用6mL 甲醇、超纯水活化后，再加入100mL经过2.5微米孔径的滤膜过滤的水样，用10mL超纯水淋洗小柱后，用6mL甲醇洗脱小柱，洗脱液收集于2mL氮吹管，浓缩至0.2m L，用甲醇定容至0.5mL)。
上述试剂盒在不同盐浓度下对水中土霉素检测的发光光谱如图4所示，对土霉素的特异性选择如图5所示，对水中土霉素的线性检测范围如图6所示。
具体对含有不同浓度的土霉素的样品1～7进行检测，结果如下表所示：
Figure BDA0001618097290000041
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一种检测水中土霉素的试剂盒
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
cgtacggaat tcgctagcgg gcgggggtgc tgggggaatg gagtgctgcg tgctgcgggg 60
atccgagctc cacgtg 76

Claims (7)

1.一种检测水中土霉素的试剂盒的使用方法，其特征在于：该试剂盒包括：
一发光纳米材料溶液，其溶质为纳米材料碳点，浓度为0.8~1.2mg/mL，该纳米材料碳点的激发波长为358nm，发射波长为455nm；
一A溶液，为寡核苷酸溶液，浓度为8~12µM，其中的寡核苷酸的序列如SEQ ID NO 01所示，溶剂为45~55mM Tris-HCl溶液；
和一缓冲液，为450~520mM NaCl-MgCl2-CaCl2 45~55mM Tris-HCl溶液；
其使用方法包括如下步骤：
（1）将所述发光纳米材料溶液、A溶液和缓冲液以2:1~5:360的体积比充分混合，得混合溶液；
（2）将预处理过的水样与上述混合溶液以1:97~99的体积比混合均匀后，A溶液中的寡核苷酸与土霉素能进行特异性结合形成复合体，再与纳米材料碳点反应，促进了发光强度的下降，用荧光分光光度计进行检测，检测的激发波长为358nm，发射波长为455nm。
2.如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述发光纳米材料溶液的浓度为1mg/mL。
3.如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述A溶液的浓度为10µM，溶剂为50mM Tris-HCl溶液。
4.如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述缓冲液为500mM NaCl-MgCl2-CaCl2 50mM Tris-HCl溶液。
5.如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤（1）为：将所述发光纳米材料溶液、A溶液和缓冲液以2:5:360的体积比充分混合，得混合溶液。
6.如权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：所述步骤（2）为：将预处理过的水样与上述混合溶液以1:98的体积比混合均匀后，A溶液中的寡核苷酸与土霉素能进行特异性结合形成复合体，再与纳米材料碳点反应，促进了发光强度的下降，用荧光分光光度计进行检测，检测的激发波长为358nm，发射波长为455nm。
7.如权利要求1至6中任一权利要求所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：水样的预处理为：经过2.5微米孔径的滤膜过滤，再通过C18固相萃取柱处理。
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