CN108496081A - 用于结核病的即时检验诊断的核心元件 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过如下来诊断结核病的方法：使用新的抗体生物标志物捕获载体，使用化学抛光和机械抛光来活化丝网印刷电极，以及将分枝菌酸抗原生物标志物固定在活化的电极上。通过将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到纳米颗粒的外表面上，使得所述分枝菌酸抗原作为抗体生物标志物捕获剂呈现以产生所述新的抗体生物标志物捕获载体。耐溶剂丝网印刷电极通过化学抛光所述电极和机械抛光所述电极二者来活化。通过将所述活化的电极与分枝菌酸‑二甲基甲酰胺溶液一起孵育以允许分枝菌酸抗原吸附到所述活化的电极上来将所述分枝菌酸抗原固定在所述活化的电极上。

Description

用于结核病的即时检验诊断的核心元件
本发明涉及诊断结核病的方法。其特别涉及通过如下来诊断结核病的方法：使用新的抗体生物标志物捕获载体，使用化学抛光和机械抛光来活化丝网印刷电极，以及将分枝菌酸抗原生物标志物固定在活化的电极上。
根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)，在2012年有860万人感染结核病(TB)，并且其结果导致130万人死亡。在130万与TB有关的死亡中，20％共感染人免疫缺陷病毒(HIV)并且这些病例中的约75％来自非洲。在非洲，TB常常是HIV感染的首先迹象并且是HIV感染患者中死亡的主要原因。在南部非洲发现HIV的最高流行，其也具有最高的TB发生率。准确且有效地诊断TB的困难严重妨碍了疾病的消除。目前的诊断测试准确检测人中的早期TB仍然是一个挑战。TB的误诊和晚期诊断导致感染患者中的死亡率增加。在发展中国家，影响新的TB诊断的发展和实施的主要障碍之一是其高成本。
分枝菌酸抗体实时抑制(Mycolic acid Antibodies Real-Time Inhibition，MARTI)测试具有准确检测作为活动性TB的生物标志物的低亲和力患者抗分枝菌酸抗体的能力。MARTI测试是由University of Pretoria在2005年获得专利权(US 7851166)。最初，MARTI测试的验证是在IAsys波导亲和力生物传感器上进行的。这不是一种用户友好的或经济的技术。在后来开发的样式中，MARTI测试与ESPRIT表面等离子体共振(surface plasmonresonance，SPR)生物传感器一起使用。ESPRIT和IAsys生物传感器二者均是瞬逝场质量检测装置，其使用吸收池系统(cuvette system)而不是流动池(flow cell)。在SPR生物传感器上进行MARTI测试的缺点是其重型仪器和与SPR有关的维护成本。
标准ELISA免疫测定是一种低效的TB诊断工具，由于其固有特性在于仅记录最高亲和力抗体与血清中抗原的结合。这是因为ELISA中需要的洗涤步骤，其除去了低亲和力抗体。与ELISA测定相比，MARTI测试具有提高的灵敏度和特异性，因为其在样品与固定化分枝菌酸抗原接触之后不需要洗涤步骤。因此，MARTI测试的一个主要优点是其可以灵敏地检测低亲和力抗体，从而使其成为更准确的诊断测试。
电阻抗谱(electrical impedance spectroscopy，EIS)比SPR瞬逝场装置更适合作为MARTI中抗体结合检测的转导技术，因为其不需要重型仪器。信号处理现今可以通过手持式、电池供电的恒电位仪进行。这样的恒电位仪基本上是免维护的，与需要昂贵的年度维护的SPR不同。即时检验(point-of-care)TB诊断装置必须是可负担得起的、准确的、使用简单、需要最少量的生物样品、灵敏的和特异的、易于读取、能够快速诊断(每天至少20次测试)并能够生成同一天的结果。用可负担得起的一次性电极，EIS上的MARTI测试具有满足这些要求的潜力。
分枝菌酸(Mycolic acid，MA)是在分枝杆菌属(Mycobacterium)物种的外细胞壁中发现的主要脂质，并且已显示其在病原体的毒力中起关键作用并具有免疫原性。已将MA抗原从己烷溶液固定到包被有十八烷基硫醇(octadecanethiol，ODT)的耐溶剂丝网印刷电极(screen-printed electrode，SPE)上。然而，这种抗原固定化方法在电极和MA上可再现性差并且是不经济的。因此必须确定耐溶剂电极上MA抗原固定化的更加可再现且可负担得起的方案。本发明解决了该问题。
本发明进一步提供了并入MA的稳定的悬浮纳米颗粒，所述MA用于呈现以进行抗体结合抑制。这解决了现存的MARTI经历的不稳定脂质体载体的问题。目前的纳米颗粒载体对于氧化是稳定的、具有增加的保存期限并且可容易悬浮，从而改进了MARTI测试。
根据本发明的第一方面，提供了制备抗体生物标志物捕获载体的方法，所述方法包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到纳米颗粒的外表面上以获得包含分枝菌酸抗原的纳米颗粒，其中所述分枝菌酸抗原作为抗体生物标志物捕获剂呈现。
纳米颗粒的尺寸可为0.2μm或更小。
纳米颗粒可为聚乳酸-乙醇酸共聚物。
根据本发明的第二方面，提供了适用于诊断结核病的抗体生物标志物捕获载体，所述抗体生物标志物捕获载体包含纳米颗粒，所述纳米颗粒在其外表面上具有作为生物标志物捕获剂存在的结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸。
根据本发明的第三方面，提供了活化适用于诊断结核病的耐溶剂丝网印刷电极的方法，所述方法包括化学抛光所述电极和机械抛光所述电极二者，从而获得活化的耐溶剂丝网印刷电极。
电极可为金耐溶剂丝网印刷电极。电极可为一次性电极。
Piranha酸可用于电极的化学抛光。氧化铝可用于电极的机械抛光。
可首先实现化学抛光，随后实现机械抛光。
本发明延伸至当通过本发明的第三方面的方法活化时的活化的丝网印刷电极。
根据本发明的第四方面，提供了将分枝菌酸抗原固定在适用于诊断结核病的活化的丝网印刷电极表面上的方法，所述方法包括：
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在二甲基甲酰胺中以形成分枝菌酸-二甲基甲酰胺溶液；以及
将活化的丝网印刷电极与所述分枝菌酸-二甲基甲酰胺溶液一起孵育，以允许分枝菌酸抗原吸附到活化的电极上，以产生包含固定化分枝菌酸抗原的丝网印刷电极。
电极可为金丝网印刷电极。电极可为耐溶剂的。电极可为一次性电极。
电极可在孵育期后洗涤。孵育期可为约一个小时。电极可在去离子水中洗涤。
活化的丝网印刷电极可以是通过本发明的第三方面的方法获得的电极。
根据本发明的第五方面，提供了诊断结核病的方法，其包括：
使用分枝菌酸抗体实时抑制测试，采用电化学阻抗谱来诊断来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品中活动性结核病的存在；
使用根据本发明的第二方面的抗体生物标志物捕获载体；和/或
使用通过本发明的第三方面的方法获得的活化的耐溶剂丝网印刷电极；和/或
使用通过本发明的第四方面的方法获得的包含固定化分枝菌酸抗原的丝网印刷电极。
分枝菌酸抗体实时抑制测试可以是US 7851166的分枝菌酸抗体实时抑制测试，因此其通过引用并入本文。
根据本发明的第六方面，提供了诊断结核病的方法，所述方法包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到纳米颗粒的外表面上以获得包含分枝菌酸抗原的纳米颗粒，其中所述分枝菌酸抗原作为生物标志物捕获剂存在；
活化丝网印刷电极；
用硫醇化疏水性物质包被活化的丝网印刷电极；
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在溶剂中以形成分枝菌酸溶液；
使分枝菌酸抗原从分枝菌酸溶液固定到活化的丝网印刷电极上；
将来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品与包含分枝菌酸的纳米颗粒一起孵育以产生对照样品；
将来自所述患者的样品与不包含分枝菌酸的纳米颗粒一起孵育以产生测试样品；
使对照样品和测试样品与包含固定化分枝菌酸抗原的所述活化的丝网印刷电极或包含固定化分枝菌酸抗原的活化的丝网印刷电极接触，以允许各样品中的任何生物标志物抗分枝菌酸抗体与固定化分枝菌酸抗原结合；以及
使用电化学阻抗谱来测量各样品中抗体与固定化抗原结合的程度，
其中与测试样品相比对照样品中的任何较少的结合是对照样品中生物标志物抗分枝菌酸抗体与固定化抗原结合的结果，并且指示患者中的活动性结核病。
纳米颗粒可为聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。
硫醇化疏水性物质可为十八烷基硫醇。
丝网印刷电极可为金丝网印刷电极。丝网印刷电极可为耐溶剂的。丝网印刷电极可为一次性电极。
丝网印刷电极的活化可通过化学和机械抛光所述电极来进行。可首先实现化学抛光，随后实现机械抛光。
酸可用于丝网印刷电极的化学抛光。酸可为piranha酸。氧化铝可用于丝网印刷电极的机械抛光。
分枝菌酸溶解于其中形成分枝菌酸溶液的溶剂可为二甲基甲酰胺。
丝网印刷电极可暴露于分枝菌酸溶液约1小时的时间。
根据本发明的第七方面，提供了诊断结核病的方法，其包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到颗粒上；
通过化学抛光丝网印刷电极和机械抛光丝网印刷电极二者来活化所述电极；
用硫醇化疏水性物质包被所述丝网印刷电极；
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在溶剂中以形成分枝菌酸溶液；
使分枝菌酸抗原从分枝菌酸溶液固定到活化的丝网印刷电极上；
将来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品与包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生对照样品；
将来自所述患者的样品与不包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生测试样品；
使对照样品和测试样品与包含固定化分枝菌酸抗原的所述活化的丝网印刷电极或包含固定化分枝菌酸抗原的活化的丝网印刷电极接触，以允许各样品中的任何生物标志物抗分枝菌酸抗体与固定化分枝菌酸抗原结合；以及
使用电化学阻抗谱来测量各样品中抗体与固定化抗原结合的程度，
其中与测试样品相比对照样品中的任何较少的结合是对照样品中分枝菌酸抗体与固定化抗原结合的结果，并且指示所述患者中的活动性结核病。
可首先实现化学抛光，随后实现机械抛光。
酸可用于丝网印刷电极的化学抛光。酸可为piranha酸。氧化铝可用于丝网印刷电极的机械抛光。
颗粒可为如前所述的纳米颗粒。
分枝菌酸溶解于其中形成分枝菌酸溶液的溶剂可为二甲基甲酰胺。
丝网印刷电极可暴露于分枝菌酸溶液约1小时的时间。
纳米颗粒可为聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。
硫醇化疏水性物质可为十八烷基硫醇。
丝网印刷电极可为金丝网印刷电极。
丝网印刷电极可为耐溶剂的。丝网印刷电极可为一次性电极。
根据本发明的第八方面，提供了诊断结核病的方法，其包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到颗粒上；
活化丝网印刷电极；
用硫醇化疏水性物质包被所述丝网印刷电极；
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在二甲基甲酰胺中以形成分枝菌酸溶液；
使分枝菌酸抗原从分枝菌酸溶液固定到活化的丝网印刷电极上；
将来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品与包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生对照样品；
将来自所述患者的样品与不包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生测试样品；
使对照样品和测试样品与包含固定化分枝菌酸抗原的所述活化的丝网印刷电极或包含固定化分枝菌酸抗原的活化的丝网印刷电极接触，以允许各样品中的任何分枝菌酸抗体与固定化分枝菌酸抗原结合；以及
使用电化学阻抗谱来测量各样品中抗体与固定化抗原结合的程度，
其中与测试样品相比对照样品中的任何较少的结合是对照样品中分枝菌酸抗体与固定化抗原结合的结果，并且指示所述患者中的活动性结核。
活化的丝网印刷电极可暴露于分枝菌酸溶液约1小时的时间。
颗粒可为如前所述的纳米颗粒。
丝网印刷电极的活化可通过化学和机械抛光所述电极来进行。可首先实现化学抛光，随后实现机械抛光。
酸可用于丝网印刷电极的化学抛光。酸可为piranha酸。氧化铝可用于丝网印刷电极的机械抛光。
纳米颗粒可为聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)。
硫醇化疏水性物质可为十八烷基硫醇。
丝网印刷电极可为金丝网印刷电极。
丝网印刷电极可为耐溶剂的。丝网印刷电极可为一次性电极。
根据本发明的第九方面，提供了即时检验结核病诊断试剂盒，其包括：a)包含干分枝菌酸抗原包被的纳米颗粒的第一对照样品容器；b)包含相同量或数量的未包被的纳米颗粒的第二测试样品容器；和c)单独包装的、活化的、耐有机溶剂、分枝菌酸包被的丝网印刷电极。
试剂盒可包含受过电化学培训的人员已知的用于测量电阻抗的标准设备，并且所述试剂盒可包含计算机控制的射流泵，所述射流泵向具有进样器的多阀供料，并与管道连接以向夹在丝网印刷电极夹持器中之电极的电极表面供料或由其吸出。电极可与便携式或台式恒电位仪电连接，所述恒电位仪配备有软件以累积和解释来自电极的电化学信号，计算电阻抗值并将结果显示在Nyquist(Nyquist)图中。
容器通常可各自为管。
现在将参考下文的实施例和附图更详细地描述本发明。
在附图中：
图1示出了对于实施例通过SPR MARTI确定的TB阳性(BM12)和TB阴性(JS09)人血清样品的抑制百分比的统计分析；误差条表示n＝3的平均值的标准误差；
图2示出了对于实施例不同抛光的金丝网印刷电极的循环伏安谱：A)用0.5M H2SO4进行电化学抛光；B)用氧化铝进行机械抛光；C)用piranha酸进行化学抛光；D)电化学和机械抛光的组合；E)化学和机械抛光的组合。扫描速率为50mVs-1；
图3示出了对于实施例在应用不同的抛光方法之后的电极表面的循环伏安法。扫描速率为50mVs-1；
图4示出了对于实施例在抛光之前和之后的金电极表面的扫描电子显微术分析。A)电化学和机械抛光；B)化学和机械抛光；C)机械抛光(温和地抛光)；D)机械抛光(强烈抛光)；
图5示出了对于实施例在ODT包被的金SPE上包被固定化MA抗原之前和之后的抛光电极的Nyquist图；
图6示出了对于实施例在MA抗原固定在“化学和机械组合”抛光的SPE上之前和之后的来自电阻抗测量的Rct值的统计分析；误差条表示n＝3的标准偏差；
图7示出了对于实施例在ODT包被的金SPE上包被固定化MA抗原之前和之后的抛光电极的Nyquist图，作为使用失效的二甲基甲酰胺在SPE上包被MA抗原的负面影响的证明；
图8A示出了对于实施例用改进的原型基于EIS的MARTI测试来检测TB阳性人血清(BM12)中的抗MA抗体的Nyquist图结果；
图8B示出了对于实施例用改进的原型基于EIS的MARTI测试来检测TB阴性人血清(JS09)中的抗MA抗体的Nyquist图结果；以及
图9示出了对于实施例使用金SPE的TB阳性(BM12)和TB阴性(JS09)患者血清的原型基于EIS的MARTI测试的NyquistΔRct值差异；误差条表示n＝5的平均值的标准误差。
实施例
材料和方法
材料
除非另有说明，否则所有试剂均为至少99.5％纯并且购自Sigma-Aldrich或Merck。来自Elga water system(Labotec，南非)的蒸馏去离子水(ddd H2O)用于制备试剂和漂洗SPE。使用的所有dddH2O的电阻率为18.2MΩ.cm。
使血样凝结4小时，将血清吸入到洁净的1.5mL eppendorf管中，在4℃下离心以除去红细胞，将血清(35μL)等分到600μL eppendorf管中并在-70℃下储存直至使用。
20X磷酸盐缓冲盐水
为了制备溶液，将4g KCl、21g Na2HPO4、160g NaCl和4g KH2PO4与850mL ddd H2O混合，然后用ddd H2O补充至1升。
1X PBS
为了制备溶液，将50mL 20X PBS与850mL ddd H2O(pH为7.4)混合，用ddd H2O补充至1L并通过0.2μm醋酸纤维素过滤器(Sartorius Stedium Biotech，德国)过滤。
1X PBS/AE
为了制备溶液，将50mL 20X PBS、0.380g Na2EDTA和0.250g NaN3与850mL ddd H2O混合，用1M盐酸调节至pH 7.4，然后用ddd H2O补充至1L并通过0.2μm醋酸纤维素过滤器过滤。使用的所有ddd H2O的电阻率为18.2MΩ.cm。
聚乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒溶液
称出质量为1mg的聚乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒(含有MA或小含MA)，并使其悬浮在450μL 1X PBS/AE中。
用于制备分枝菌酸聚乳酸-乙醇酸共聚物(MA-PLGA)的分枝菌酸(Sigma-Aldrich，南非)来源于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(牛品系)。MA-PLGA和PLGA颗粒的尺寸分别为259ηm和338ηm。MA-PLGA和PLGA的ζ电势分别为-7.61mV和-2.5mV。通过MA-PLGA和PLGA的动态光散射确定的多分散指数值分别为0.241和0.265。虽然单分散颗粒的PDI为0，但0.1至0.4的PDI值被认为是中等多分散的。
用于本研究的耐溶剂金SPE购自DropsensTM(Llanera，Asturias，西班牙)。其由金圆盘形工作电极、充当参比电极的银伪电极和金反电极组成。这些电极被丝网印刷在陶瓷基底上。
在1X PBS/AE中制备六氰合铁酸盐(1mM)(氧化还原探针溶液)(Sigma-Aldrich，南非)。使用的所有电极均是耐溶剂金丝网印刷电极(DropsensTM，Llanera，Asturias，西班牙)。
储备分枝菌酸溶液
为了制备MA在氯仿中的1mg/mL储备溶液，将分析级氯仿(180μL)添加到包含MA(1mg)的小瓶中以重构先前等分的MA。
十八烷基硫醇(ODT)溶液
称出ODT(0.1146g)并添加到己烷(4mL)中。将包含ODT溶液的加盖小瓶在Bransonic Model 42水浴超声波仪中于室温下超声5分钟以使ODT(0.1M)完全溶解在己烷中。
用于研究的所有金SPE均为耐溶剂的。对于所有的循环伏安测量和Nyquist图分析，使用Metrohm autolab PGSTAT302N恒电位仪(Utrecht，荷兰)。使用的统计软件是NOVA1.8。在进行任何电化学之前，通过机械抛光(MechanPol)、电化学和机械抛光的组合(E+M)或化学和机械抛光的组合(C+M)对SPE进行抛光。通过在氧化还原探针溶液([Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-)中对每个电极进行5次循环伏安扫描来表征SPE。循环在-0.2V至+0.4V的范围内以50mVs-1的扫描速率进行。
将二甲基甲酰胺(DMF)(99.8％无水，Sigma-Aldrich，南非)递送到200mL琥珀色注射瓶中，用具有中心可撕密封的皱褶橡胶塞密封。当使用DMF时，由于其毒性和对于湿度和氧的不稳定性，因此极其小心。DMF在水中的半衰期为36小时，在空气中为192小时。用连接至10mL无菌注射器的无菌针(LASEC，南非)将DMF从其容器中倒置吸出。
ODT包被
将电极放置在己烷室中并使用滴干法(drop-dry method)用20μL 0.1M ODT-己烷溶液在室温下包被8分钟，以使溶剂完全蒸发。必须小心以确保仅包被包含裸电极表面的区域。将经包被的电极从室中取出并用无水乙醇喷洒两次，并允许在工作台上于室温下干燥，通常不超过5分钟。
将MA-PLGA(1mg)和PLGA(1mg)溶解在氧化还原缓冲剂的单独的小瓶(每个小瓶中450μL)中并涡旋。
标准血清稀释液
将10μL患者血清在90μL氧化还原探针溶液中稀释并轻轻涡旋。
方法
PLGA和MA-PLGA纳米颗粒的配制
将PLGA(100mg)溶解在二氯甲烷(DCM)(6mL)中。将分枝菌酸(1.8mg)溶解在DCM中，涡旋并滴加到PLGA-二氯甲烷溶液中。随后将2％(w/v)聚乙烯醇(在去离子水中2mL)添加到MA-PLGA-二2氯甲烷溶液中。将所得悬浮液以20000转/分钟(rpm)匀化5分钟。将乳液添加到2％(w/v)聚乙烯醇(在去离子水中40mL)中，并以20000rpm匀化5分钟。将乳液在水浴超声波仪中搅拌过夜。将乳液在10℃下以4000g离心10分钟以收集作为大颗粒的沉淀物。移出含有细颗粒的上清液并在10℃下以21000g离心15分钟以收集沉淀物。弃去上清液并将沉淀物分散在3％海藻糖(5mL，在去离子水中的w/v)中并冷冻干燥4天。在Zetasizer Nano ZS(Malvern，UK)上分析颗粒的尺寸和ζ电势。当仅制备PLGA时，除了不添加MA以外，应用相同的步骤。
SPR金盘的包被
将SPR传感器未抛光的金盘(AUTOLAB，荷兰)在已在Bransonic Model 42水浴超声波仪中于室温下进行超声30分钟的0.1M ODT-无水乙醇溶液中放置过夜。用无水乙醇洗涤金盘，使其干燥并放置在含有一滴折射率油的玻璃棱镜上。
表面等离子体共振
SPR的标准MARTI方案(Lemmer等2009)以较小的修改使用。简言之，进行SPR共振倾斜分析(resonance dip analysis)以研究经包被的盘的传感器表面的完整性。设置使用PBS/AE的基线，随后在金盘上添加MA脂质体(50μL)20分钟。随后进行PBS/AE洗涤和皂苷处理以防止非特异性结合。将1/500稀释的血清添加到每个室中的金盘上。使每个室中获得的信号彼此对齐。在室温下进行含有MA-PLGA(50μL)或PLGA(50μL)的1/250稀释的血清的预孵育20分钟。在一个室中添加预孵育的MA-PLGA-血清稀释液(10μL)，在另一个室中添加PLGA-血清稀释液(10μL)并收集结合数据。数据被传送到Microsoft Excel进行评估和统计分析。
机械抛光
将一滴0.05μM氧化铝(BASi Instruments，Indiana，美国)添加到金SPE的传感器表面上，然后将电极在抛光垫上以顺时针和逆时针运动手工抛光30秒。如上详述的，将电极用三次蒸馏水(ddd H2O)清洗并再次用氧化铝进行抛光。然后在超声处理水浴中对SPE进行超声处理2分钟的时间，以除去表面上的任何氧化铝痕迹(Yang等1995)。在此步骤之后，在氧化还原探针溶液([Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-)中对SPE进行功能上的表征。电化学抛光方法与机械抛光的组合
在0.5M硫酸(H2SO4)中对SPE进行电化学预处理，并且在-0.1V至+1.2V的范围内以100mVs-1的扫描速率进行循环。循环伏安法由25个CV扫描组成，其中步进电势为0.00244V。然后将电化学预处理的电极在dddH2O中冲洗，使其在室温下干燥并在氧化还原探针溶液([Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-)中表征。在电化学预处理电极的表征之后，将SPE用dddH2O冲洗，使其在室温下干燥，然后使用如上详述的机械抛光的步骤进行机械预处理。
化学抛光方法和机械抛光的组合
使用热piranha酸(以1∶3v/v比的30％过氧化氢和浓硫酸)进行SPE的化学抛光。piranha酸是一种高度腐蚀性的溶液，因此在使用该酸时必须采取安全预防措施。考虑到酸是放热的，因此piranha酸是新鲜制备的。将SPE浸入热piranha酸中10分钟，用dddH2O彻底冲洗，使其在室温下干燥，并在氧化还原探针溶液([Fe(CN)6]4-/[Fe(CN)6]3-)中进行功能上的表征。在化学预处理电极的表征之后，将SPE用dddH2O冲洗，使其在室温下干燥，然后使用如上详述的机械抛光的步骤进行机械预处理。通过将电极浸入无水乙醇中1小时来减少由于化学抛光而形成的金氧化物。
扫描电子显微术
对于进行的所有显微术检查工作，使用JSM-5800LV扫描显微镜(ThermoScientific)。将导电胶带连接至电极底部的金属表面，并将胶带的其余部分连接至金属板。在四个不同的放大倍率下(500X、2000X、5000X和10000X)下在电极上观察到两个点。与其他放大倍率相比，选择2000X放大倍率以显示从显微术检查获得的结果，因为它提供了金电极表面的整体透视图。
用DMF的分枝菌酸抗原固定到耐溶剂丝网印刷电极上
将DMF(1mL)添加到含有MA(0.5mg)的小瓶中，加热20分钟，涡旋并使其冷却。由所得的MA溶液，将100μL添加到ODT包被的金SPE的金部分上，所述SPE被放置在培养皿中并在室温下孵育1小时。必须足够小心以确保其上放置有SPE的表面是粗整平的。在孵育时间过去之后，在培养皿中添加去离子水(50mL)以快速洗掉SPE上的DMF溶液。将金SPE的边缘在一小叠纸巾上印迹，使其在室温下干燥5分钟，然后在恒电位仪上进行分析。
MA固定化抗原在ODT包被的电极上的抗体抑制研究
根据上述步骤对电极进行抛光，用ODT包被并将MA抗原固定在SPE上。将包含MA-PLGA(300μL)和PLGA(300μL)的氧化还原探针与稀释的血清(20μL)混合并在室温下孵育10分钟。将SPE放置在流通池内并与口连接。将装载样品的注射器的阀位置切换到负载，并将MA-PLGA-血清稀释液(150μL)从样品装载到流管中。将阀位置切换回注射，并且泵以0.05mL/分钟的流速将MA-PLGA-血清稀释液注射到SPE的传感器表面上10分钟。用NOVA 1.8软件进行Nyquist图分析。接着，在将阀位置切换到负载之后，将PLGA-血清稀释液(150μL)从装载样品的出口装载到恒电位仪的流管中。将阀位置切换回注射，并且恒电位泵以0.05mL/分钟的流速将PLGA-血清注射到传感器表面上10分钟。然后用NOVA 1.8软件进行Nyquist图分析。
结果与讨论
作为抗分枝菌酸生物标志物(SPR生物传感器)的呈现载体的聚乳酸-乙醇酸共聚物纳米颗粒
研究了PLGA作为SPR生物传感器上的标准化MARTI测试的MA抑制剂的载体的脂质体的合适替代物(Lemmer等2009)。对TB阳性血清(BM12)和TB阴性血清(JS09)二者进行SPR分析。使用学生t检验进行统计分析。预期结果以对于TB阳性患者血清的受抑制的信号与未受抑制的信号之间的明显差异以及对于TB阴性患者血清的受抑制的信号与未受抑制的信号之间无差异来实现。进行统计分析(假定不等方差的双样本t检验)以确定TB阳性血清样品(BM12)与TB阴性血清样品(JS09)之间是否存在统计学显著性。为了实现这一点，如下所述计算抑制％。
图1中的概要数据表明使用纳米颗粒对TB阳性血清样品的28％抑制。这与Ejoh(2014)报道的数据相当，其报道了使用脂质体对TB阳性血清样品(BM12)的接近27％的抑制。如图1所示，在TB阳性血清样品(BM12)与TB阴性血清样品(JS09)之间存在显著差异，p＜0.05。使用PLGA纳米颗粒作为空载体试剂的SPR结果表明，其不表现出生物标志物抗MA抗体本身的抑制作用。该结果支持了这样的假设：在基于SPR的MARTI测试中，PLGA纳米颗粒可以用于替代脂质体作为MA抗原抑制剂的载体/呈现者。
通过不同电极抛光方法的循环伏安法的定量分析
抛光耐溶剂SPE的目的是去除存在于电极的传感器表面上的溶剂保护层。使用循环伏安法来分析抛光的金SPE的电化学功能。循环伏安测量由5次CV扫描组成，其中设定电势为-0.198V，步进电势为0.00244V。图2显示了所研究的不同抛光方法的循环伏安谱。
如图2A-E所示，在进行任何电极抛光之前，未抛光电极的表面被完全封闭并且是无活性的。在抗原固定化之前需要抛光以活化传感器表面。在抛光之后，出现预期的循环伏安模式，显示出每种类型的抛光方法的分离的氧化和还原峰的可测量的峰值电流(ip)和峰间距(ΔE)。预期用于化学和电化学抛光的强酸会水解覆盖电极表面的保护性聚酯涂层的酯键，并且因此活化电极表面。预期化学或电化学抛光方法将产生比机械手工抛光更可靠的电极活化结果，但发现情况并非如此。
随着反应发生而转移的电子的数量可以由峰电势之间的分离来确定。峰电势之间的分离由以下方程式给出：
ΔEp＝Epa-Epc＝(0.059/n)V
快速单电子转移的理论值是ΔEp＝59mV。在该值处，电子转移处于其峰值。在电极表面上电子转移缓慢的地方峰间距增加(Kissinger&Heineman，1983)。对于可逆的循环伏安法，峰值电流由Randles-Sevcik方程式给出(在25℃下)
ip＝(2.69X 105)n3/2ACD1/2v1/2
其中“n”为电子数，“A”为电极面积(cm2)，“C”为浓度(mol/cm3)，“D”为扩散系数(cm2/s)，v为电势扫描速率(V/s)。Randles-Sevcik方程式描述了扫描速率对峰值电流ip的影响。在更快的电压扫描速率下，ip增加并且与浓度成正比。对于ΔEp＝59毫伏(mV)的快速单电子转移，ipa和ipc的值对于可逆系统应该是相同的(Kissinger&Heineman，1983)。
预期至少一种抛光方法将产生约59mV的峰间距。电化学抛光电极的循环伏安扫描重复是粗略的和差的。电化学抛光电极的峰间距为约300mV(图2A)。金SPE的机械抛光优于电化学抛光。这是基于机械抛光电极的氧化和还原峰高度的幅度。机械抛光电极的循环伏安扫描重复是可重现的和平滑的。机械抛光电极的峰间距为约100mV(图2B)。
基于其峰高度的幅度及其CV扫描重复的平滑度，化学抛光(图2C)、“电化学和机械”抛光的组合(图2D)以及“化学和机械”抛光的组合(图2E)也改善了传感器表面。化学、“电化学和机械组合”以及“化学和机械组合”抛光电极的峰间距分别为约120mV、100mV和75mV。化学和机械组合抛光电极给出了接近理论值59mV的最接近的峰间距值(75mV)。
所探究的所有五种类型的抛光方法均叠加在一个循环伏安谱中(图3)。从图3中，基于其峰值电流的高度、峰间距和基于扫描重复的稳定性来选择金SPE的最佳的三种抛光方法。最佳的抛光方法是机械抛光(M)、“电化学和机械抛光”的组合(E+M)以及“化学和机械抛光”的组合(C+M)。这三种抛光方法产生最高和最低的氧化峰和还原峰，以及最接近59mV的峰间距。
表1
机械、“电化学和机械”以及“化学和机械”抛光的氧化还原峰高度的变异系数。n＝5
氧化峰 还原峰
抛光方法 变异系数(n＝5) 变异系数(n＝5)
机械(M) 7.68％ 12.35％
电化学和机械(E+M) 2.72％ 5.51％
化学和机械(C+M) 1.10％ 1.02％
对于每种抛光方法的氧化峰高度和还原峰高度二者计算最佳抛光方法的变异系数。抛光方法在5个单独的电极上重复，n＝5。变异系数越小，抛光方法越稳定。“化学和机械”抛光的组合显示出最小的变异系数，即约1％。
抛光电极的扫描电子显微术分析
扫描电子显微术(SEM)分析在用三种最佳抛光方法处理的SPE的传感器表面上进行。这是为了确定抛光方法如何改变电极表面。图4显示了不同抛光的SPE的图片。在扫描电子显微镜上在抛光之前和之后比较SPE。图4左侧的所有图片均是抛光前的SPE，右侧的图片是抛光后的SPE。
如果机械抛光温和地进行(图4A、B、C)，则电极表面的SEM分析显示在进行不同抛光之前和之后电极表面无显著差异。金电极的清洁不会改变传感器表面的形态，因此不会对电极表面造成损害。然而，重要的是应注意温和机械抛光与强烈机械抛光的效果(图4C和D)。如扫描电子显微镜上所示，强烈机械抛光使金电极的传感器表面碎裂(图4D)。然而，温和机械抛光保持了传感器表面的形态。结构稳定的电极表面对于成功的抗原固定化是至关重要的。因此，当电极被机械抛光时，进行温和的抛光。
考虑到图4和表1，确定“化学和机械抛光”的组合是用于金SPE的最佳抛光方法。因此其被选作抛光金SPE的优选的抛光方法。
MA抗原由DMF固定到金SPE上
使用DMF作为溶剂，MA的抗原固定化在耐溶剂SPE的ODT包被的传感器表面上进行。研究DMF作为MA的溶剂，因为其溶解MA并具有缓慢的蒸发速率。一篇文献报道提出，MA从作为溶剂的DMF固定到金电极上进行48小时(Mathebula等2009)。然而，对较长的孵育时间未提供理由。由于溶剂在暴露于空气时的不稳定性，因此48小时孵育对于制造用于诊断的电极并不是最佳的。假定使用48小时，因为DMF常用作肽的溶剂，所述肽比MA更容易溶解在DMF中。因此，预期肽可能需要长得多的时间以从理想的溶质-溶剂缔合附着到制备的表面上。然而，MA本质上是蜡质的且极其疏水的，并且因此更难溶于DMF中。
因此假设1小时足以使MA从DMF移动并与疏水性ODT包被的传感器表面结合。如上所述对电极进行抛光，用ODT包被，并在培养皿中将MA固定到电极表面上1小时。使用Nyquist图来量化ODT包被的金SPE上的固定化MA抗原的量。使用假定不等方差的双样本t检验进行统计分析。
固定化MA抗原的Nyquist图分析显示电荷转移电阻增加，这指示结合发生在耐溶剂金SPE上(图5)。进行统计分析(假定不等方差的双样本t检验)以确定金SPE上的固定化MA抗原与金SPE上的未固定化抗原之间是否存在显著差异。为了实现这一点，由MA抗原固定化和无抗原固定化二者的电极的Nyquist图来计算电荷转移电阻(Rct)(图5)。
发现ODT包被的金SPE上的来自DMF的固定化MA抗原的分析是可重现的且是统计上显著的，p＜0.05(图6)。固定化MA抗原记录约为无抗原的电极的结合信号的三倍的结合信号。随着每次连续的结合，各Nyquist图中的“尾长”减小。这被称为Warburg扩散并且其是由当电极表面的层厚度随着每次连续添加而增加时扩散减少引起的。
在暴露于空气之后DMF氧化并且具有五天的半衰期。在其半衰期之后使用DMF对MA抗原固定在ODT包被的金SPE上具有负面影响。如图7所示，固定化抗原的Nyquist图分析揭示了不稳定性，如可以通过图中的断裂所示。因此强烈建议，仅新鲜蒸馏或密封的DMF应当用于用MA包被SPE。
用患者血清样品验证改进的MARTI测试
迄今为止，在本发明中已经解决向用于诊断TB的可行的、即时检验、基于EIS的MARTI测试中的三个挑战：用稳定的纳米颗粒代替脂质体MA载体进行抗体抑制；用于抗原包被的耐溶剂SPE的可靠且有效的活化；以及活化的电极的标准化MA抗原包被的可靠且经济的方式。这为原型MARTI测定装置的最终组装提供了基础，其待用TB阳性和TB阴性人患者血清进行测试以确定原型MARTI测定是否可以令人信服地区分它们。将来自TB阳性患者(BM12)和TB阴性人个体(JS09)的血清样品与PLGA纳米颗粒(PLGA-NP)和MA-PLGA-NP以及在两个新近活化且MA抗原包被的SPE上用EIS检测的抗MA生物标志物抗体一起预孵育。据报道，在MA抗原包被的SPE上使用皂苷作为封闭剂使Rct发生大的变化，这大大增加了对电荷转移的电阻并且阻止检测到TB阳性和TB阴性血清之间的差异(Baumeister，2012)。因此从EIS实验中省略了皂苷封闭。
Nyquist图分析用于确定抗体与固定化抗原的结合。使用统计分析(假定不等方差的双样本t检验)来确定TB阳性和TB阴性结果之间的信号差异的统计显著性(图8A和8B)。
Rct充当EIS结果中分析的信号，因为其提供了关于抗体与金SPE上的固定化MA抗原结合的信息。通过从Nyquist图的半圆部分选择数据点来手动获得Rct。计算机软件(NOVA)自动外推半圆直至其截断x轴以产生Rct值。对于TB阳性曲线，预期受抑制的血清和未受抑制的血清的Nyquist图之间有明显差异，并且实现了这一点(图8A)。对于TB阴性曲线，预期受抑制的血清和未受抑制的血清的Nyquist图之间几乎没有差异，并且如此表现了这一点(图8B)。
Nyquist图显示，血清样品的PLGA-NP预孵育不妨碍数据采集以确定TB阳性和TB阴性人血清样品之间的曲线的差异。如图8A和8B以及表2所示，随着MARTI测试的每个连续步骤进行，Rct增加，但与TB阴性血清(ΔRct＝0.515)相比，当分析TB阳性人血清样品(ΔRct＝1.789)时，在受抑制的血清和未受抑制的血清之间存在较大的差异。ΔRct值是抗体与电极表面上的抗原结合的指示。在SPR生物传感器上的MARTI测试分析中，使用MA抗原受抑制的和未受抑制的血清稀释液之间抗体与传感器表面固定化MA结合的抑制百分比作为确定TB阳性或阴性诊断的信号结果(Lemmer等2009)。
然而，对于基于EIS的MARTI，由于由制造期间电极表面的粗糙度引起的电极表面的不均匀性，因此使用了受抑制的和未受抑制的血清稀释液之间的绝对Rct值差异(ΔRct)。这些不均匀性影响溶液体电阻(Barsoukov&MacDonald，2005)，并且因此解释了不同电极的相同未受抑制的血清样品的不同的ΔRct值。这对于TB阴性样品低至2.307和高至6.373(表2)，尽管当比较相同电极的受抑制和未受抑制的血清样品之间的数据时，ΔRct仅变化0.034。
与TB阴性个体相比，TB阳性患者的较大的ΔRct值是应当测试统计显著性的重要MARTI结果。如果显著，则原型可能被认为是功能性的。因此，对于每个样品类型，用TB阳性和TB阴性人血清样品进行的测试在五个不同的电极上重复五次。由表2中的数据，进行统计分析以确定改进的原型MARTI测试是否可以令人信服地区分TB阳性人血清与TB阴性人血清。图9中的概要数据表明TB阳性血清(1.511±0.222)与TB阴性血清(0.528±0.039)之间的信号的1kΩ的近似差异。在P＜0.0005的情况下，可以观察到TB阳性血清和TB阴性血清的ΔRct值的约三倍差异的统计显著性。由此，可以确信地得出结论，EIS MARTI装置原型是功能性的并且在验证测试中可供使用。
表2
区分TB阳性和TB阴性人血清样品的原型基于EIS的MARTI测试的重现性
讨论
作为抗MA生物标志物(SPR生物传感器)的呈现载体的PLGA纳米颗粒
如由Lemmer等(2009)描述的用于TB诊断的MARTI测试使用脂质体作为MA的载体系统，然而脂质体具有许多缺点，例如随时间差的稳定性、磷脂组分在暴露于空气时氧化以及在每次使用之前用于新近制备脂质体的复杂尖端超声波仪的可用性。脂质体通常通过胆固醇来稳定，但由于患者抗MA抗体与胆固醇的交叉反应性以及普遍存在的抗胆固醇抗体与MA的交叉反应性(Benadie等2008)，因此这在MARTI中必须避免。先前用基于SPR的MARTI测试(Lemmer等2009)证明的这些限制同样适用于基于EIS的MARTI测试，并妨碍将测试用作即时检验诊断装置。
先前与MARTI测试一起使用的脂质体为1μm尺寸且不包含胆固醇。最近，甾醇修饰的脂质(SML)(特别是磷脂酰胆碱)被用于稳定用于该应用的脂质体而不会负面地影响MARTI测试的结果。在SML中，胆固醇部分共价嵌入到磷脂的酰基链中(Baumeister，2012)。磷脂酰胆碱(PC)脂质体中游离胆固醇的存在降低了亲水-亲油平衡值。亲水-亲油平衡值是亲水性部分的尺寸和分子的亲脂性部分之间的相互作用强度的函数。亲水-亲油平衡值的降低导致脂质体的弯曲表面的减少，换言之，更大的尺寸。已经表明，向脂质体中添加MA减少PC脂质体的平均尺寸(Baumeister，2012)。在已经研究的四种甾醇修饰的脂质(PChcPC、PChemsPC、OChemsPC和DChemsPC)中，显示1-棕榈酰基-2-胆甾醇基羰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(PChcPC)以最具有抗原性的方式呈现MA(与在添加MA时其尺寸收缩的倾向相关的特性)。这表明，脂质体的更弯曲的表面使得MA对于在TB阳性患者中作为活性TB生物标志物流行的抗MA抗体携带更多的抗原性。
在此，显示脂质体可以用作为用于MARTI的抗体抑制步骤的更可负担得起的、有效且稳定的MA抗原呈现颗粒的PLGA纳米颗粒替代。通过高g力离心获得小的(MA)-PLGA颗粒(0.2μm)。在先前的实验中，需要过滤纳米颗粒以获得SPR的有用的结果。因此，可以确信地预期，如Baumeister(2012)使用SML-脂质体所发现的，较小的纳米颗粒尺寸对于较好的抗原性可为优选的。PLGA纳米颗粒比脂质体更适合作为MA的有效载体系统，因为脂质体在制备后16小时氧化，但据报道即使在3个月之后PLGA-NP也保持稳定(Holzer等2009)。
用于MARTI测试的电极抛光方法的分析
用于MARTI测试的不耐溶剂的金SPE的使用不能区分TB阳性患者血清和TB阴性患者血清(Baumeister，2012)。这是由于有机溶剂在处理中剥离了电极的绝缘层并污染了传感器表面。使用耐溶剂的SPE，注意到需要抛光，因为需要去除覆盖传感器表面的耐溶剂材料。这导致Baumeister试图对耐溶剂金SPE进行温和的机械抛光。尽管在SPE的机械抛光之后获得了较好的结果，但在此过程中弃去了相当多电极(Baumeister，2012)。因此抛光过程需要被标准化。
发现“化学和机械”抛光的组合是可以用于去除传感器表面上的耐溶剂膜的最适合的方法。用于化学抛光电极的Piranha酸从金电极表面上除去所有聚酯有机污染物。已知在金的Piranha酸抛光后形成金氧化物层。然而，使用Piranha酸作为金SPE的化学抛光剂有效地清洁电极表面并增强电催化活性。金氧化物的存在不利地影响自组装单层(SAM)的形成。金氧化物(其为有效的氧化剂)是高度不稳定的并且可以通过将电极浸入无水乙醇中来减少。
化学抛光的SPE的机械抛光进一步增强了氧化还原峰高度的幅度。使用氧化铝对电极进行机械抛光是电化学中广泛使用的最常见抛光方法之一。氧化铝(铝(III)氧化物)是由于其硬度和稳定性而通常用于生产铝金属的化合物。用氧化铝对SPE进行机械抛光大大增加了金电极的表面积，并进一步减少了甚至在乙醇浸渍之后仍存在的金氧化物。在“化学和机械”抛光的组合后金SPE表面的SEM分析显示对电极表面几乎不造成损害。基于获得的循环伏安法结果，在“化学和机械”抛光的组合后，在阴极和阳极峰中存在高的峰值电流，以及约60mV的峰间距。
Subramanian&Lakshminarayanan(1999)报道了通过使用不同颗粒尺寸的氧化铝(1μm、0.3μm和0.05μm)的机械抛光的效果。使用扫描隧道显微术，他们发现，随着氧化铝的颗粒尺寸的减小，从表面的鸟瞰图，表面看起来更光滑。使用0.05μm氧化铝的机械预处理的电极的SEM分析显示，如果电极被温和地抛光，则对金SPE几乎没有损害。
在公共领域中可获得的关于耐溶剂SPE的信息是有限的，并且在耐溶剂SPE的抛光方面尚无已发表的文献。因此，迄今为止，还没有展示抛光耐溶剂金SPE的标准化方法的已发表的成果。59mV的理论最佳还原/氧化峰间距近似于化学和机械组合抛光的SPE，由此将标准偏差改进为约1％。清洁且活化的金表面对于抗原固定化至关重要。
MA抗原固定到ODT包被的SPE上
通过在1小时内使MA从DMF溶液吸附到活化的SPE来实现MA抗原固定到预抛光的耐溶剂金SPE上。Mathebula等(2009)使用DMF作为MA的溶剂以将MA吸附到金电极上用于抗体检测。文献工作报道了使DMF中的蛋白质吸附到固体表面上的约10小时孵育期(Liu等2004；Xu等2006)以及使PBS中的蛋白质吸附到电极表面上的42小时孵育期(Ciobanu等2011)。Liu等(2004)报道了血红素蛋白从DMF吸附到热解石墨电极上。不清楚为什么Mathebula等(2009)选择48小时作为MA从DMF吸附到金电极上的孵育时间。
本发明已经确定，MA从DMF吸附到ODT包被的耐溶剂SPE上的1小时孵育期对于成功的抗原固定化是足够的和最佳的。
用于TB诊断的原型基于EIS的MARTI测试
竞争性免疫测定法例如MARTI提供测量针对人和动物二者中的一系列抗原的抗体应答的可靠且灵敏的生物测定(Li等2001)。当抗体的结合由于交叉反应性而复杂并且当两种抗体不能结合在单个分子上时，主要使用竞争性免疫测定法。受抑制的反应物的测量提供了关于抑制程度的信息。抑制程度是未知事物的活性的指示。在MARTI测定中，与MA交叉反应的普遍存在的抗胆固醇抗体被稀释，并且这使得MA抗原能够通过竞争性结合抑制免疫测定法被抗体有效地检测。
Mathebula等(2009年)和Ozoemena等(2010)首先使用电化学阻抗原理提供了抗MA抗体检测原理的证据。然而，他们的方法包括血清孵育后的洗涤步骤，并且这可以减少可能存在于活性TB患者中的低亲和力抗MA抗体的检测。Baumeister(2012)通过在一次性电极上应用具有EIS的MARTI测试证明了TB诊断的可行性。然而，基于EIS的MARTI测试在为可靠的即时检验诊断方面仍然存在一些障碍，这包括MA抗原固定化的标准化、重现性、脂质体稳定和溶剂相容性。
出乎意料地发现本发明提供了将Baumeister(2012)的工作推进到可行的即时检验基于EIS的MARTI TB诊断仍然缺乏的三个核心要素。这些核心要素是(1)耐溶剂SPE的活化、(2)生物传感器表面上的抗原固定化的标准化和(3)为抗体抑制步骤的MA呈现提供稳定的悬浮颗粒。在克服所有这些障碍后，测试现在已准备好进行验证和最终临床试验。
WHO要求理想的即时检验诊断测试应当符合ASSURED标准(Peeling等2006)。首字母缩写代表：(A)可负担得起、(S)灵敏、(S)特异性、(U)用户友好、(R)快速和稳健、(E)无设备和(D)可交付。这要求诊断测试应当不需要重型仪器、容易使用并且应当优选为一次性的。可以添加到ASSURED标准中的理想的即时检验诊断测试的另一个期望特性是“不受HIV共感染的影响”。因此理想的TB诊断测试最好应当满足首字母缩写ASSURED-N。使用本发明中应用的方法，改进的MARTI测试具有满足TB即时检验诊断测试的ASSURED-N标准的潜力。
参考文献
Barsoukov E，Macdonald JR(2005).Impedance spectroscopy：theory，experiment，and applications(2ndedition)John Wiley&Sons Inc.(USA).
Baumeister CR(2012).Electrochemical impedance spectroscopy andsurface plasmon resonance for diagnostic antibody detection.MScresearch.University of Pretoria，Pretoria.
Benadie Y，Deysel M，Siko DGR，Roberts VV，Van Wyngaardt S，Thanyani ST，Sekanka G，Ten Bokum AMC，Collett LA，Grooten J，Baird MS，Verschoor JA(2008).Cholesteroid nature of free mycolic acids from M.tuberculosis.Chemistry andPhysics of Lipids 152：95-103.
Ciobanu C，Gradinaru LM，Gradinaru RV，Drobota M，Vlad S(2011).Bovineserum albumin adsorption onto UV-activated green polyurethane surface.DigestJournal of Ejoh VE(2014).Requirements for accurate biosensor detction ofanti-lipid biomarker antibodies in active TB.MSc research.University ofPretoria，Pretoria.
Holzer M，Vogel V，W，Schwartz D，Haase W，Langer K(2009)Physico-chemical characterisation of PLGA nanoparticles after freeze-drying andstorage.European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 72：428-437.
Kissinger PT，Heineman WR(1983).Cyclic voltammetry.Journal of ChemicalEducation 60：702-706.
Lawn SD，Kerkhoff AD，Vogt M，Wood R(2012).Diagnostic accutacy of a low-cost，urine antigen，point-of-care screening assay for HIV-associated pulmonarytuberculosis before antiretroviral therapy：a descriptive study.The LancetInfectious Diseases 12：201-209.
Lemmer Y，Thanyani ST，Very PJ，Driver CHS，Venter L，Van Wyngaardt S，TenBokum AMC，Ozoemena KI，Pilcher LA，Fernig DG，Stoltz AC，Swai HS，Verschoor JA(2009).Chapter 5：Detection of antimycolic acid antibodies by liposomalbiosensors.Methods in Enzymology 464：79-104.
Li H，McGuire TC，Muller-Doblies UU，Crawford TB(2001).A simpler，moresensitive competition enzyme-linked immunosorbent assay for detection ofantibody to malignant catarrhal fever viruses.Journal of VeterinaryDiagnostic Investigation 13：361-364.
Liu HH，Tian ZQ，Lu ZX，Zhang ZL，Zhang M，Pang DW(2004).Directelectrochemistry and electrocatalysis of heme-proteins antrapped in agarosehydrogel films.Biosensors and Bioelectronics 20：294-304.
Mathebula NS，Pillay J，Toschi G，Verschoor JA，Ozoemena KI(2009).Recognition of anti-mycolic acid antibody at self-assembled mycolic acidantigens on a gold electrode：a potential impedimetric immunosensing platformfor actiye tuberculosis.Chemical Communications 23：3345-3347.
Ozoemena KI，Mathebula NS，Pillay J，Toschi G，Verschoor JA(2010).Electron transfer dynamics across self-assembled N-(2-mercaptoethyl)octadecanamide/mycolic acid layers：impedimetric insights into the structuralintegrity and interaction with anti-mycolic acid antibodies.PhysicalChemistry Chemical Physics 12：345-357.
Peeling RW，Holmes KK，Mabey D，Ronald A(2006).Rapid tests for sexuallytransmitted infections(STIs)：the way forward.Sexually Transmitted Infections82 Suppl 5：v1-v6.
Subramanian R，Lakshminarayanan V(1999).Effect of surface roughness onthe self-assembly of octadecanethiol monolayer onto polycrystalline noblemetal surfaces.Current Science 76：665-669.
Xu Y，Wang F，Chen X，Hu S(2006).Direct electrochemistry andelectrocatalysis of heme-protein based on N，N-dimethylformamide filmelectrode.Talanta 70：651-655.

Claims (31)

1.制备适用于诊断结核病的抗体生物标志物捕获载体的方法，所述方法包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到纳米颗粒的外表面上以获得包含分枝菌酸抗原的纳米颗粒，其中所述分枝菌酸抗原作为抗体生物标志物捕获剂呈现。
2.权利要求1所述的方法，其中所述纳米颗粒的尺寸为0.2μm或更小。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述纳米颗粒包含聚乳酸-乙醇酸共聚物。
4.适用于诊断结核病的抗体生物标志物捕获载体，所述抗体生物标志物捕获载体包含纳米颗粒，所述纳米颗粒在其外表面上具有作为生物标志物捕获剂呈现的结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸。
5.权利要求4所述的抗体生物标志物捕获载体，其中所述纳米颗粒的尺寸为0.2μm或更小。
6.权利要求4或5所述的抗体生物标志物捕获载体，其中所述纳米颗粒包含聚乳酸-乙醇酸共聚物。
7.活化适用于诊断结核病的耐溶剂丝网印刷电极的方法，所述方法包括化学抛光所述电极和机械抛光所述电极二者，从而获得活化的耐溶剂丝网印刷电极。
8.权利要求7所述的方法，其中首先实现所述化学抛光，随后实现所述机械抛光。
9.权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述电极是金耐溶剂丝网印刷电极。
10.权利要求7至9中任一项所述的方法，其中所述电极是一次性电极。
11.权利要求7至10中任一项所述的方法，其中piranha酸用于所述电极的所述化学抛光。
12.权利要求7至11中任一项所述的方法，其中氧化铝用于所述电极的所述机械抛光。
13.通过权利要求7至12中任一项所述的方法活化的活化的丝网印刷电极。
14.将分枝菌酸抗原固定在适用于诊断结核病的活化的丝网印刷电极表面上的方法，所述方法包括：
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在二甲基甲酰胺中以产生分枝菌酸-二甲基甲酰胺溶液；以及
将活化的丝网印刷电极与所述分枝菌酸-二甲基甲酰胺溶液一起孵育以允许分枝菌酸抗原吸附到活化的电极上，以产生包含固定化分枝菌酸抗原的活化的丝网印刷电极。
15.权利要求14所述的方法，其中所述活化的丝网印刷电极是权利要求13所述的活化的丝网印刷电极，并且任选地，其中所述电极在与所述溶液一起孵育后洗涤。
16.诊断结核病的方法，所述方法包括：
使用分枝菌酸抗体实时抑制测试，采用电化学阻抗谱来诊断来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品中活动性结核病的存在；
使用权利要求4至6中任一项所述的抗体生物标志物捕获载体；和/或
使用权利要求13所述的活化的耐溶剂丝网印刷电极；
和/或
使用通过权利要求14或权利要求15所述的方法获得的包含固定化分枝菌酸抗原的丝网印刷电极。
17.权利要求16所述的方法，其中所述分枝菌酸抗体实时抑制测试是US 7851166的分枝菌酸抗体实时抑制测试。
18.诊断结核病的方法，所述方法包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到纳米颗粒的外表面上以获得包含分枝菌酸抗原的纳米颗粒，其中所述分枝菌酸抗原作为抗体生物标志物捕获剂呈现；
活化丝网印刷电极；
用硫醇化疏水性物质包被活化的电极；
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在溶剂中以形成分枝菌酸溶液；
使分枝菌酸抗原从所述分枝菌酸溶液固定到所述活化的电极上；
将来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品与所述包含分枝菌酸抗原的纳米颗粒一起孵育以产生对照样品；
将来自所述患者的样品与不包含分枝菌酸的纳米颗粒一起孵育以产生测试样品；
使所述对照样品和所述测试样品与包含固定化分枝菌酸抗原的所述活化的丝网印刷电极或包含固定化分枝菌酸抗原的活化的丝网印刷电极接触，以允许各样品中的任何生物标志物抗分枝菌酸抗体与所述固定化分枝菌酸抗原结合；以及
使用电化学阻抗谱来测量各样品中抗体与所述固定化抗原结合的程度，
其中与所述测试样品相比所述对照样品中的任何较少的结合是所述对照样品中生物标志物抗分枝菌酸抗体与所述固定化抗原结合的结果，并且指示所述患者中的活动性结核病。
19.权利要求18所述的方法，其中所述纳米颗粒的尺寸为0.2μm或更小。
20.权利要求18或19所述的方法，其中所述纳米颗粒包含聚乳酸-乙醇酸共聚物。
21.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述硫醇化疏水性物质为十八烷基硫醇。
22.权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述电极是金耐溶剂丝网印刷电极。
23.权利要求18至22中任一项所述的方法，其中所述电极是一次性电极。
24.权利要求18至23中任一项所述的方法，其中所述电极的活化通过其化学和/或机械抛光进行。
25.权利要求24所述的方法，其中使用化学抛光，其中所述化学抛光通过piranha酸进行。
26.权利要求24或权利要求25所述的方法，其中使用机械抛光，其中所述机械抛光通过氧化铝进行。
27.权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述电极首先被化学抛光，然后被机械抛光。
28.权利要求19至27中任一项所述的方法，其中在固定所述分枝菌酸抗原后洗涤所述电极。
29.诊断结核病的方法，其包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到颗粒上；
通过化学抛光丝网印刷电极和机械抛光丝网印刷电极二者来活化所述电极；
用硫醇化疏水性物质包被所述丝网印刷电极；
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在溶剂中以形成分枝菌酸溶液；
使分枝菌酸抗原从所述分枝菌酸溶液固定到活化的丝网印刷电极上；
将来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品与包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生对照样品；
将来自所述患者的样品与不包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生测试样品；
使所述对照样品和所述测试样品与包含固定化分枝菌酸抗原的所述活化的丝网印刷电极或包含固定化分枝菌酸抗原的活化的丝网印刷电极接触，以允许各样品中的任何生物标志物抗分枝菌酸抗体与所述固定化分枝菌酸抗原结合；以及
使用电化学阻抗谱来测量各样品中抗体与所述固定化抗原结合的程度，
其中与所述测试样品相比所述对照样品中的任何较少的结合是所述对照样品中分枝菌酸抗体与所述固定化抗原结合的结果，并且指示所述患者中的活动性结核病。
30.诊断结核病的方法，其包括：
将结核分枝杆菌来源的分离的分枝菌酸抗原引入到颗粒上；
活化丝网印刷电极；
用硫醇化疏水性物质包被所述丝网印刷电极；
将结核分枝杆菌来源的分枝菌酸溶解在二甲基甲酰胺中以形成分枝菌酸溶液；
使分枝菌酸抗原从所述分枝菌酸溶液固定到活化的丝网印刷电极上；
将来自怀疑患有活动性结核病的患者的样品与包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生对照样品；
将来自所述患者的样品与不包含分枝菌酸的颗粒一起孵育以产生测试样品；
使所述对照样品和所述测试样品与包含固定化分枝菌酸抗原的所述活化的丝网印刷电极或包含固定化分枝菌酸抗原的活化的丝网印刷电极接触，以允许各样品中的任何分枝菌酸抗体与所述固定化分枝菌酸抗原结合；以及
使用电化学阻抗谱来测量各样品中抗体与所述固定化抗原结合的程度，
其中与所述测试样品相比所述对照样品中的任何较少的结合是所述对照样品中分枝菌酸抗体与所述固定化抗原结合的结果，并且指示所述患者中的活动性结核病。
31.用于与电化学阻抗谱一起使用的即时检验结核病诊断试剂盒，所述试剂盒包含：
包含干分枝菌酸抗原包被的纳米颗粒的第一对照样品容器；
包含等量的未包被的纳米颗粒的第二测试样品容器；以及
单独包装的、活化的耐溶剂分枝菌酸包被的丝网印刷电极。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10228371B2 (en) 2012-06-11 2019-03-12 University Of Pretoria Liposomal composition comprising a sterol-modified lipid and a purified mycobacterial lipid cell wall component and its use in the diagnosis of tuberculosis

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014184768A1 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 University Of Pretoria A method of diagnosing tuberculosis
CN104685358A (zh) * 2012-06-11 2015-06-03 比勒陀利亚大学 包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分的脂质体组合物及其在肺结核诊断中的用途

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE408837T1 (de) 2004-05-13 2008-10-15 Univ Pretoria Verfahren zum nachweis von infektionen mit mykobakterien

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104685358A (zh) * 2012-06-11 2015-06-03 比勒陀利亚大学 包含固醇修饰的脂质和纯化的分枝杆菌脂质细胞壁组分的脂质体组合物及其在肺结核诊断中的用途
WO2014184768A1 (en) * 2013-05-16 2014-11-20 University Of Pretoria A method of diagnosing tuberculosis

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KENNETH I. OZOEMENA等: "Electron transfer dynamics across self-assembled N-(2-mercaptoethyl) octadecanamide/mycolic acid layers: impedimetric insights into the structural integrity and interaction with anti-mycolic acid antibodies", 《PHYSICAL CHEMISTRY CHEMICAL PHYSICS》 *
NSOVO S. MATHEBULA等: "Recognition of anti-mycolic acid antibody at self-assembled mycolic acid antigens on a gold electrode: a potential impedimetric immunosensing platform for active tuberculosis", 《CHEM COMMUN》 *
YOLANDY LEMMER等: "Mycolic acids, a promising mycobacterial ligand for targeting of nanoencapsulated drugs in tuberculosis", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 *
傅超美等主编: "《药用辅料学》", 31 October 2008, 中国中医药出版社 *
刘长林、田德美主编: "《研究设计型化学实验教程》", 31 December 2013, 华中师范大学出版社 *

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