CN108479738A - 一种疏水层析介质、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种疏水层析介质、制备方法及其应用，属于生物化工领域中的蛋白质层析分离技术领域。1‑萘乙酸固载于亲水性凝胶载体可制备成一种新型的疏水层析介质，用于蛋白质的分离纯化。相对于常规的疏水层析介质，本发明采用1‑萘乙酸为固定化配基制备的疏水介质可实现低盐浓度条件下pH调控的蛋白质吸附和洗脱，且具有载量高的特点。通过调节缓冲液的pH值，可以分别实现溶菌酶及抗体等蛋白质的吸附及解吸。

Description

一种疏水层析介质、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种疏水层析介质、制备方法及其应用，属于生物化工领域中的蛋白质层析分离技术领域。

背景技术

层析分离是目前生物工程下游蛋白质分离纯化最重要的技术手段，如何进一步提高层析分离的有效性和经济性是本领域的研究重点。

疏水色谱是一种重要的层析分离技术，经典疏水色谱的技术原理是基于高盐上样低盐洗脱的模式，实现蛋白质的吸附和解吸。常用的疏水配基主要有苯基、短链烷基、烷氨基、聚醚等，因疏水性吸附作用与配基修饰密度紧密相关，为同时保证吸附效果和洗脱效果，通常配基修饰密度在10-40μmol/mL之间，载量相对较低，一步选择性相对较差。自1977年安玛西亚公司推出基于琼脂糖的商品化疏水分离介质以来，疏水色谱并没有和离子交换色谱一样在蛋白质精分离过程中承担起重要角色。这主要是由于经典疏水色谱的高盐模式存在以下问题：(1)部分蛋白质在高浓度盐溶液中不稳定，载量一般较低，处理能力有限；(2)常出现蛋白质不可逆吸附，造成洗脱困难；(3)分离效果受多种因素影响，性能不稳定，不利于规模放大；(4)高盐浓度增加成本，腐蚀不锈钢设备。对高离子强度吸附条件的依赖不仅使其在使用过程中受到种种限制，同时也是影响其适用范围和分离效果的主要因素。

针对这一问题，近年来出现了一些低盐或无盐的疏水色谱模式。Cramer SM等人提出采用表面活性剂置换洗脱疏水结合蛋白，避免高盐条件的使用(Biotechnol.Bioeng.2003,82:330)；Ghose S等采用调节pH的方式调控溶质亲疏水性，利用强疏水介质(Hexyl 650C)及疏水色谱的流穿模式避免疏水色谱高盐依赖的特性(mAbs,2013,5:795)；Müller TKH等通过调节温度调控溶质亲疏水性，改变温度即可实现蛋白吸附与解吸(J.Chromatogr.A,2012,1260:88)；J.Ren等利用具有超分子相互作用的主-客体，分别作为色谱固定化配基和洗脱结合蛋白的置换剂，提出环糊精超分子置换疏水色谱模式，通过合理设计疏水性配基的固载密度可实现抗体非盐依赖性吸附及置换洗脱(J.Chromatogr.A,2014,1369:98)。总体来看，现有的疏水层析介质处理能力有限，吸附容量不够高，特异性和选择性较差，常需要多步分离。因而开发性能更优良的疏水配基，提高疏水配基的选择性对于工业规模的蛋白分离纯化过程具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种以1-萘乙酸为配基的疏水层析介质及其制备方法。

本发明的技术方案：

一种疏水层析介质，以1-萘乙酸为配基的疏水层析介质由基质材料和通过间隔臂固载在其表面的功能配基构成；所述的基质材料为亲水性多孔微球，功能配基为通过双氨基试剂固载在基质材料表面的1-萘乙酸。

所述的疏水层析介质采用双氨基试剂3,3'-二氨基二丙基胺作为间隔臂分子偶联1-萘乙酸配基，其结构组成为：

一种疏水层析介质的制备方法，步骤如下：

1)将基质材料先经去离子水多次洗涤，然后加入到1倍基质体积的2mol/mL NaOH溶液中，然后加入3倍基质体积的二甲基亚砜，再加入0.5倍基质体积的环氧氯丙烷，37-50℃下170rpm摇床中活化0.25-1.5小时，活化后使用去离子水多次洗涤，除去未反应的环氧氯丙烷及副产物，得到环氧氯丙烷活化的层析基质；

2)将环氧氯丙烷活化的层析基质、1-2倍层析基质体积的水、0.03-0.1倍层析基质体积的3,3'-二氨基二丙基胺混合，50℃下170rpm摇床中反应3-4小时，反应后用丙酮洗涤，除去未反应的3,3'-二氨基二丙基胺，得到末端接枝氨基的层析基质；

3)将末端接枝氨基的层析基质、1-2倍层析基质体积的丙酮、0.03-0.1倍层析基质体积的N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、0.04-0.12倍层析基质质量的1-萘乙酸混合，37℃下170rpm摇床中反应20-24小时，反应后依次用丙酮和去离子水洗涤，得到以1-萘乙酸为功能配基的疏水层析介质。

本发明的有益效果：本发明研制的以萘乙酸为功能配基的层析介质，可以用于蛋清中溶菌酶的提取，也可用于疏水层析对抗体的分离纯化，主要特点体现在：(1)制备过程简单，成本低廉；(2)蛋白吸附量较大。该配基包含两个芳香环，疏水程度较强，对蛋白具有显著的吸附能力；(3)吸附过程可在低盐或无盐条件下进行，避免了对高离子强度的依赖，可以降低料液预处理成本；(3)具有pH依赖型吸附的特性，同一蛋白质在不同pH条件下吸附容量不同；(4)洗脱方便，仅需调节pH至蛋白吸附容量较低的值即可实现蛋白的洗脱；(5)层析介质稳定性高。介质在强碱、强酸中浸泡后依旧保持很好的稳定性，且可再生重复使用。

附图说明

图1是采用实施例1所得到的层析介质从蛋清稀释样品中分离溶菌酶的电泳分析图，其中洗脱是在pH 5.0的洗脱液下洗脱所得到的溶菌酶样品。

图2是采用弱阳离子交换色谱CM从蛋清稀释样品中分离溶菌酶的电泳分析图。

图3是采用实施例1所得到的层析介质从牛血清中分离抗体的电泳分析图，其中洗脱1是在pH 3.0的洗脱液下洗脱所得到的抗体样品，洗脱2是在pH 3.5洗脱液下洗脱所得到的抗体样品，洗脱3是在pH 4.0洗脱液下洗脱得到的抗体样品，洗脱4是在pH 4.5洗脱液下洗脱得到的抗体样品。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

实施例1配基密度为50μmol/mL的吸附剂合成

取琼脂糖凝胶10g，用去离子水多次润洗除去20％乙醇，抽干后加入到含有10mL2mol/L的NaOH溶液中，再加入30mL二甲基亚砜和5mL环氧氯丙烷，37℃下170rpm摇床中活化1小时，活化后使用大量去离子水洗涤，除去未反应的环氧氯丙烷；抽滤后，将环氧氯丙烷活化的基质加入到含有0.5mL 3,3'-二氨基二丙基胺的水溶液中，50℃下170rpm摇床中反应4小时，反应后使用去离子水洗涤，除去未反应的3,3'-二氨基二丙基胺；然后将抽干的末端接枝有3,3'-二氨基二丙基胺的层析介质加入到15mL丙酮和0.5g 1-萘乙酸及0.4mL N,N'-二异丙基碳二酰亚胺溶液中，37℃下170rpm摇床中反应20小时，反应后依次使用丙酮和去离子水洗涤，除去未反应的1-萘乙酸，得到以3,3'-二氨基二丙基胺为间隔臂的萘乙酸功能化凝胶，配基密度为50μmol/mL湿胶。

实施例2动态结合容量评价

采用实施例1所得到的凝胶介质，选取内径为0.66cm的玻璃层析柱，连入到配套有蠕动泵和紫外检测器的层析系统中。紫外检测器在280nm波长下检测信号。分别取0.5mL上述凝胶介质装柱，用2.0mg/mL的溶菌酶上柱，上样流速为75cm/h，10％流穿后停止上样，平衡缓冲液洗出柱中残留的未结合的溶菌酶。通过检测上样前后溶菌酶总量的差值确定凝胶介质的吸附量。

实施例3不同密度吸附剂对溶菌酶动态结合容量评价

采用实施例2所述评价方法，针对不同密度的吸附介质对于溶菌酶的动态结合容量进行测定。其中某一密度吸附介质制备的具体方法参见实施例1，区别在于活化时间不同，环氧氯丙烷、3,3'-二氨基二丙基胺及1-萘乙酸用量不同。pH 10条件下，配基密度为45μmol/mL的层析介质对溶菌酶的吸附量约为20μmol/mL；配基密度为80μmol/mL的层析介质对溶菌酶的吸附量约为35μmol/mL。

实施例4不同pH条件下溶菌酶动态结合容量评价

采用实施例2所述评价方法，针对实施例1制备的吸附介质在不同pH条件下对溶菌酶的动态结合容量进行测定。实验结果见附表1：附表1结果表明，在实验条件下，随溶液pH的升高，萘乙酸吸附介质对溶菌酶的动态结合容量呈逐渐增加的趋势，在pH＝10时动态结合容量最大，达到22.1μmol/mL；因此，在一定pH范围内，偶联有1-萘乙酸配基的凝胶介质对溶菌酶具有较为显著的吸附能力，且在实验条件下，溶液pH＝10时，萘乙酸吸附介质对溶菌酶吸附效果最好。

实施例5蛋清溶菌酶吸附选择性评价

采用实施例1中所得到的凝胶介质，选取内径为0.66cm的玻璃层析柱，连入到配套有蠕动泵和紫外检测器的层析系统中。紫外检测器在280nm波长下检测信号。分别取0.5mL上述凝胶介质装柱，用4mL的蛋清稀释样品(用pH 10的缓冲液将蛋清稀释3倍)上样，当紫外信号迅速上升时，回收流穿液。上样平衡后，用pH 10的缓冲液平衡柱子，除去未结合的蛋白。通过pH 5.0的磷酸缓冲液洗脱结合的溶菌酶，并回收洗脱液。对回收的溶液及原液利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱液中的蛋白组成，并使用灰度扫描计算洗脱液中溶菌酶纯度。

上述实验结果见附图1：附图1结果表明，萘乙酸吸附介质可以从蛋清稀释液中吸附溶菌酶，通过控制pH洗脱得到的蛋白溶液中溶菌酶纯度达95％以上，回收率可达80％左右。

作为对照，以弱阳离子交换色谱CM对蛋清稀释样中溶菌酶进行了分离纯化。采用AKTA purifier(Box-900)色谱系统，磷酸盐缓冲液(0.01M，pH6.5)作为平衡缓冲液，上样流速0.5mL/min，用0mM-500mM NaCl(pH 6.5PBS配制)30min线性洗脱，洗脱流速1mL/min。通过SDS-PAGE检测评价其成分。

上述实验结果见附图2：附图2结果表明，经CM纯化后的流穿中几乎不含有溶菌酶；洗脱液中溶菌酶纯度约为75％左右，不及萘乙酸吸附介质对蛋清溶菌酶的分离纯化效果。

实施例6牛血清抗体吸附选择性评价

采用实施例1中所得到的凝胶介质，选取内径为0.66cm的玻璃层析柱，连入到配套有蠕动泵和紫外检测器的层析系统中。紫外检测器在280nm波长下检测信号。分别取0.5mL上述凝胶介质装柱，用0.5mL的牛血清样品上样，当紫外信号迅速上升时，回收流穿液。上样平衡后，用pH 7的缓冲液平衡柱子，除去未结合的蛋白。通过pH 4.5、4.0、3.5、3.0的柠檬酸缓冲液洗脱结合的抗体，并回收洗脱液。对回收的溶液及原液利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析洗脱液中的蛋白组成，并使用灰度扫描计算洗脱液中抗体纯度。

上述实验结果见附图3：附图3结果表明，与牛血清原液相比，经萘乙酸吸附介质吸附后的牛血清中抗体含量有所下降，说明该吸附介质对于牛血清抗体具有一定的吸附选择性。

表2为不同pH洗脱下牛血清抗体的纯度及回收率。表2结果表明，随洗脱pH减小，抗体回收率逐渐增加，纯度逐渐降低。当洗脱pH为4.5时，萘乙酸吸附剂在牛血清中分离抗体的纯度为95％，回收率为22.8％；当洗脱pH继续减小时，意味着更多的杂蛋白被洗脱下来，当降低洗脱pH至3.0，抗体下降至79％；回收率则增加至72.2％。因而可根据分离目的不同来选择洗脱pH。

表1配基密度50μmol/mL的介质在不同pH下对溶菌酶的动态结合容量

表1是采用实施例1所得到的吸附介质，利用玻璃层析柱上样得到不同pH条件下凝胶对溶菌酶的动态吸附容量结果。

表2不同洗脱溶液pH下bIgG的收率和纯度

表2是采用实施例1所得到的层析介质从牛血清中分离抗体，用不同pH缓冲液洗脱所得到的抗体纯度及回收率结果。

Claims (7)

1.一种疏水层析介质，其特征在于，所述的疏水层析介质为以1-萘乙酸为配基的疏水层析介质，由基质材料和通过间隔臂固载在其表面的功能配基构成；所述的基质材料为亲水性多孔微球，功能配基为通过双氨基试剂固载在基质材料表面的1-萘乙酸。

2.根据权利要求1所述的疏水层析介质，其特征在于，所述的疏水层析介质采用双氨基试剂3,3'-二氨基二丙基胺作为间隔臂分子偶联1-萘乙酸配基，其结构组成为：

3.根据权利要求1或2所述的疏水层析介质，其特征在于，所述的基质材料为交联琼脂糖凝胶。

4.根据权利要求1或2所述的疏水层析介质，其特征在于，所述功能配基的偶联密度为15-100μmol/mL湿胶的凝胶介质。

5.根据权利要求3所述的疏水层析介质，其特征在于，所述功能配基的偶联密度为15-100μmol/mL湿胶的凝胶介质。

6.权利要求1-5所述一种疏水层析介质的制备方法，其特征在于，步骤如下：

1)将基质材料先经去离子水多次洗涤，然后加入到1倍基质体积的2mol/mL NaOH溶液中，然后加入3倍基质体积的二甲基亚砜，再加入0.5倍基质体积的环氧氯丙烷，37-50℃下170rpm摇床中活化0.25-1.5小时，活化后使用去离子水多次洗涤，除去未反应的环氧氯丙烷及副产物，得到环氧氯丙烷活化的层析基质；

2)将环氧氯丙烷活化的层析基质、1-2倍层析基质体积的水、0.03-0.1倍层析基质体积的3,3'-二氨基二丙基胺混合，50℃下170rpm摇床中反应3-4小时，反应后用丙酮洗涤，除去未反应的3,3'-二氨基二丙基胺，得到末端接枝氨基的层析基质；

3)将末端接枝氨基的层析基质、1-2倍层析基质体积的丙酮、0.03-0.1倍层析基质体积的N,N'-二异丙基碳二酰亚胺、0.04-0.12倍层析基质质量的1-萘乙酸混合，37℃下170rpm摇床中反应20-24小时，反应后依次用丙酮和去离子水洗涤，得到以1-萘乙酸为功能配基的疏水层析介质。

7.一种用于溶菌酶和抗体的分离的疏水层析介质。