CN108503648B - 苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物、药物组合物及制备方法与用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物，结构如结构式I所示；其中，R1，R2选自氢、烷基或取代烷基、烷氧基或取代的烷氧基、环烷基或取代的环烷基、哌嗪基或取代的哌嗪基中的一种；R’，R”，R”’，R””选自H、卤素、C1‑C5烷基、硝基、C1‑C3烷氧基、C1‑C3烷胺基、羟基、乙酰胺基、三氟甲基中的一种。本发明还提供了上述苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的制备方法、以苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物为活性化合物的药物组合物及其应用。本发明的优点在于：本发明的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物具有良好的抗炎活性，在各种急慢性炎症的治疗中体现出良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物领域，尤其涉及一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物、药物组合物及制备方法与用途。
背景技术
二苯乙烯的多种衍生物表现出一系列的生理活性，代表性化合物有白藜芦醇(resveratrol)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)、紫檀芪(pterostilbene)及奥培米芬(Ospemifene)等，其相应结构式分别如下：
其中，白藜芦醇(3，4’，5-三羟基二苯乙烯)具有预防心脏病，抑制血小板凝聚，调控脂质和脂蛋白代谢，抗氧化及对癌症的治疗等作用；己烯雌酚(Diethylstilbestrol)是人工合成的非甾体雌激素物质，能产生与天然雌二醇相同的所有药理与治疗作用；奥培米芬(Ospemifene)是托瑞米芬的活性代谢产物之一，也是新型选择性雌激素受体调节剂，既具有雌激素作用，也具有抗雌激素作用，表现为组织选择性。二苯乙烯衍生物多具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。
其他如基于二苯乙烯结构修饰的产物(E)-styrylisatin，(E)-8-styrylcaffeine，显示出良好的单胺氧化酶(MAO)抑制活性，相应结构式分别如下：
另外如2-苯乙烯基苯并咪唑衍生物显示出良好的抗结核，抗微生物和抗真菌活性，相应结构式分别如下：
综上所述，基于二苯乙烯的骨架结构修饰具有潜在意义。
吡唑和嘧啶类衍生物是具有广泛生物学活性的结构骨架，事实上，通过将这两种杂环骨架通过杂环融合设计得到的吡唑并嘧啶衍生物也具有广泛的生物活性。
吡唑并嘧啶是具有吸引力的稠合基团之一。一些市售药物核心结构含有吡唑并嘧啶骨架，如别嘌呤醇，扎来普隆，茚地普隆，dinaciclib，dorsomorphin，ocinaplon，anagliptin，lorediplon和吡唑磷，西地那非，替苯磺胺等。吡唑并嘧啶显示药理学性质如细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂，抗增殖剂，抗细菌剂，抗真菌剂，抗病毒剂，抗利什曼原虫药。此外，吡唑并嘧啶还可作为中枢神经系统抑制剂，COX-1，COX-2选择性抑制剂，抗癌剂和镇静剂，血清素5-HT 6受体拮抗剂，促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)1受体拮抗剂，结核抑制剂和PET肿瘤显像剂。
正是由于这种广泛的生物活性存在，药物化学家合成了大量的杂环拼合嘧啶衍生物。目前已知的几种稠合嘧啶衍生物，如噻吩并嘧啶，吡咯并嘧啶，噻唑并嘧啶和咪唑并嘧啶已显示出良好的抗菌活性。
据此，基于吡唑并嘧啶骨架的结构修饰具有重要潜在的药用价值，目前也急需合成一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物以满足市场药用需求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物、药物组合物及制备方法与用途。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物，结构如结构式I所示；
其中，R1，R2选自氢、烷基或取代烷基、烷氧基或取代的烷氧基、环烷基或取代的环烷基、哌嗪基或取代的哌嗪基中的一种；
R’，R”，R”’，R””选自H、卤素、C1-C5烷基、硝基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷胺基、羟基、乙酰胺基、三氟甲基中的一种。
作为本发明的优选方式之一，结构如结构式II所示；
其中，R3选自氢、烷基或取代烷基、烷氧基或取代的烷氧基、环烷基或取代的环烷基、哌嗪基或取代的哌嗪基中的一种；
R’，R”，R”’，R””选自H、卤素、C1-C5烷基、硝基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷胺基、羟基、乙酰胺基、三氟甲基中的一种；
X＝CH、C、O、S或N；
n＝1或2。
作为本发明的优选方式之一，结构如结构式III所示；
其中，R4选自氢、烷基或取代烷基、烷氧基或取代的烷氧基、环烷基或取代的环烷基、哌嗪基或取代的哌嗪基中的一种；
R’，R”，R”’，R””选自H、卤素、C1-C5烷基、硝基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷胺基、羟基、乙酰胺基、三氟甲基中的一种；
X＝O或N。
作为本发明的优选方式之一，结构如结构式IV所示；
其中，R5，R6，R7选自H、卤素、C1-C5烷基、硝基、C1-C3烷氧基、苯基、苯氧基、羟基、乙酰胺基、三氟甲基中的一种；
R’，R”，R”’，R””选自H、卤素、C1-C5烷基、硝基、C1-C3烷氧基、C1-C3烷胺基、羟基、乙酰胺基、三氟甲基中的一种；
X＝O或C；
Y＝N或C；
m＝0、1或2；
n＝1或2。
一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的制备方法，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；该中间体4和相应胺的衍生物发生取代反应即制得相应具有结构式I的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物；其中，中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的制备方法，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；以中间体4为原料，与相应胺的衍生物反应，即制得相应具有结构式II的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物；其中，中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的制备方法，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；以中间体4为原料，和对氨基苯甲酸甲酯发生取代反应，制得相应中间体5；该中间体5在碱性条件下发生水解反应，制得相应中间体6；中间体6和相应胺的衍生物，在EDCI和HOBt催化条件下，发生缩合反应，制得相应具有结构式III的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物；其中，中间体4、中间体5、中间体6、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的制备方法，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；以中间体4为原料，与相应胺的衍生物反应，制得相应具有结构通式IV的化合物；其中，中间体4、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
一种以上述苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物为活性化合物的药物组合物，包括活性化合物以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
作为本发明的优选方式之一，所述赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
作为本发明的优选方式之一，所述药学上可接受的载体包括稀释剂、崩解剂、粘合剂和润滑剂。
作为本发明的优选方式之一，所述药物组合物的具体剂型为片剂、胶囊、锭剂、液体溶液、悬浮液、直肠剂型、肌内、静脉、皮内或皮下给药以及脂质体。
作为本发明的优选方式之一，所述活性化合物的剂量为0.01-500mg/kg。
一种上述药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明相比现有技术的优点在于：本发明提供了一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物，(1)制备工艺简单、操作方便；(2)具有良好的抗炎活性，在各种急慢性炎症的治疗中体现出良好的应用前景，在对如脓毒血症等急性炎症和以2型糖尿病、阿尔海默茨病和动脉粥样硬化症为代表的慢性炎症的治疗中体现了良好的应用潜力。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的代表性化合物主要有23种，分别编号为“编号1”、“编号2”、“编号3”、“编号4”、“编号5”、“编号6”……“编号23”。其中，编号1-13对应的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的结构通式如结构式V所示：
该结构式V中的不同R基团对应不同编号的化合物，具体如表1所示。
表1编号1-13化合物对应的不同R基(结构式V中R基)表示
编号14-23对应的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的结构通式如结构式VI所示：
该结构式VI中的不同R基团对应不同编号的化合物，具体如表2所示。
表2编号14-23化合物对应的不同R基(结构式VI中R基)表示
实施例1
苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物制备过程中中间体2的制备。
1.1中间体2-I制备：
反应瓶中加入二氯甲烷10ml，3,4,5-三甲氧基肉桂酸(0.5g，2.36mmol)，冰浴条件下，加入草酰氯(11.8mmol)，催化量DMF,然后于室温搅拌至反应完全，约3-5h，TLC监控，反应完全后，减压蒸出溶剂与过量草酰氯，蒸馏至干。
反应瓶中加入氨基吡唑1(0.429g，2.36mmol)，加入10ml二氯甲烷，加入3ml三乙胺，搅拌均匀后，冰浴条件下，滴加入上步反应残留物的二氯甲烷溶液，然后于室温反应过夜，约8-12h，TLC监控；反应完成后，加入适量二氯甲烷，用水，饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩至干，再用适量乙醇重结晶，即得白色固体，即结构式2-I所示中间体2-I。
1.2中间体2-II制备：
反应瓶中加入二氯甲烷10ml，肉桂酸(0.5g，2.36mmol)，冰浴条件下，加入草酰氯(11.8mmol)，催化量DMF,然后于室温搅拌至反应完全，约3-5h，TLC监控；反应完全后，减压蒸出溶剂与过量草酰氯，蒸馏至干。
反应瓶中加入氨基吡唑1(0.429g，2.36mmol)，加入10ml二氯甲烷，加入3ml三乙胺，搅拌均匀后，冰浴条件下，滴加入上步反应残留物的二氯甲烷溶液，然后于室温反应过夜，约8-12h，TLC监控；反应完成后，加入适量二氯甲烷，用水，饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩至干，用适量乙醇重结晶，即得白色固体，即结构式2-II所示中间体2-II。
1.3中间体3-I的制备：
干燥条件下，反应瓶中加入20ml无水乙醇，加入金属钠(365mg，15.8mmol)，干燥条件下，搅拌至金属钠溶解，成为溶液，然后加入中间体2-I(500mg，1.33mmol)，隔绝湿气条件下，回流搅拌反应6-12h，TLC监控；反应完全后，浓缩部分乙醇，用稀盐酸调节pH＝7，析出白色固体，过滤，洗涤，干燥，即得结构式3-I所示中间体3-I。
1.4中间体3-II的制备：
干燥条件下，反应瓶中加入20ml无水乙醇，加入金属钠(365mg，15.8mmol)，干燥条件下，搅拌至金属钠溶解，成为溶液，然后加入中间体2-II(500mg，1.33mmol)，隔绝湿气条件下，回流搅拌反应6-12h，TLC监控；反应完全后，浓缩部分乙醇，用稀盐酸调节pH＝7，析出白色固体，过滤，洗涤，干燥，即得结构式3-II所示中间体3-II。
1.5中间体4-I的制备：
反应瓶中，加入干燥中间体3-I(0.5g，1.4mmol)，加入三氯氧磷(POCl3)(5ml，53.75mmol)，隔绝湿气条件下，反应约6-12h，TLC监控；反应完成后，冷却至室温，然后将反应溶液倾入约50g冰水混合物中，充分搅拌待碎冰完全消失，用乙酸乙酯萃取，有机层用水，饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩干，即得结构式4-I所示中间体4-I。
1.6中间体4-II的制备：
反应瓶中，加入干燥中间体3-II(0.5g，1.4mmol)，加入三氯氧磷(POCl3)(5ml，53.75mmol)，隔绝湿气条件下，反应约6-12h，TLC监控；反应完成后，冷却至室温，然后将反应溶液倾入约50g冰水混合物中，充分搅拌待碎冰完全消失，用乙酸乙酯萃取，有机层用水，饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩干，即得结构式4-II所示中间体4-II。
1.7中间体5-I的制备：
反应瓶中加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)，加入10ml异丙醇，再加入对氨基苯甲酸甲酯(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控；反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(10:1,v/v)，即得结构式5-I所示中间体5-I。
1.8中间体5-II的制备：
反应瓶中加入中间体4-II(100mg，0.266mmol)，加入10ml异丙醇，再加入对氨基苯甲酸甲酯(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控；反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(10:1,v/v)，即得结构式5-II所示中间体5-II。
1.9中间体6-I的制备：
将中间体5-I加入2N NaOH水溶液(0.5ml)，甲醇5ml，室温搅拌过夜，TLC监控，反应完成后，减压除去部分甲醇溶液，用1N HCl调节PH＝3-4，析出大量白色固体，过滤，干燥后即得结构式6-I所示中间体6-I。
中间体6-II的制备：
将中间体5-II加入2N NaOH水溶液(0.5ml)，甲醇5ml，室温搅拌过夜，TLC监控；反应完成后，减压除去部分甲醇溶液，用1N HCl调节PH＝3-4，析出大量白色固体，过滤，干燥后即得结构式6-II所示中间体6-II。
实施例2
本实施例的一种(E)-1-甲基-3-丙基-N-(3-(三氟甲基)苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号1化合物)的制备方法，包括如下步骤：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入间三氟甲基苯胺(52mg，0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，用异丙醇重结晶，得到黄色固体，即(E)-1-甲基-3-丙基-N-(3-(三氟甲基)苯基)-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,cdcl3)δ10.45(s,1H),8.71(s,1H),8.22(d,J＝8.0Hz,1H),7.68(d,J＝15.4Hz,1H),7.46(d,J＝15.4Hz,1H),7.42(t,J＝7.9Hz,1H),7.22(d,J＝7.5Hz,1H),6.65(s,2H),4.65(s,3H),3.95(s,3H),3.93(s,6H),2.70(t,J＝7.6Hz,2H),1.66(m,2H),0.91(t,J＝7.3Hz,3H).1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.78(d,J＝15.7Hz,1H),7.73(s,1H,NH),7.45(d,J＝7.5Hz,1H),7.32(t,J＝7.7Hz,1H),7.15(d,J＝15.7Hz,1H),7.01(d,J＝7.3Hz,1H),6.86(s,1H),6.83(s,2H),4.29(s,3H),3.90(s,6H),3.87(s,3H),2.97(t,J＝7.7Hz,2H),2.45(s,3H),1.88(dd,J＝15.0,7.5Hz,2H),1.04(t,J＝7.3Hz,3H).HR-MS:calcd for C27H29F3N5O3[M+H]+,528.2217；found 528.2220.
实施例3
本实施例的一种(E)-1-甲基-N-苯基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号2化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入苯胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，得到黄色固体残余物，用异丙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-1-甲基-N-苯基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
Mp：178℃,1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.76–7.71(m,3H,ArH+C＝CH),7.44(t,J＝7.5Hz,2H,ArH),7.20(t,J＝7.4Hz,1H,ArH),7.15(d,J＝15.7Hz,1H,＝CH),6.91(s,1H,NH),6.82(s,2H,ArH),4.28(s,3H,OCH3),3.91(s,6H,2 X OCH3),3.88(s,3H,NCH3),2.98(t,J＝7.6Hz,2H,CH2),1.89(m,2H,CH2),1.04(t,J＝7.3Hz,3H,CH3).HR-MS:calcd forC26H30N5O3[M+H]+,460.2343；found 460.2346.
实施例4
本实施例的一种(E)-N-异丙基-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号3化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入异丙胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(10:1，v/v)，得到白色固体，即(E)-N-异丙基-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
13C NMR(151MHz,cdcl3)δ157.71,153.27,148.79,145.47,142.83,138.25,135.08,132.60,128.67,121.01,104.25,60.94,56.11,42.57,38.99,27.68,22.85,22.26,14.03.1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.74(d,J＝15.7Hz,1H),7.13(d,J＝15.7Hz,1H),6.85(s,2H),4.85(d,J＝6.9Hz,1H),4.70(dd,J＝12.9,6.4Hz,1H),4.23(s,3H),3.92(s,6H),3.88(s,3H),2.94(t,J＝7.5Hz,2H),1.86(dd,J＝14.8,7.3Hz,2H),1.41(d,J＝6.1Hz,6H),1.02(t,J＝7.1Hz,3H).HR-MS:calcd for C23H32N5O3[M+H]+,426.2500；found 426.2503.
实施例5
本实施例的一种(E)-4-((1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)氨基)苯甲酸(编号4化合物)的制备方法，包括如下步骤：
反应瓶中加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)，加入10ml异丙醇，再加入对氨基苯甲酸甲酯(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控；反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(10:1,v/v)，得到白色固体。
将得到的固体加入2N NaOH水溶液(0.5ml)，甲醇5ml，室温搅拌过夜，TLC监控，反应完成后，减压除去部分甲醇溶液，用1N HCl调节PH＝3-4，析出大量白色固体，过滤，干燥后得到白色固体，即(E)-4-((1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)氨基)苯甲酸。
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)9.29(s,1H),8.04(d,J＝8.3Hz,2H),7.97(d,J＝8.6Hz,2H),7.66(d,J＝15.7Hz,1H),7.22(dd,J＝15.9,1H),6.99(s,2H),4.31(s,3H),3.86(s,6H),3.70(s,3H),3.17(s,1H),2.88(t,J＝7.5Hz,2H),1.84–1.76(m,2H),0.97(t,J＝7.4Hz,3H).
实施例6
本实施例的一种(E)-1-(1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-4-醇(编号5化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入4-羟基哌啶(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(10:1，v/v)，得到白色固体，即(E)-1-(1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-4-醇。
13C NMR(151MHz,cdcl3)δ157.19,154.00,153.45,147.22,144.99,138.52,135.62,132.55,128.18,124.53,104.41,67.61,61.10,56.26,47.12,38.56,34.03,27.96,22.35,14.21.1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.78(d,J＝15.7Hz,1H),7.17(d,J＝15.6Hz,1H),6.86(s,2H),4.11(s,3H),4.05(m,1H),3.92(s,6H),3.90(Brs,1H),3.89(s,3H),3.32(t,J＝11.1Hz,2H),2.99(t,J＝7.3Hz,2H),2.20–2.10(m,2H),1.88(m,2H),1.86–1.74(m,4H),1.04(t,J＝6.9Hz,3H).HR-MS:calcd for C25H34N5O4[M+H]+,468.2605；found 468.2609.
实施例7
本实施例的一种(E)-N-(4-氟苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号6化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入4-氟苄胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(4-氟苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.73(d,J＝15.7Hz,1H),7.49–7.41(m,2H),7.14(d,J＝15.7Hz,1H),7.10–7.05(m,2H),6.83(s,2H),5.32(t,J＝5.5Hz,1H),4.95(d,J＝5.4Hz,2H),4.21(s,3H),3.91(s,6H),3.88(s,3H),2.98–2.92(m,2H),1.90–1.81(m,2H),1.03(t,J＝7.3Hz,3H).
实施例8
本实施例的一种(E)-N-(4-溴苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号7化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入4-溴苄胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(4-溴苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.69(d,J＝15.7Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(d,J＝15.7Hz,1H),6.82(s,2H),5.36(d,J＝4.0Hz,1H),4.93(d,J＝5.2Hz,2H),4.22(s,3H),3.91(s,6H),3.88(s,3H),2.97–2.91(m,2H),1.86(m,2H),1.04–0.99(m,3H).
实施例9
本实施例的一种(E)-N-(4-氯苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号8化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入4-氯苄胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(4-氯苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.70(d,J＝15.7Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,2H),7.36(d,J＝8.4Hz,2H),7.13(d,J＝15.7Hz,1H),6.82(s,2H),5.37(t,J＝5.5Hz,1H),4.95(d,J＝5.4Hz,2H),4.22(s,3H),3.91(s,6H),3.88(s,3H),2.97–2.93(m,2H),1.86(m,2H),1.03(t,J＝7.4Hz,3H).
实施例10
本实施例的一种(E)-N-(2-氟苯乙基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号9化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入2-氟苯乙胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(2-氟苯乙基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.83(d,J＝15.7Hz,1H),7.32–7.23(m,2H),7.16–7.07(m,3H),6.88(s,2H),5.23(t,J＝5.5Hz,1H),4.13(s,3H),4.01(td,J＝6.8,5.5Hz,2H),3.93(s,6H),3.89(s,3H),3.17(t,J＝6.8Hz,2H),2.95–2.91(m,2H),1.89–1.82(m,2H),1.02(t,J＝7.4Hz,3H).
实施例11
本实施例的一种(E)-N-(呋喃-2-基甲基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号10化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入糠胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(呋喃-2-基甲基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.81(d,J＝15.7Hz,1H),7.43(d,J＝0.8Hz,1H),7.15(d,J＝15.7Hz,1H),6.87(s,2H),6.41(d,J＝3.1Hz,1H),6.39(d,J＝1.7Hz,1H),5.37(s,1H),4.97(d,J＝5.2Hz,2H),4.23(s,3H),3.92(s,6H),3.88(s,3H),2.97–2.92(m,2H),1.86(m,2H),1.02(t,J＝7.3Hz,3H).
实施例12
本实施例的一种(E)-N-(2-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号11化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入邻甲氧基苄胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(2-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.83(d,J＝15.7Hz,1H),7.50–7.44(m,1H),7.31(td,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.14(d,J＝15.7Hz,1H),6.97(t,J＝7.9Hz,2H),6.88(s,2H),5.87(t,J＝5.6Hz,1H),4.96(d,J＝5.6Hz,2H),4.20(s,3H),3.95(s,3H),3.93(s,6H),3.89(s,3H),2.97–2.90(m,2H),1.84(m,2H),1.01(t,J＝7.4Hz,3H).
实施例13
本实施例的一种(E)-N-(3-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号12化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入3-甲氧基苄胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(3-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ7.77(d,J＝15.7Hz,1H),7.32(t,J＝8.1Hz,1H),7.14(d,J＝15.7Hz,1H),7.07–7.03(m,2H),6.89–6.86(m,1H),6.85(s,2H),5.35(t,J＝5.4Hz,1H),4.95(d,J＝5.3Hz,2H),4.21(s,3H),3.91(s,6H),3.88(s,3H),3.81(s,3H),2.98–2.92(m,2H),1.86(q,J＝7.5Hz,2H),1.03(t,J＝7.3Hz,3H).
实施例14
本实施例的一种(E)-N-(4-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号13化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-I(100mg，0.266mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入4-甲氧基苄胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(4-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,Chloroform-d)7.79(d,J＝15.7Hz,1H),7.40(d,J＝8.6Hz,2H),7.15(d,J＝15.7Hz,1H),6.92(d,J＝8.6Hz,2H),6.85(s,2H),5.28(t,J＝5.3Hz,1H),4.90(d,J＝5.2Hz,2H),4.18(s,3H),3.91(s,6H),3.88(s,3H),3.82(s,3H),2.95(t,J＝7.7Hz,2H),1.86(h,J＝7.5Hz,2H),1.03(t,J＝7.4Hz,3H).
实施例15
本实施例的一种(E)-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-N-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号14化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入间三氟甲基苯胺(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到黄色固体，即(E)-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-N-(3-(三氟甲基)苯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ9.84(brs,1H),8.42(s,1H),8.05(d,J＝8.2Hz,1H),7.81–7.54(m,5H),7.45(dd,J＝15.8,8.2Hz,4H),4.40(s,3H),2.94(t,J＝7.3Hz,2H),1.77(dd,J＝14.6,7.2Hz,2H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).
实施例16
本实施例的一种(E)-N-(4-氯苯乙基)-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号15化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入对氯苯乙胺(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-(4-氯苯乙基)-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(300MHz,DMSO-d)δ7.86(s,1H,NH),7.77(d,J＝15.9Hz,1H,＝CH),7.67(d,J＝7.4Hz,2H),7.46–7.27(m,7H),7.14(d,J＝15.9Hz,1H,＝CH),4.15(s,3H,NCH3),3.82(m,2H,CH2),3.08–2.99(m,2H,CH2),2.80(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),1.76(dd,J＝14.9,7.4Hz,2H,CH2),0.95(t,J＝7.4Hz,3H,CH3).HR-MS:calcd for C25H27ClN5[M+H]+,432.1950；found432.1952.
实施例17
本实施例的一种(E)-N-异丁基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号16化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入仲丁胺(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-异丁基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.72(brs,1H,NH),8.05(d,J＝15.7Hz,1H,＝CH),7.71(d,J＝6.3Hz,2H,ArH),7.60–7.42(m,4H,ArH),4.29(s,3H,NCH3),3.63(t,J＝6.3Hz,2H,CH2),2.92(t,J＝7.4Hz,2H,CH2),2.24–2.08(m,1H,CH),1.71(dd,J＝14.8,7.4Hz,2H,CH2),1.02(d,J＝6.6Hz,6H,,2 X CH3),0.96(t,J＝7.3Hz,3H,CH3).HR-MS:calcd for C21H28N5[M+H]+,350.2339；found 350.2342.
实施例18
本实施例的一种(E)-N-异丙基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号17化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入异丙胺(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-异丙基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,cdcl3+dmso)δ8.21(d,J＝7.5Hz,1H,NH),8.02(d,J＝15.6Hz,1H,ArH),7.80(d,J＝15.6Hz,1H,ArH),7.67(d,J＝4.2Hz,2H,ArH),7.40(s,3H,ArH),4.89(dq,J＝13.6,6.7Hz,1H,NCH),4.40(s,3H,NCH3),3.08(t,J＝7.4Hz,2H,CH2),1.85–1.74(m,2H,CH2),1.51(d,J＝6.6Hz,6H,2 X CH3),1.01(t,J＝7.3Hz,3H,CH3).13C NMR(151MHz,cdcl3+dmso)δ152.94,149.33,142.33,139.74,133.95,129.86,128.67,128.32,127.83,120.41,118.36,44.34,39.59,27.11,21.83,21.08,13.10.HR-MS:calcd for C20H26N5[M+H]+,336.2183；found 336.2184.
实施例19
本实施例的一种(E)-4-(1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)吗啉(编号18化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入吗啉(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-4-(1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)吗啉。
Mp：140℃
1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.86(d,J＝15.9Hz,1H,＝CH),7.62(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.38(t,J＝7.5Hz,2H,ArH),7.30(t,J＝7.3Hz,1H,ArH),7.25(d,J＝15.9Hz,1H,＝CH),4.10(s,3H,NCH3),3.97–3.92(m,4H,2 X OCH2),3.62–3.56(m,4H,2 X NCH2),2.99(t,J＝7.7Hz,2H,CH2),1.89(dd,J＝15.1,7.5Hz,2H,CH2),1.04(t,J＝7.4Hz,3H,CH3).13C NMR(151MHz,cdcl3)δ157.31,153.72,147.57,145.39,136.83,135.88,128.80,128.58,128.48,127.46,124.40,66.55,50.10,38.60,27.98,22.27,14.21.HR-MS:calcd forC21H26N5O[M+H]+,364.2132；found 364.2136.
实施例20
本实施例的一种(E)-N 1-(1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)苯-1,4-二胺(编号19化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入对苯二胺(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干,残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N 1-(1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)苯-1,4-二胺。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ9.40(s,2H),7.90-7.78(m,2H,ArH),7.73-7.58(m,3H,ArH),7.46-7.26(m,6H,ArH),4.34(s,3H,NCH3),2.91(dd,J＝15.0,7.5Hz,2H,CH2),1.86–1.69(m,2H,CH2),1.02–0.92(m,3H,CH3).HR-MS:calcd for C23H25N6[M+H]+,385.2135；found385.2131.
实施例21
本实施例的一种(E)-N-异丙基-4-((1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)氨基)苯甲酰胺(编号20化合物)的制备方法：
反应瓶中加入中间体6-II(50mg 0.105mmol)(制备方法见实施例1)，二氯甲烷(5ml)，EDCI(30mg，0.157mmol)，HOBt(21mg，0.157mmol)，再加入异丙胺(11mg，0.157mmol)，三乙胺(0.5ml)，室温搅拌过夜，反应完全后，加适量饱和NaHCO3溶液，用EtOAc萃取2-3次，至水层无紫外吸收，合并有机层，用无水Na2SO4干燥后旋干，乙醇重结晶，得微黄色固体，即(E)-N-异丙基-4-((1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)氨基)苯甲酰胺。
1H NMR(600MHz,dmso)δ9.33(Brs,1H),8.16(d,J＝7.7Hz,1H),7.98(d,J＝8.5Hz,2H),7.92(d,J＝8.3Hz,2H),7.73(d,J＝15.8Hz,1H),7.67(d,J＝7.6Hz,2H),7.44(t,J＝7.4Hz,2H),7.38(t,J＝7.3Hz,1H),7.27(d,J＝15.8Hz,1H),4.34(s,3H),4.13(dd,J＝13.7,6.7Hz,1H),2.90(t,J＝7.4Hz,2H),1.79(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H),1.21(s,3H),1.19(s,3H),0.97(t,J＝7.3Hz,3H).HR-MS:calcd for C27H31N6O[M+H]+,455.2554；found455.2550.
实施例22
本实施例的一种(E)-1-甲基-N-(3-吗啉代丙基)-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号21化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入3-吗啉丙胺(0.266mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干，残余物经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(10:1,v/v)，得到白色固体，即(E)-1-甲基-N-(3-吗啉代丙基)-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(600MHz,cdcl3)δ7.84(d,J＝15.8Hz,1H),7.60(d,J＝7.5Hz,2H),7.36(t,J＝7.6Hz,2H),7.28(d,J＝7.3Hz,1H),7.20(d,J＝15.8Hz,1H),6.09(s,1H),4.25(s,3H),3.83(dd,J＝11.5,6.0Hz,2H),3.72(s,4H),2.97–2.91(m,2H),2.58(t,J＝5.9Hz,2H),2.52(brs,4H),1.95(dd,J＝12.1,6.0Hz,2H),1.90–1.82(m,2H),1.02(t,J＝7.3Hz,3H).HR-MS:calcd for C24H33N6O[M+H]+,421.2710；found 421.2714.
实施例23
本实施例的一种(E)-N-丁基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号22化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入正丁胺(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控；反应完成后，冷却至室温，减压浓缩至干，残余物用乙醇重结晶，得到白色固体，即(E)-N-丁基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.71(brs,1H,NH),8.06(d,J＝15.7Hz,1H,＝CH),7.70(d,J＝6.6Hz,2H,ArH),7.59–7.42(m,4H,ArH),4.28(s,3H,NCH3),3.81(dd,J＝13.2,6.4Hz,2H,CH2),2.92(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),1.72(dt,J＝14.5,7.1Hz,4H,2 X CH2),1.46(dd,J＝14.7,7.4Hz,2H,CH2),0.97(dd,J＝16.6,7.4Hz,6H,2 X CH3).HR-MS:calcd for C21H28N5[M+H]+,350.2339；found 350.2338.
实施例24
本实施例的一种(E)-1-甲基-3-丙基-N-(吡啶-3-基)-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺(编号23化合物)的制备方法：
反应瓶中，加入中间体4-II(100mg，0.32mmol)(制备方法见实施例1)，加入10ml异丙醇，再加入3-氨基吡啶(0.32mmol)，回流反应约6-12h，TLC监控，反应完成后，冷却至室温,减压浓缩至干,残余物经柱层析纯化，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯(10:1,v/v)，得到类白色固体，即(E)-1-甲基-3-丙基-N-(吡啶-3-基)-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺。
1H NMR(300MHz,DMSO)δ9.58(s,1H,NH),7.83–7.62(m,4H,ArH),7.59(d,J＝15.9Hz,1H,＝CH),7.47-7.38(d,J＝6.8Hz,5H,ArH),6.84(d,J＝15.8Hz,1H,＝CH),3.89(s,3H,NCH3),2.41(t,J＝7.5Hz,2H,CH2),1.55(dd,J＝14.9,7.5Hz,2H,CH2),0.87(t,J＝7.4Hz,3H,CH3).
实施例25
本实施例用以说明上述实施例中制得的各苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的抗炎活性评价及结果。
1、实验原理：实验采用NO含量测定法，利用硝酸还原酶还原硝酸盐为亚硝酸盐，然后通过Griess Reagent试剂检测亚硝酸盐，从而计算出总的NO含量。
2、实验步骤如下：
(1)取处于对数生长期细胞，收集细胞，利用细胞计数板进行计数；利用培养基进行稀释细胞使浓度为1.4*105/ML，接种细胞在24孔板内，每孔加入体积为500μl，培养过夜；
(2)24孔板分为三组：空白组(只有细胞)、模型组(细胞+LPS)、实验组(细胞+LPS+化合物)；
(3)隔夜后换液，空白组、模型组直接换新鲜培养基500μl，实验组每孔加入含有不同浓度(40、20、10、5、2.5μM)的化合物溶液500μl；
(4)1h后加入LPS进行刺激，使LPS的终浓度为1μg/ML(一般可以把高浓度的LPS用少量培养基进行稀释，再进行滴加)；
(5)24h后，观察细胞提细胞上清液，用碧云天生产的一氧化氮检测试剂盒检测并计算细胞上清NO的浓度；
(6)配置标准曲线：用新鲜培养基稀释标准品浓度为1、5、10、20、40、60、100μM；
(7)按50μL每孔，在96孔板中分别加入标准品及细胞上清；
(8)每孔分别先加室温50μL Griess ReagentⅠ，再加50μl Griess ReagentⅡ；
(9)使用酶标仪在540nm测定吸光度，带入标曲算出NO含量。
(10)以上实验均重复三次，结果用SPSS 17.0统计分析软件进行分析作图。
3、实验结果：
表3各实施例中相应编号化合物的抗炎活性数据统计表
注：IC50值单位为：μmol/L，“--”表示IC50值大于50μmol/L,没有进行复筛。
结果见表3，由表3可知，本实施例提供的各苯乙烯基吡唑并嘧啶杂环化合物具有良好的抗炎活性，在各种急慢性炎症的治疗中体现出良好的应用前景，在对如脓毒血症等急性炎症和以2型糖尿病、阿尔海默茨病和动脉粥样硬化症为代表的慢性炎症的治疗中体现了良好的应用潜力。
实施例26
本实施例的一种以上述实施例制备所得苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物为活性化合物的药物组合物，包括该活性化合物本身以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，其中，活性化合物的剂量为0.01-500mg/kg。
进一步地，赋形剂具体为碳酸钙、磷酸钙、糖类、淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油或聚乙二醇；
进一步地，药学上可接受的载体具体为稀释剂、崩解剂、粘合剂或润滑剂；
进一步地，药物组合物的剂型具体为片剂、胶囊、锭剂、液体溶液、悬浮液、直肠剂型、肌内、静脉、皮内或皮下给药以及脂质体中的一种。
本实施例中的药物组合物由于采用具有良好抗炎活性的苯乙烯基吡唑并嘧啶杂环化合物为主要活性化合物，可广泛应用于各种急慢性炎症。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物，其特征在于，结构式如V和VI所示；
所述结构通式如结构式V的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物选自(E)-N-异丙基-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-4-((1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)氨基)苯甲酸、(E)-1-(1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)哌啶-4-醇、E)-N-(4-氟苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N-(4-溴苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N-(4-氯苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N-(2-氟苯乙基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N-(呋喃-2-基甲基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N-(2-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N-(3-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺和(E)-N-(4-甲氧基苄基)-1-甲基-3-丙基-5-(3,4,5-三甲氧基苯乙烯基)-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺中的一种；
所述结构通式如结构式VI的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物选自(E)-N-异丁基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N-异丙基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺、(E)-N 1-(1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-基)苯-1,4-二胺和(E)-N-丁基-1-甲基-3-丙基-5-苯乙烯基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-胺中的一种。
2.根据权利要求1所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物，其特征在于，结构如结构式II所示；
其中，R3如权利要求1所定义；
R’，R”，R”’，R””如权利要求1所定义；
X如权利要求1所定义；
n如权利要求1所定义。
3.根据权利要求1所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物，其特征在于，结构如结构式III所示；
其中，R4如权利要求1所定义；
R’，R”，R”’，R””如权利要求1所定义；
X如权利要求1所定义。
4.根据权利要求1所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物，其特征在于，结构如结构式IV所示；
其中，R5，R6，R7如权利要求1所定义；
R’，R”，R”’，R””如权利要求1所定义；
X如权利要求1所定义；
Y如权利要求1所定义；
m如权利要求1所定义；
n如权利要求1所定义。
5.一种制备如权利要求1所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的方法，其特征在于，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；该中间体4和相应胺的衍生物发生取代反应即制得相应具有结构式I的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物；其中，中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
6.一种制备如权利要求2所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的方法，其特征在于，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；以中间体4为原料，与相应胺的衍生物反应，即制得相应具有结构式II的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物；其中，中间体1、中间体2、中间体3、中间体4、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
7.一种制备如权利要求3所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的方法，其特征在于，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；以中间体4为原料，和对氨基苯甲酸甲酯发生取代反应，制得相应中间体5；该中间体5在碱性条件下发生水解反应，制得相应中间体6；中间体6和相应胺的衍生物，在EDCI和HOBt催化条件下，发生缩合反应，制得相应具有结构式III的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物；其中，中间体4、中间体5、中间体6、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
8.一种制备如权利要求4所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的方法，其特征在于，将取代苯基丙烯酸用草酰氯制备成相应酰氯，然后和氨基吡唑中间体1发生缩合反应，制得中间体2；然后在碱性条件下，中间体2发生关环缩合，制得相应中间体3；中间体3用过量三氯氧磷发生氯化反应，制得关键的中间体4；以中间体4为原料，与相应胺的衍生物反应，制得相应具有结构通式IV的化合物；其中，中间体4、苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物的相应结构式及目标产物的生成反应式如下：
9.一种以权利要求1-4任一项所述的苯乙烯基吡唑并嘧啶类化合物为活性化合物的药物组合物，其特征在于，包括活性化合物以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述活性化合物的剂量为0.01-500mg/kg。
11.一种如权利要求9-10任一项所述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
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