CN108464970B

CN108464970B - 一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳及其制备方法

Info

Publication number: CN108464970B
Application number: CN201810381239.6A
Authority: CN
Inventors: 王一飞; 董栋; 王巧利; 吴宝剑; 李志杰; 全恩希
Original assignee: Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Base Co Ltd
Current assignee: Guangzhou Jinan Biomedicine Research and Development Base Co Ltd
Priority date: 2018-04-25
Filing date: 2018-04-25
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2038-04-25
Also published as: CN108464970A

Abstract

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳及其制备方法。本发明提供的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳主要由安五脂素、油酸钠、大豆卵磷脂和中链甘油三酯组成。本发明制备得到的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳可以防止安五脂素被体内的代谢酶代谢，生成二级代谢产物；其还可以防止安五脂素肠外排的作用，提高安五脂素的生物利用度高，同时该安五脂素纳米乳还具有稳定性好，溶解度高的优点，大大拓宽了安五脂素的临床应用价值。

Description

一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳及其制备方法。

背景技术

肉豆蔻为肉豆蔻科植物肉豆蔻的干燥种仁，具有温中行气、涩肠止泻的功效，用于脾胃虚寒、久泻不止、腕腹胀痛、食少呕吐等症状，中医临床主要用于治疗消化道紊乱、呕吐、腹泻、风湿病、霍乱、胃胀气、心慌和精神错乱等疾病。现代研究发现，安五脂素是肉豆蔻中的主要功效成分，安五脂素的结构式为：

安五脂素已被证明具有广泛的药理活性，如抗菌、抗炎、抗癌、抗糖尿病、保肝等作用；更重要的是其还具有保护神经的作用，在脑神经退行性疾病中具有重要的作用。

安五脂素的生理作用和药理活性是当前研究的热点和重点。专利文献CN103664864A 公开了一种安五脂素的制备方法，所述制备方法是从中药南五味子中提取分离安五脂素，具体步骤为：将中药南五味子粉碎，用石油醚(30-60℃)浸提，提取液浓缩后直接上正相硅胶柱，用石油醚、二氯甲烷作洗脱剂，合并含有目标物的流份，浓缩后用甲醇溶解，上高压色谱柱进行制备，含目标物的流份浓缩至溶液混浊后，用石油醚萃取，石油醚萃取液浓缩干后，用正己烷乙醚混合溶剂做结晶溶剂，可以得到安五脂素晶体，纯度达98％以上。

专利文献CN105748463A公开了一种五味子木脂素类化合物的医药用途，涉及五味子木脂素类化合物，或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备FXR转录激活剂、防治肥胖等中的应用，所述五味子木脂素类化合物选自五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、联苯双酯、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酚、滇藏五味子素G、鹤庆五味子癸素、异南五味子木脂宁、安五脂素、五味子酯戊、五味子烯、五味子酮或五脂素A1，表明了五味子木脂素类化合物不仅对肥胖具有显著的治疗活性，还可同时通过选择性地抑制FXR的转录活性起到预防、改善和/或治疗多种代谢性疾病如脂肪肝、高脂血症等的作用。

然而，目前提取得到的安五脂素存在水溶性差，在体内极易被体内的代谢酶代谢，生成二级代谢产物，导致其生物利用度极低，大大的限制了其临床应用价值。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷。本发明的目的在于提供一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳及其制备方法，该安五脂素纳米乳可以防止安五脂素在体内被代谢酶代谢，生成二级代谢产物；其还可以防止安五脂素肠外排的作用，提高安五脂素的生物利用度高，同时该安五脂素纳米乳还具有稳定性好，溶解度高的优点，大大拓宽了安五脂素的临床应用价值。

本发明提供了一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳，包括以下成分及其重量份数：

安五脂素30～50份、油酸钠120～180份、大豆卵磷脂100～200份和中链甘油三酯1000～3000份。

进一步地，所述的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳包括以下成分及其重量份数：

安五脂素40份、油酸钠160份、大豆卵磷脂150份和中链甘油三酯2000份。

另外，本发明还提供了所述的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳的制备方法，包括以下步骤：

S1称取油酸钠加入超纯水中，所述油酸钠与超纯水的固液比为16mg:1ml，超声处理至油酸钠完全溶解，得水相；

S2将安五脂素、大豆卵磷脂和中链甘油三酯混合均匀，得混合物I，接着往混合物I中加入无水乙醇，超声波处理3～6min至完全溶解，得油相；

S3将步骤S1得到的水相置于磁力搅拌器上，所述磁力搅拌器的温度设为37℃，搅拌速度为1000rpm，使用注射器将步骤S2得到的油相注入水相中，搅拌50～70min，得初乳；

S4将步骤S3得到的初乳置于冰浴中超声处理18～22min，所述超声处理的频率为20K Hz，除去乙醇，即得。

进一步地，所述步骤S1中的超声处理的频率为20KHz。

进一步地，所述步骤S2中的超声处理的频率为20KHz。

进一步地，所述步骤S2中的无水乙醇与混合物I的固液比为2.19g:5ml。

本发明提供的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳中的大豆卵磷脂的CAS号为8030-76-0，所述中链甘油三酯购于德国cremer oleo公司。

本发明人首次将安五脂素制成纳米乳制剂，可以有效的提高安五脂素的溶解度和渗透性，改善药物的口服吸收性，降低安五脂素的刺激性和毒副作用，提高了安五脂素的安全性和生物利用度。同时，本发明人将油酸钠用于制备安五脂素纳米乳制剂，可以进一步地防止安五脂素在体内被代谢酶代谢，生成二级代谢产物，防止其肠外排的作用，进一步地提高安五脂素的生物利用度高和稳定性，大大的拓宽了安五脂素的临床应用价值。

与现有技术相比，本发明提供的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳具有以下优势：

(1)本发明提供的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳具有稳定性高和生物利用度高的优点，大大的拓宽了安五脂素的临床应用价值；

(2)本发明提供的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳具有使用方便，无刺激性，副作用低的效果，有利于规模化的推广和应用。

附图说明：

图1为21种辅料对安五脂素在人肝微粒体(HLM)中UGT代谢的影响。

图2为21种辅料对安五脂素在大鼠肝微粒体(RLM)中UGT代谢的影响。

图3为21种辅料对安五脂素在人肠微粒体(HIM)中UGT代谢的影响。

图4为21种辅料对安五脂素大鼠肠微粒体(RIM)中UGT代谢的影响。

图5为5种辅料对安五脂素在大鼠肝微粒体(RLM)中UGT代谢的影响。

图6为5种辅料对安五脂素大鼠肠微粒体(RIM)中UGT代谢的影响。

图7为SO-NE透射电镜图。

图8为SO-NE(安五脂素纳米乳)及空载纳米乳稳定性图。

图9为SO-NE(安五脂素纳米乳)和混悬剂的体外释放曲线。

图10为以30mg/kg剂量，分别灌胃给予大鼠安五脂素混悬剂和SO-NE(安五脂素纳米乳)后，安五脂素的药动学特征图。

具体实施方式：

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1、一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳

所述代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳由以下成分及其含量组成：

安五脂素30mg、油酸钠120mg、大豆卵磷脂100mg和中链甘油三酯1000mg。

制备方法：

S1称取油酸钠加入超纯水中，所述油酸钠与超纯水的固液比为16mg:1ml，超声处理至油酸钠完全溶解，所述超声频率为20KHz，得水相；

S2将安五脂素、大豆卵磷脂和中链甘油三酯混合均匀，得混合物I，接着往混合物I中加入无水乙醇，所述无水乙醇与混合物I的固液比为2.19g:5ml，超声波处理3～6min至完全溶解，所述超声频率为20KHz，得油相；

S4将步骤S3得到初乳置于冰浴中超声处理18～22min，所述超声处理的频率为20KHz，除去乙醇，即得。

实施例2、一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳

所述代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳由以下成分及其重量份数组成：

安五脂素40mg、油酸钠160mg、大豆卵磷脂150mg和中链甘油三酯2000mg。

制备方法与实施例1类似。

实施例3、一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳

安五脂素50mg、油酸钠180mg、大豆卵磷脂200mg和中链甘油三酯3000mg。

制备方法与实施例1类似。

试验例一、代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳辅料的选择试验

1、试验材料：

表1 21种辅料

2、试验方法：

考察21种辅料(PEs，1mg/mL，表1)对安五脂素在人肝微粒体(HLM)、大鼠肝微粒体(RLM)、人肠微粒体(HIM)和大鼠肠微粒体(RIM)中UGT代谢的影响。反应体系(总体积为300μL)中的成分(表)按以下顺序和体积分别添加：207μLKPI缓冲液、 52.9μL反应溶液B(SolB)、15.9μL微粒体溶液(HLM、RLM、HIM和RIM)、3μL 安五脂素储备液以及21.2μL反应溶液A(SolA)。体系中有机溶剂的含量不超过1％。反应条件如表中所示。如有其他成分的引入，则扣去相应体积的缓冲液。将以上体系涡旋混匀，置37℃水浴中孵育。一定时间后，往体系中加入100μL冰冷乙腈，剧烈涡匀后置冰上终止反应。样品经高速离心(12000g，10min)后，取上清，用UPLC分析。

表2：葡萄糖醛酸化孵育体系。

	KPI	PEs	SolB	Microsome	安五脂素	SolA	Total
								Control	207	0	52.9	15.9	3	21.2	300
Test	177	30	52.9	15.9	3	21.2	300

表3安五脂素在不同孵育体系中UGT代谢条件

3、试验结果：

试验结果如图1～图4所示，在这21种辅料中，5种辅料(Brij 35、Brij 58、Labrasol、 Sodium oleate以及Tween 20)可显著抑制安五脂素在4种酶源(HLM、RLM、HIM和RIM) 中的UGT代谢。其中，Sodium oleate对安五脂素在4种微粒体中的UGT代谢抑制率均>80％ (p<0.001)。相反，Pluronic F407显著激活安五脂素在4种微粒体(HLM、RLM、HIM 和RIM)中的UGT代谢(134％～197％，p<0.01)。此外，7种辅料(Cremophor EL、LabrafilM1944、Labrafil M2130、Pluronic F68、Solutol HS15、Span 20以及Span 80)可抑制安五脂素在肝微粒体(HLM和RLM)中的UGT代谢(p<0.05)，但却诱导安五脂素在肠微粒体 (HIM和RIM)(p<0.05)中的代谢。其余8种辅料(PEG400、PVP K30、PVP K90、Soybean lecithin、Soybean oil、Transcutol HP、Tween 80以及VitE-TPGS)对安五脂素的UGT代谢没有显著影响(p>0.05)。

试验例二、辅料对安五脂素UGT代谢的抑制试验

1、试验材料：Brij 35、Brij 58、Labrasol、Sodium oleate和Tween 20。

2、试验方法：

以RLM和RIM为酶源，实验参考实验例一测定方法测定3个浓度(0.1、1和10mg/mL)的5种UGT抑制型辅料(Brij 35、Brij 58、Labrasol、Sodium oleate和Tween 20)对安五脂素UGT代谢的抑制效果。

3、试验结果：

结果显示，Brij 35、Brij 58、Labrasol、Sodium oleate和Tween 20对安五脂素的代谢抑制效果均具有浓度依赖性如图5～图6所示，也就是说，辅料的浓度越高，对安五脂素UGT 代谢的抑制作用越强。在这5中辅料中，Sodium oleate的抑制效果最为显著。当体系中加入低浓度(0.1mg/mL)Sodium oleate后，安五脂素在RLM、RIM中的代谢速率为22.4％和31.6％(p<0.001)。增大Sodium oleate的浓度(1mg/mL和10mg/mL)，使得其对安五脂素的代谢抑制效果达90％以上(p<0.001)。

试验例三、辅料对安五脂素往膜囊泡内转运动力学试验

1、试验材料：Brij 35、Brij 58、Labrasol、Sodium oleate和Tween 20。

2、试验方法：

采用快速过滤技术，评价安五脂素往膜囊泡(Membrane vesicles)内转运动力学。将不同浓度安五脂素混合不同UGT代谢抑制性辅料(Brij 35、Brij 58、Labrasol、Sodiumoleate 和Tween 20)与外排转运蛋白BCRP高表达的膜囊泡孵育一定时间。取上清液进行含量检测。采用米氏方程，估算转运动力学参数Vmax(最大转运速率)、Km(米氏常数)及CLint(内在清除率)。

3、试验结果：

试验结果如表4所示，Labrasol和Sodium oleate显示出较强的外排转运蛋白抑制作用，安五脂素与之混合后清除率Clint均显著大于另外三种辅料。

表4安五脂素转运动力学参数

	Vmax(μM/h)	K<sub>m</sub>(μM)	CL<sub>int</sub>(/h)
				Brij35	127.5±6.2	31.2±3.2	4.08
Brij58	154.7±9.9	56.7±8.2	2.72
				Labrasol	254.5±6.2	10.2±3.2	24.08
Sodiumoleate	210.4±21.1	9.6±1.6	21.90
				Tween20	178.3±8.5	44.3±5.7	4.02

由上述试验结果可知，Sodium oleat油酸钠为本发明代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳的最佳辅料。

试验例四、代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳的质量检测试验

1、试验材料：

实施例2制备得到的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳。

2、试验方法：

测定实施例2制备得到的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳(标记为SO-NE)的粒径分布、透射电镜图，同时测定实施例2制备得到的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳分别在-4℃和25℃环境下放置30天，考察制剂的稳定性。

3、试验结果：

SO-NE的粒径分布较为均匀，SO-NE平均粒径为83.2nm，PDI为0.177，ζ电势为-43.7mV，制剂的ζ电势值较低，表明所制备的安五脂素纳米乳体系具备良好的物理稳定性， SO-NE包封率为89.5％。透射电镜图如图7所示，从透射电镜图可知，SO-NE的外观均为近球形。将SO-NE分别在-4℃和25℃环境下放置30天，SO-NE的粒径和ζ电势均无明显改变如图8所，PDI值虽略有增加，但依然低于0.3，表明安五脂素纳米乳的粒径分布均匀度仍在可接受范围。另外，制剂的包封率略有下降，但降低量少于10％。SO-NE具备良好的贮存稳定性。

试验例五、对比试验

1、试验材料：

实施例2制备得到的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳和安五脂素混悬剂，所述安五脂素混悬剂为：称取160mg Tween 80于西林瓶中，加入10mL超纯水，超声至Tween80完全溶解，称取40mg安五脂素后冰浴超声30min。超声频率为20KHz。

2、试验方法：

测定实施例2制备得到的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳(标记为SO-NE)和安五脂素混悬剂的体外释放曲线，以30mg/kg剂量，分别灌胃给予大鼠安五脂素混悬剂和SO-NE后测定大鼠的药动学特征和药动学参数。

3、试验结果：

3.1、体外释放结果：

安五脂素的体外释放曲线如图9所示。两种制剂(SO-NE以及混悬剂)的安五脂素累积释放量均随时间增加而升高，表明药物可持续释放到介质中。SO-NE在48h内的药物累积释放率均超过70％。与SO-NE相比，安五脂素从混悬剂中的释放更慢(相似因子为f2 ＝42)。48h后，仅有50％的药物从混悬剂释放到介质中。根据Noyes-Whitney方程，药物的溶出速率与药物比表面积成正比。SO-NE为纳米级别的载药体系，安五脂素可高度分散于其中，从而增加药物的比表面积和溶出速率。

3.2、药动学特征和参数结果：

口服给药后，SO-NE组安五脂素的药动学特征与混悬剂相比有显著差异(如图10)。与混悬剂组相比，安五脂素在SO-NE组的系统暴露量(AUC)和最大血药浓度(Cmax) 分别提高了5.5倍(p<0.001)和3.5倍(p<0.05)。安五脂素在SO-NE组的半衰期(t1/2) 无显著性差异(如表5)。

表5.大鼠经灌胃给予安五脂素(30mg/kg)后，体内安五脂素的药动学参数

注：与混悬剂组相比，^*p<0.05，^***p<0.001。

Claims

1.一种代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳，其特征在于，包括以下成分及其重量份数：

安五脂素30～50份、油酸钠120～180份、大豆卵磷脂100～200份和中链甘油三酯1000～3000份；

所述的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳的制备方法，包括以下步骤：

S4将步骤S3得到的初乳置于冰浴中超声处理18～22min，所述超声处理的频率为20KHz，除去乙醇，即得。

2.如权利要求1所述的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳，其特征在于，包括以下成分及其重量份数：

3.如权利要求1所述的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳，其特征在于，所述步骤S1中的超声处理的频率为20KHz。

4.如权利要求1所述的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳，其特征在于，所述步骤S2中的超声处理的频率为20KHz。

5.如权利要求1所述的代谢及外排双抑制型的安五脂素纳米乳，其特征在于，所述步骤S2中的无水乙醇与混合物I的固液比为2.19g:5ml。