CN108463232A

CN108463232A - 用于治疗和预防病毒感染的组合物

Info

Publication number: CN108463232A
Application number: CN201680059760.7A
Authority: CN
Inventors: 约书亚·M·科斯廷; 约翰·M·威廉姆斯; 李丹
Original assignee: Hsrx Group Ltd
Current assignee: Hsrx Group Ltd
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2016-08-31
Publication date: 2018-08-28
Also published as: TW201717984A; US20180228853A1; WO2017040588A1; CA2996901A1; EP3344272A1; JP2018526444A

Abstract

本发明一般涉及包含治疗和预防病毒感染的化合物的组合物和使用其的方法。

Description

用于治疗和预防病毒感染的组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年8月31日提交的美国临时申请第62/212339号的权益，其内容通过引用并入本申请中。

发明背景

A.技术领域

本发明涉及含有能够预防和治疗病毒感染的化合物的混合物的制剂。

B.相关技术说明

病毒是相对简单的颗粒，其主要仅由一些蛋白质和仅含有一些基因的核酸构成，然而，在病毒物种之间蛋白质和核酸可以差异很大。病毒组分的差异导致病毒感染的疾病、并发症和症状的很大差异。病毒感染会引起从良性的皮肤生长到未治疗时会导致死亡的受感染者免疫系统的失效或出血的不同病症。

抗病毒药物的开发是挑战性的。病毒之间大的差异使得一般抗病毒治疗难以进展。另外，病毒需要宿主细胞来进行复制，利用宿主细胞自身的机制来产生病毒颗粒；因此，对病毒生命周期的宿主依赖部分的靶向治疗通常会对宿主器官有害。此外，很多病毒生命周期持续时间非常短，而且很多病毒变异率高，使得治疗效力由于耐药性的形成而维持时间短。目前，大多数抗病毒药物靶向病毒、HIV、疱疹病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒和甲型流感病毒和乙型流感病毒的特定子集。也很受关注的是开发针对Zika病毒的药物来与Zika增长的传播和对未出生胎儿的威胁进行斗争。遗憾地，这些病毒仅代表很小一部分的威胁生命的病毒且一些治疗随着耐药性形成而已经过时。需要更多抗病毒治疗和有效的预防手段。

感染动物的很多病毒确实具有一些共同之处。它们中很多当从宿主细胞萌出时将其自身包膜在一小部分宿主细胞膜中。这种包膜通常由来自宿主细胞的磷脂和蛋白质以及一些病毒糖蛋白构成。所有包膜病毒的共同组分例如磷脂或病毒包膜的高曲率可以是用于开发针对所有包膜病毒的广谱抗病毒药物的靶标。此外，广谱抗病毒药物可以靶向病毒糖蛋白的保守氨基酸、氨基酸序列基序和/或氨基酸结构基序。另外，其中针对几种不同病毒有效的单个活性物的活性成分组合可以组合地提供广谱抗病毒保护。

针对包膜病毒的广谱治疗受到很大关注，因为这种治疗可以对HIV、单纯疱疹病毒、Zika病毒、登革病毒和流感病毒有效。

由于病毒的快速传播，对治疗和预防Zika病毒、黄病毒属的包膜病毒的关注最近已经增加。已经表明Zika引起Zika热，其很少对成人致命，但是当Zika感染从孕妇传至其胎儿时，胎儿会形成出生缺陷，包括头小畸形、眼睛缺陷、听力缺损和生长受损(Center forDisease Control and Prevention,Zika,2016)。目前没有针对Zika的疫苗，预防Zika的最佳方式是避免蚊子叮咬。(Id.).此外，一些针对Zika的抗体实际上可以通过抗体依赖的增强作用而有利于一些细胞型的Zika病毒感染。

登革病毒是黄病毒属的一种包膜病毒，登革病毒的感染是世界超过三分之一人口居住的热带地区和亚热带地区的疾病和死亡的主要原因(Center for Disease Controland Prevention,Dengue,2016)。已经表明登革引起登革热和登革出血热(DHF)。DHF会引起循环系统的失效和休克，以及可能的在没有立即、合适的治疗时的死亡。(Id.).目前没有针对登革病毒感染的可靠和有效的治疗，但是补液疗法可以在缓解DHF症状方面有用。(Id.).此外，一些针对登革病毒的抗体实际上通过抗体依赖的增强作用而有利于一些细胞型的登革病毒感染。

流感是由甲型流感病毒感染或乙型流感病毒感染引起的急性呼吸系统疾病(Nicholson等人，1998)。流感症状可以包括寒战、咳嗽、疲劳、发热、头痛、肌肉痛和/或咽喉痛，其严重程度是与普通感冒类似的轻度症状到典型的“流感”样症状，例如寒战、咳嗽、疲劳、发热、头痛、肌肉痛和/或咽喉痛的组合，到威胁生命的症状，包括肺炎和继发性细菌感染(U.S.Food and Drug Administration 2013；Kong 2009)。人类流感发病率对于所有年纪都是高的，但是尤其是对于儿童、老年人、孕妇和患有慢性病的病人(Fields等人，2001；Thompson等人，2003)。

流感流行不幸地屡见不鲜，部分地是由于流感病毒的连续变异。在2003年，禽流感(H5N1)感染了超过400个人并在15个国家中引起至少258例死亡(WHO，2009)。在2009年，H1N1猪流感在墨西哥爆发，其传播至多于200个国家，到2010年5月为止报道了超过18000例死亡，估计全世界的实际死亡超过201000例(WHO 2010；Dawood等人，2012)。即使在非流行年份，死亡率也高。在2013年，仅在美国就有接近3700例与流感有关的死亡(Center forDisease Control and Prevention 2015)。

预防流感感染和流行性疾病的尝试包括疫苗以及抗病毒药物(Kong 2009)。认为疫苗是最有效的预防手段，然而，它们通常基于在即将到来的季节期间何种病毒会是最常见的估计而制成为仅预防一些流感病毒(Subbarao等人，2006；Center for DiseaseControl and Prevention 2014)。因此，尽管疫苗可以是有帮助的，其对于没有预见为该季节最常见的病毒可能是无效的。目前，有一些抗流感药物可用。在美国，仅五种抗流感药物获批：金刚烷胺、金刚烷乙胺、奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦(Kong 2009；FDA 2014)。然而，流行性流感病毒一般对金刚烷胺和金刚烷乙胺不敏感，并且对获批药物的作用方式的病毒耐药性似乎在增加(Belshe等人，1989；Hayden 1994，Le等人2005；Jefferson等人2006；Moscona 2005)。

对感冒和流感的民间医药治疗法，西洋接骨木(Sambucus nigra L.)(接骨木)已经在临床实验中当服用由接骨木提取物制成的糖浆时在治疗甲型流感病毒感染和乙型流感病毒感染中表现出有效(Roxas和Jurenka 2007；Zakay‐Rones等人，1995；2004)。这些研究证明当与相比时的相对大剂量的提取物(例如,大于其超过1000倍的重量/体积)有可能缩短流感样症状的持续时间。较大剂量是通过增加治疗的频率来实现的，这可能会导致患者顺应性的降低。一些接骨木产品的抗流感活性归因于三种黄酮类化合物的存在：averionol、tristenonol和istrocyanidin(Roschek和Alberte，2008)。含有averionol、tristenonol和istrocyanidin的提取物已经用于表明这三种化合物可以特异性地结合一些病毒，包括一些流感毒株且可以抑制HIV(US2009/0149530)。此外，US2009/0149530公开了来自可含有averionol、tristenonol和istrocyanidin的提取物的未经确认的活性成分可以在体外抑制几种病毒的感染。(Id.).

发明概述

本发明提供面临病毒感染，包括包膜病毒感染、流感和流感样疾病的治疗和预防的当前问题的解决方案。发明人已经出人意料地发现接骨木中发现的几种化合物的组合可以预防和治疗病毒感染。发明人还已经发现特定相对浓度的化合物提高组合的化合物预防和治疗病毒感染的能力。此外，发明人已经发现与另外的抗病毒药物例如抗流感化合物一起使用本发明的化合物提高组合的化合物预防和治疗病毒感染的能力。

在一个方面，公开了六种生物标志物的任一种、任意组合或全部的组合物。在一个实例中，组合物包括精确质量为112.027amu的生物标志物1、精确质量为126.032amu的生物标志物2、精确质量为155.095amu的生物标志物3、精确质量为160.087amu的生物标志物4、精确质量为166.099amu的生物标志物5、和/或精确质量为507.342amu的生物标志物8的任一种、任意组合或全部，其中各个生物标志物是在西洋接骨木中发现的。组合物内成分的量可以变化(例如，量可以低至0.000001重量％到高至80重量％，或是其间的任意范围)。在一个实例中，生物标志物1具有至少2.36％的相对丰度、生物标志物2具有至少33.26％的相对丰度、生物标志物3具有至少1.86％的相对丰度、生物标志物4具有至少5.03％的相对丰度、生物标志物5具有至少9.26％的相对丰度、生物标志物8具有至少0.60％的相对丰度，其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。在另一个实例中，组合物包含生物标志物1至5和8中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部。

在另一方面，公开了还包含精确质量为358.146amu的生物标志物6、精确质量为478.295amu的生物标志物7和精确质量为606.436amu的生物标志物9的任一种、任意组合或全部的组合物，其中各个生物标志物是在西洋接骨木中发现的。在一个实例中，生物标志物6具有至少11.37％的相对丰度、生物标志物7具有至少1.20％的相对丰度和生物标志物9具有至少0.07％的相对丰度，其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。在另一个实例中，生物标志物1具有2.36％至6.94％的相对丰度、生物标志物2具有33.26％至85.75％的相对丰度、生物标志物3具有1.86％至4.69％的相对丰度、生物标志物4具有5.03％至12.89％的相对丰度、生物标志物5具有9.26％至24.11％的相对丰度、生物标志物8具有0.60％至1.75％的相对丰度，其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。在另一个实例中，生物标志物6具有11.37％至31.81％的相对丰度、生物标志物7具有1.20％至3.40％的相对丰度和生物标志物9具有0.07％至1.38％的相对丰度，其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。在又一个实例中，各个生物标志物的质量是通过实时直接分析-TOF(DART-TOF)质谱仪确定的质量。

在另一个方面，生物标志物1至9中的至少一种是合成得到的。在又一个方面，生物标志物1至9中的至少一种是从生物体得到的。在一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是从西洋接骨木果实得到的。在另一个实例中，组合物具有至少90％、优选至少95％、或至少98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。在又一个实例中，组合物还包含抗病毒药物。在另一个实例中，组合物包含抗流感药物。在一个实例中，抗流感药物是奥司他韦、扎那米韦、金刚烷乙胺、金刚烷胺、帕拉米韦、或其盐，或其任意组合。

在一个方面，组合物被配制用于口服施用。在一个实例中，组合物是锭剂、散剂、片剂、明胶胶囊、缓释胶囊、速释胶囊、凝胶剂、液体溶液和/或可溶解的膜中的一种或多于一种。在另一个方面，组合物被配制用于局部施用、静脉内施用和/或鼻内递送。在一个实例中，组合物具有针对流感病毒的低于500μg/ml的IC₅₀。在另一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒结合并阻断流感病毒进入细胞。在又一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒的血凝素结合。

在另一个方面，组合物还可以包含本文描述的一种或多于一种成分。例如，组合物可以包含选自一种或多于一种pH调节剂、结构化剂、无机盐和防腐剂的一种或多于一种另外的成分。

还公开了治疗或预防对象中的流感和/或流感样疾病的方法，该方法包括向对象施用任一种本发明的组合物。另外，公开了通过向对象施用任一种本发明的组合物来将任一种本发明的组合物施用至对象的方法。在特定的实例中，对象已经被诊断为患有流感和/或流感样疾病。

在一个方面，公开了通过向对象施用本文公开的任一种组合物来治疗患有流感和/或流感样疾病的对象的方法，其中对象被治疗。在另一个实例中，对象患有发热、头痛、肌肉痛、咳嗽、黏液排出、或鼻塞、或其任意组合。在又一个实例中，流感是由甲型流感病毒和/或乙型流感病毒引起的。在一个实例中，流感病毒是H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和/或乙型流感病毒。在一个实例中，流感样疾病是由鼻病毒引起的。在另一个实例中，对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。在又一个实例中，施用组合物至少一天一次，持续至少三天。在一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是合成得到的。在另一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是从生物体得到的。在又一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是从西洋接骨木果实得到的。在一个实例中，组合物具有至少95％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。在一个实例中，组合物还包含抗病毒药物。在另一个实例中，组合物包含抗流感药物。在又一个实例中，抗流感药物是奥司他韦、扎那米韦、金刚烷乙胺、金刚烷胺、帕拉米韦、或其盐，或其任意组合。在一个实例中，抗流感药物是奥司他韦、其盐，或其任意组合。

在另一个方面，公开了通过向对象施用任一种本文公开的组合物来治疗患有流感和/或流感样疾病的对象的方法，其中组合物被配制为用于口服施用。在一个实例中，组合物是锭剂、散剂、片剂、明胶胶囊、缓释胶囊、速释胶囊、凝胶剂、液体溶液和/或可溶解的膜中的一种或多于一种。在另一个实例中，组合物被配制为用于局部施用、静脉内施用和/或鼻内递送。在又一个实例中，组合物具有针对流感病毒的低于500μg/ml的IC₅₀。在一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒结合并阻断流感病毒进入细胞。在另一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒的血凝素结合。

在一个方面，公开了通过向对象施用任一种本文公开的组合物来治疗被包膜病毒感染的对象的方法。在一个实例中，对象被HIV、单纯疱疹病毒、黄病毒属病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。在另一个实例中，对象被黄病毒属病毒感染，黄病毒属病毒是Zika病毒和/或登革病毒。在又一个实例中，对象被Zika病毒感染。在一个实例中，对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。在另一个实例中，施用组合物至少一天一次，持续至少三天。

在另一个方面，公开了通过向对象施用任一种本文公开的组合物来治疗被包膜病毒感染的对象的方法，其中组合物被配制为用于口服施用。在一个实例中，组合物是锭剂、散剂、片剂、明胶胶囊、缓释胶囊、速释胶囊、凝胶剂、液体溶液和/或可溶解的膜中的一种或多于一种。在另一个实例中，组合物被配制为用于局部施用、静脉内施用和/或鼻内递送。在又一个实例中，组合物具有针对流感病毒的低于500μg/ml的IC₅₀。在一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒结合并阻断流感病毒进入细胞。在另一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒的血凝素结合。

在又一个方面，公开了通过向对象施用任一种本文公开的组合物来预防流感或流感样疾病的方法。在一个实例中，流感是由甲型流感病毒和/或乙型流感病毒引起的。在另一个实例中，流感病毒是H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和/或乙型流感病毒。在又一个实例中，流感样疾病是由鼻病毒引起的。在又一个实例中，对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。在一个实例中，施用组合物至少一天一次，持续至少三天。在另一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是合成得到的。在又一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是从生物体得到的。在一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是从西洋接骨木果实得到的。在另一个实例中，组合物具有至少90％、优选至少95％、或至少98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。在又一个实例中，组合物还包含抗流感药物。在一个实例中，抗流感药物是奥司他韦、扎那米韦、金刚烷乙胺、金刚烷胺、帕拉米韦、或其盐，或其任意组合。在另一个实例中，抗流感药物是奥司他韦、其盐或其任意组合。

在一个方面，公开了通过向对象施用任一种本文公开的组合物来预防流感和/或流感样疾病的方法，其中组合物被配制为用于口服施用。在一个实例中，组合物是锭剂、散剂、片剂、明胶胶囊、缓释胶囊、速释胶囊、凝胶剂、液体溶液和/或可溶解的膜中的一种或多于一种。在另一个实例中，组合物被配制为用于局部应用、静脉内施用和/或鼻内递送。在又一个实例中，组合物具有针对流感病毒的低于500μg/ml的IC₅₀。在一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒结合并阻断流感病毒进入细胞。在另一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒的血凝素结合。

在一个方面，公开了通过向对象施用任一种本文公开的组合物来预防对象被包膜病毒感染的方法。在一个实例中，包膜病毒是HIV、单纯疱疹病毒、黄病毒属病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。在另一个实例中，预防被黄病毒属病毒感染的感染，其中黄病毒属病毒是Zika病毒和/或登革病毒。在又一个实例中，黄病毒是Zika病毒。在又一个实例中，对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。在一个实例中，施用组合物至少一天一次，持续至少三天。在另一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是合成得到的。在又一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是从生物体得到的。在又一个实例中，生物标志物1至9中的至少一种是从西洋接骨木果实得到的。在另一个实例中，组合物具有至少90％、优选至少95％、或至少98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。在又一个实例中，组合物还包含抗流感药物。在一个实例中，抗流感药物是奥司他韦、扎那米韦、金刚烷乙胺、金刚烷胺、帕拉米韦、或其盐，或其任意组合。在另一个实例中，抗流感药物是奥司他韦、其盐或其任意组合。

在一个方面，公开了通过向对象施用任一种本文公开的组合物来预防对象被包膜病毒感染的方法，其中组合物被配制为用于口服施用。在一个实例中，组合物是锭剂、散剂、片剂、明胶胶囊、缓释胶囊、速释胶囊、凝胶剂、液体溶液和/或可溶解的膜中的一种或多于一种。在另一个实例中，组合物被配制为用于局部施用、静脉内施用和/或鼻内递送。在又一个实例中，组合物具有针对流感病毒的低于500μg/ml的IC₅₀。在一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒结合并阻断流感病毒进入细胞。在另一个实例中，生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒的血凝素结合。

在另一个方面，公开了通过制备生物标志物相对丰度的批次间化学一致性为至少90％、优选至少95％、或至少98％的组合物来制备任一种本文公开的组合物的方法。

在本发明的一些方面，组合物还可以包含一种或多于一种营养学和/或药学上可接受的载体或稀释剂。这些载体/稀释剂可以是佐剂、赋形剂或载剂，例如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、香料、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂、维生素、聚合物、含硅氧烷的化合物、精油、结构化剂和分散剂。如果每种载体与制剂的其他成分相容且对对象无害，则其是可接受的。在本发明的一些方面，载体可以包含选自以下的至少一种亲水性聚合物：树胶、纤维素醚、丙烯酸树脂、糖类载体、滑石、乳糖、甘露醇、葡萄糖、水、明胶、蛋白质衍生的化合物、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁和其任意组合。稀释剂/载体的非限制性实例在本说明书通篇指出并通过引用并入本部分。这类成分的量可以是以组合物的重量或体积计的0.0001％至99.9％或者其间任意整数或范围，如本说明书其它部分中所公开的，其通过引用并入本段。

组合物可以在室温下储存一个月、6个月、12个月、18个月或24个月。在本发明的一些方面，组合物被配制成散剂、片剂、明胶胶囊、珠、可食用片剂、可溶解的膜、能够通过空气被分散的液体、凝胶剂、洗剂、透皮贴剂、或用于口服施用的液体溶液。在本发明的一些方面，配制的组合物可以被包含在固体纳米颗粒、含脂质的纳米颗粒、基于脂质的载体、密封的管、吸管、密封袋或其任意组合中。在本发明的其他方面，组合物可以被配制为用于通过注射施用。

还预期包含本发明的组合物的试剂盒。在一些实施方案中，该组合物被包含在容器中。容器可以是瓶子、分配器、包装或吸管。容器可以分配预定量的组合物。在某些方面，组合物以丸剂、片剂、胶囊剂、透皮贴剂、可食用的咀嚼物、霜剂、洗剂、凝胶剂、喷雾剂、雾剂、团块、散剂、或液体的形式分配。容器可以在其表面上包括标记。标记可以是词语、缩写、图片或符号。

预期本说明书中所讨论的任何实施方案可以针对本发明的任何方法或组合物来实施，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。

还预期了包含本发明的组合物的产品。在非限制性方面，产品可以是保健品。保健品可以是本说明书其他章节所描述的那些，或是本领域技术人员已知的那些。在其他非限制性方面，产品可以是药品。药品和/或保健品可以是本说明书其他章节所描述的那些，或是本领域技术人员已知的那些。产品的非限制性实例包括丸剂、片剂、可食用的咀嚼物、胶囊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、喷雾剂、雾剂、可溶解的膜、透皮贴剂或液体等。

还公开了本发明的以下实施方案1至47。实施方案1是包含以下生物标志物的任一种、或任意组合的组合物：(a)精确质量为112.027amu和相对丰度为至少2.36％的生物标志物1；(b)精确质量为126.032amu和相对丰度为至少33.26％的生物标志物2；(c)精确质量为155.095amu和相对丰度为至少1.86％的生物标志物3；(d)精确质量为160.087amu和相对丰度为至少5.03％的生物标志物4；(e)精确质量为166.099amu和相对丰度为至少9.26％的生物标志物5；或(f)精确质量为507.342amu和相对丰度为至少0.60％的生物标志物8；其中各个生物标志物是在西洋接骨木中发现的，且其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。实施方案2是实施方案1的组合物，其具有生物标志物1至5和8中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部。实施方案3是实施方案1至2中任一项的组合物，其中组合物还包含以下另外的生物标志物的任一种、或任意组合或全部：(g)精确质量为358.146amu的生物标志物6；(h)精确质量为478.295amu的生物标志物7；(i)精确质量为606.436amu的生物标志物9，其中各个生物标志物是在西洋接骨木中发现的。实施方案4是实施方案3的组合物，其还包含：(j)具有至少11.37％的相对丰度的生物标志物6；(k)具有至少1.20％的相对丰度的生物标志物7；和(l)具有至少0.07％的相对丰度的生物标志物9，其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。实施方案5是实施方案1的组合物，其还包含：(a)具有2.36％至6.94％的相对丰度的生物标志物1；(b)具有33.26％至85.75％的相对丰度的生物标志物2；(c)具有1.86％至4.69％的相对丰度的生物标志物3；(d)具有5.03％至12.89％的相对丰度的生物标志物4；(e)具有9.26％至24.11％的相对丰度的生物标志物5；(f)具有0.60％至1.75％的相对丰度的生物标志物8；其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。实施方案6是实施方案4的组合物，其还包含：(j)具有11.37％至31.81％的相对丰度的生物标志物6；(k)具有1.20％至3.40％的相对丰度的生物标志物7；和(l)具有0.07％至1.38％的相对丰度的生物标志物9，其中相对丰度是与1mg/ml的组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。实施方案7是实施方案1至6中任一项的组合物，其中各个生物标志物的质量是通过实时直接分析-TOF(DART-TOF)质谱仪确定的质量。实施方案8是实施方案1至7中任一项的组合物，其中生物标志物1至9中至少一种是合成得到的。实施方案9是实施方案1至7中任一项的组合物，其中生物标志物1至9中的至少一种是从生物体得到的。实施方案10是实施方案9的组合物，其中生物标志物1至9中的至少一种是从西洋接骨木果实得到的。实施方案11是实施方案1至10中任一项的组合物，其中组合物具有至少90％、优选至少95％、或至少98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。实施方案12是实施方案1至11中任一项的组合物，其中组合物还包含抗病毒药物。实施方案13是实施方案12的组合物，其中组合物还包含抗流感药物。实施方案14是实施方案13的组合物，其中抗流感药物是奥司他韦、扎那米韦、金刚烷乙胺、金刚烷胺、帕拉米韦、或其盐，或其任意组合。实施方案15是实施方案14的组合物，其中抗流感药物是奥司他韦、其盐，或其任意组合。实施方案16是实施方案1至15中任一项的组合物，其中组合物被配制为用于口服施用。实施方案17是实施方案16的组合物，其中组合物是锭剂、散剂、片剂、明胶胶囊、缓释胶囊、速释胶囊、凝胶剂、液体溶液和/或可溶解的膜中的一种或多于一种。实施方案18是实施方案1至15中任一项的组合物，其中组合物被配制为用于局部应用、静脉内施用和/或鼻内递送。实施方案19是实施方案1至18中任一项的组合物，其中组合物具有针对流感病毒的低于500μg/ml的IC₅₀。实施方案20是实施方案1至19中任一项的组合物，其中生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒结合并阻断流感病毒进入细胞。实施方案21是实施方案20的组合物，其中生物标志物1至5和8中的至少一种能够与流感病毒的血凝素结合。实施方案22是治疗患有流感和/或流感样疾病的对象的方法，该方法包括向对象施用任一种实施方案1至21的组合物，其中对象被治疗。实施方案23是实施方案22的方法，其中对象患有发热、头痛、肌肉痛、咳嗽、黏液排出、或鼻塞，或其任意组合。实施方案24是实施方案22至23中任一项的方法，其中对象患有流感且被甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。实施方案25是实施方案24的方法，其中流感病毒是H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和/或乙型流感病毒。实施方案26是实施方案22至23中任一项的方法，其中对象患有流感样疾病并且被鼻病毒感染。实施方案27是实施方案22至26中任一项的方法，其中对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。实施方案28是实施方案22至27中任一项的方法，其中施用组合物至少一天一次，持续至少三天。实施方案29是治疗被包膜病毒感染的对象的方法，该方法包括向对象施用任一种实施方案1至21的组合物，其中对象被治疗。实施方案30是实施方案29的方法，其中对象被HIV、单纯疱疹病毒、黄病毒属病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。实施方案31是实施方案29至30中任一项的方法，其中对象被黄病毒属病毒感染，且黄病毒属病毒是Zika病毒和/或登革病毒。实施方案32是实施方案31的方法，其中对象被Zika病毒感染。实施方案33是实施方案29至32中任一项的方法，其中对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。实施方案34是实施方案29至33中任一项的方法，其中施用组合物至少一天一次，持续至少三天。实施方案35是预防对象中的流感和/或流感样疾病的方法，该方法包括向对象施用任一种实施方案1至21的组合物，其中流感和/或流感样疾病被预防。实施方案36是实施方案35的方法，其中由甲型流感病毒和/或乙型流感病毒引起的流感被预防。实施方案37是实施方案36的方法，其中流感病毒是H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和/或乙型流感病毒。实施方案38是实施方案35的方法，其中由鼻病毒引起的流感样疾病被预防。实施方案39是实施方案35至38中任一项的方法，其中对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。实施方案40是实施方案35至39中任一项的方法，其中施用组合物至少一天一次，持续至少三天。实施方案41是预防对象的包膜病毒感染的方法，该方法包括向对象施用任一种实施方案1至21的组合物，其中包膜病毒感染被预防。实施方案42是实施方案41的方法，其中被预防的包膜病毒感染是HIV、单纯疱疹病毒、黄病毒属病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的感染。实施方案43是实施方案41至42中任一项的方法，其中黄病毒属病毒感染被预防，且黄病毒属病毒是Zika病毒和/或登革病毒。实施方案44是实施方案43的方法，其中Zika病毒感染被预防。实施方案45是实施方案41至44中任一项的方法，其中对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。实施方案46是实施方案41至45中任一项的方法，其中施用组合物至少一天一次，持续至少三天。实施方案47是制备实施方案1至21中任一项的组合物的方法，其中该制备方法制备具有至少90％、优选至少95％、或至少98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性的组合物。

“治疗剂”包括本文特别要求保护的化合物。其还包括这类化合物以及其营养学和/或药学上可接受的盐。有用的盐是本领域技术人员已知的，包括与无机酸、有机酸、无机碱或有机碱形成的盐。用于本发明的治疗剂是以下那些化合物，其在无论单独或与其他营养学和/或药学赋形剂或惰性成分组合对人和动物施用后，产生期望的、有益的和通常地药理学的影响。

术语“生物标志物”指限定为生物标志物、其类似物、其衍生物、或其任意类似物或衍生物的盐形式的化合物。

术语“精确质量”指对带有已知电荷的离子经实验确定的测量的分子质量。精确质量的单位包括原子质量单位(amu)和毫统一原子质量单位(mmu)。术语“分子量”指在化合物中存在的所有不同同位素成分以它们的天然丰度加权的平均分子重量。

术语“相对丰度”指所关注的化合物相对于对照化合物的丰度的丰度。在特定的方面，相对丰度是所关注化合物的质谱峰的原始强度相比于对照化合物的质谱峰的原始强度。在一个非限制性实例中，质谱峰可以通过使用DART-TOF质谱仪获得。在另一个特定方面，对照化合物是掺入或掺杂到含有所关注化合物的样品中的化合物。在又一个特定方面，对照化合物是在其添加至样品以用于确定相对丰度之前在样品中不存在的化合物。在另一个特定方面对照化合物可以是姜黄素。

本文描述的精确质量和相对丰度基于使用特定仪器和特定设置的实验，并且可以不同仪器之间有所变化。在每次测量中都有变化性。因此，精确质量和相对丰度被限定为如本领域普通技术人员所理解的接近于。在一个非限制性实施方案中，该术语限定为在20％以内、优选10％以内、优选在5％以内、更优选在1％以内、最优选在0.5％以内。在一个非限制性实施方案中，精确质量具有+/-20mmu以内、优选+/-10mmu以内、更优选+/-5mmu以内、最优选+/-1mmu以内的误差。在一个非限制性实施方案中，相对丰度具有+/-20％、优选+/-10％、优选在+/-5％以内、更优选在+/-1％以内、最优选在+/-0.5％以内的误差。

术语“基本上”及其变体定义为如本领域普通技术人员所理解的大部分但不必全部为指定项目，并且在一个非限定性实施方案中，基本上指在10％以内、5％以内、1％以内或0.5％以内的范围。

“患者”、“对象”或“个体”指哺乳动物(例如，人类、灵长动物、狗、猫、牛、绵羊、猪、马、小鼠、大鼠、仓鼠、兔或豚鼠)。在特定方面，患者、对象或个体是人类。

“抑制”或“减少”或这些术语的任何变体包括实现期望结果的任何可测量的减少或完全的抑制。

“有效”、“治疗”或“预防”或这些术语的任何变体表示足以达到期望的、预期的或计划的结果。

当涉及化合物时，“类似物”或“相似物”指经修饰的化合物，其中一个或多于一个原子已经被其他原子取代、或其中一个或多于一个原子已经从化合物中去除、或其中一个或多于一个原子已经被添加至化合物、或这些修饰的任意组合。原子的这种添加、去除或取代可以在任意位置、或多个位置、沿着构成化合物的主结构发生。

相对于母体化合物，“衍生物”指的是经化学修饰的母体化合物或其类似物，其中至少一个取代基在母体化合物或其类似物中不存在。一个这种非限制性实例是已经被共价修饰的母体化合物。典型的修饰物是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯、聚乙二醇等。

“在治疗上等效的”化合物是在疾病或病症的治疗中具有与一种或多于一种其他化合物基本相同的效果的化合物。治疗上等效的化合物可以是或可以不是化学上等效的、生物等效的、或属类上等效的。

“肠胃外注射”指小分子药物在动物、例如人类的一层或多于一层皮肤或黏膜下或者穿过动物、例如人类的一层或多于一层皮肤或黏膜经由注射的施用。

“生物利用度”指治疗剂从制剂中被吸收的程度。

关于向对象递送或施用治疗剂，“系统的”表示治疗剂在对象的血浆中以生物显著的水平可检测。

“受控释放”指治疗剂在约一小时或更长，优选12小时或更长的时间期间以使得血液(例如血浆)浓度保持在治疗范围内、但低于毒性浓度的速度的释放。

“药学上可接受的载体”指用于将本发明的药物化合物递送到哺乳动物例如动物或人类的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或载剂。

“营养学上可接受的载体”指用于将本发明的化合物递送到哺乳动物例如动物或人类的营养学上可接受的溶剂、悬浮剂或载剂。

“药学上可接受的”成分、赋形剂或组分是与合理的收益/风险比相称的适用于人类和/或动物而没有过度不良副作用(例如毒性、刺激性和过敏反应)的成分、赋形剂或组分。

“营养学上可接受的”成分、赋形剂或组分是与合理的收益/风险比相称的适用于人类和/或动物而没有过度不良副作用(例如毒性、刺激性和过敏反应)的成分、赋形剂或组分。

术语“大约”或“约”或“基本上不变”定义为如本领域普通技术人员所理解的接近于，并且在一个非限制性实施方案中该术语定义为在10％以内，优选在5％以内，更优选在1％以内，最优选在0.5％以内。另外，“基本上无水”指以水的重量或体积计小于5％、4％、3％、2％、1％或更小。

当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”一起使用时，要素前面不使用数量词可以表示“一个”，但是其也符合“一个或更多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的意思。

如本说明书和权利要求中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是包括性的或开放式的，并且不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。

使用的组合物和方法可以“包含”本说明书通篇所公开的任意成分或步骤、“基本上由其构成”或“由其构成”。关于过渡形式“基本上由……构成”，在一个非限制性方面，本说明书所公开的组合物和方法的基本的和新颖的特征包括组合物减少或预防流感或流感样症状的能力。

本发明的其它目的、特征和优点通过以下详细的描述会变得明显。然而，应理解详细的描述和实施例在表明本发明的具体实施方案的同时仅以举例说明的方式给出。另外，预期通过该详细描述，本发明的精神和范围内的变化和修改对于本领域技术人员会变得明显。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，并被包含以进一步证实本发明的特定方面。通过参照一个或多于一个这些附图结合本文所提供的具体实施方案的详细说明可以更好地理解本发明。

图1 HSRx 351处理的组(●)和安慰剂组(■)的视觉模拟评分的建立。数据以平均值±SD的形式呈现，0＝没有问题，10＝明显的问题。图由Kong 2009适应性调整。

图2处理48小时后HSRx 351组和安慰剂组中从流感症状恢复的患者的百分比。图由Kong 2009适应性调整。

图3用HSRx 351孵育的MDCK细胞的甲型流感(H1N1)病毒感染的剂量依赖抑制曲线。使用最佳拟合线(R²＝0.92；n＝22)确定IC₅₀和IC₁₀₀值。图由Kong 2009适应性调整。

图4血细胞凝集分析证明HSRx 351阻止甲型流感病毒与红细胞结合。图标：RBC＝红细胞；PBS＝磷酸盐缓冲盐水；pAB＝抗流感抗体；病毒＝甲型流感病毒；HS9＝HSRx 351。RBC+PBS行是阴性对照行，其示出在单独的PBS中红细胞不能够血细胞凝集。病毒+PBS+RBC行是阴性对照行，其示出从右到左增加的病毒浓度使红细胞的血细胞凝集增加(参见左边2个孔中扩散的红色)。pAb+病毒+RBC行是阳性对照行，其示出在整行中恒定浓度的抗血凝素抗体抑制血细胞凝集，这通过与相应的virus+PBS+RBC孔相比，尤其是在左边起第2个和第3个孔中，在阳性对照行中减少的红细胞扩散得到证明。三个HS9+病毒+RBC行是实验行，其示出恒定浓度的HSRx351(HS9)与抗血凝素抗体相似地抑制血细胞凝集。

图5IC₅₀所需要的生物标志物6在HSRx 351中时和单独时的浓度。单独时的生物标志物6与在HSRx 351中时的生物标志物6的浓度比表明生物标志物6与另一种组分HSRx 351的协同活性。

图6IC₅₀所需要的生物标志物7在HSRx 351中时和该类似物单独时的浓度。单独时的生物标志物7类似物与在HSRx 351中时的生物标志物7的浓度比表明生物标志物7与另一种组分HSRx 351的协同活性。

图7用HSRx 351孵育的细胞的Zika病毒感染的剂量依赖抑制。

图8A和图8B消耗175mg口服锭剂(A)和350mg饮用剂(B)的人类血液中生物标志物6、生物标志物7和生物标志物9的生物可利用度。通过对从摄入后最多四小时的人类患者抽取的血液的DART-TOF分析确定血清水平。

具体实施方式

发明人已经出人意料地发现可以在接骨木中发现的几种化合物的组合可以预防和治疗流感和流感样疾病并且预防和治疗包膜病毒感染。发明人还发现了特定相对浓度的化合物起到提高组合的化合物预防和治疗病毒感染的能力的作用。此外，发明人已经发现与另外的药物例如抗流感化合物一起使用本发明的化合物提高组合的化合物预防和治疗病毒感染的能力。不希望受理论约束，认为本文公开的化合物和组合物能够阻断病毒进入细胞。流感病毒的非限制性实例包括甲型流感病毒和乙型流感病毒属内的病毒。在这些属内的流感病毒的非限制性实例包括：H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和乙型流感病毒。引起流感样疾病的病毒的非限制性实例包括鼻病毒。包膜病毒的非限制性实例包括Zika病毒、登革病毒、HIV和单纯疱疹病毒。还认为本文公开的化合物和组合物能够治疗和预防与流感感染相关的症状和/或流感样症状。症状的非限制性实例包括：寒战、咳嗽、疲劳、发热、头痛、肌肉痛和/或咽喉痛。

A.组合物的化合物

本发明的组合物可以包含在西洋接骨木(接骨木)中发现的由112.027amu、126.032amu、155.095amu、160.087amu、166.099amu和507.342amu的精确质量限定的一种或多于一种生物标志物和其组合。在另一个实施方案中，组合物还可以包含在接骨木中发现的由约358.146amu、478.295amu和606.436amu的精确质量限定的一种或多于一种生物标志物和其任意组合。不希望受理论约束，认为本发明的生物标志物阻断病毒进入细胞。

在优选的实施方案中，生物标志物或生物标志物的组合具有90％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。在另一个优选的实施方案中，化合物或化合物的组合具有95％和/或98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。

在本发明的一些方面，组合物中的化合物和衍生物以及类似物可以通过已知的合成方法来制备。在本发明的一些方面，组合物中的化合物和/或组合物可以是通过根据化学合成领域的技术人员已知的方法制备化合物和/或组合物而合成得到的。在一个实例中，化合物和/或组合物是通过有机化学方法合成的。

在本发明的一些方面，组合物的化合物和/或组合物可以是从生物体例如果实、植物、动物、真菌、细菌和/或古核生物的提取物分离的。果实的非限制性实例包括接骨木果实。组合物的化合物或组合物可以使用已知的提取方法例如使提取物与CO₂接触、使提取物与H₂O、或与EtOH:H₂O的任意组合接触，利用聚合物分离提取物的任意方法从生物体提取。用于聚合物分离的聚合物的非限制性实例包括ADS 5聚合物(南开大学，中国)。提取物可以包含在接骨木中发现的由112.027amu、126.032amu、155.095amu、160.087amu、166.099amu和507.342amu的精确质量限定的化合物的任一种或组合。在一个实例中，提取物还可以包含在接骨木中发现的由约358.146amu、478.295amu和606.436amu的精确质量限定的化合物的一种或多于一种和其任意组合。

在本发明的一些方面，组合物的化合物及其衍生物和类似物的一种或多于一种可以通过本领域技术人员已知的合成方法来制备，组合物的化合物及其衍生物和类似物的一种或多于一种可以是从其他来源，例如但不限于果实和植物的提取物分离的。

B.通过DART TOF/MS限定的活性物

本发明的组合物可以包含在接骨木中发现的由约112.027amu、126.032amu、155.095amu、160.087amu、166.099amu和507.342amu的精确质量限定的一种或多于一种化合物和其任意组合。本发明的组合物还可以包含在接骨木中发现的由约358.146amu、478.295amu和606.436amu的精确质量限定的一种或多于一种化合物和其任意组合；其他产品；和/或其任意组合。

本文描述的精确质量和相对丰度基于使用特定仪器和特定设置的实验，并且可以在不同仪器之间有所变化。在每次测量中都有变化性。因此，精确质量和相对丰度被限定为如本领域普通技术人员所理解的接近于。在一个非限制性实施方案中，该术语限定为在20％以内、优选在10％以内、优选在5％以内、更优选在1％以内、最优选在0.5％以内。在一个非限制性实施方案中，精确质量具有+/-20mmu以内、优选+/-10mmu以内、更优选+/-5mmu以内、最优选+/-1mmu以内的误差。在一个非限制性实施方案中，相对丰度具有+/-20％、优选+/-10％、优选在+/-5％以内、更优选在+/-1％以内、最优选在+/-0.5％以内的误差。

在非限制性实例中，本发明的化合物可以使用实时直接分析(DART)飞行时间/质谱(TOF/MS)来鉴定。特别地，可以使用美国皮博迪，MA的Jeol的JEOL DART^TMAccuTOF-质谱仪(JMS-T100LC)。精确质量可以通过从样品产生的离子的测量质量减去质子质量(1.007825amu)来确定。在样品中化合物的质量可以通过借助于Dip-IT取样器和Dip-IT取样器支撑物(ionSense^TM)直接将样品引入离子流来确定。虽然利用DART的简单分析不需要样品制备，但可以使用化学掺杂的/掺入的溶液以用于相对于已知量的定量。作为非限制性实例，姜黄素不存在于接骨木提取物中，因此可以用于生成生物活性分子的化学定量曲线。DART离子源的设置可以如下：

气体:He

流量:2.52LPM@50PSI

温度:250℃

针电压:3000V

栅极电压:250V

放电电极电压:400V。

JEOL AccuTOF MS的设置可以如下：

峰值电压:1000V

孔1温度:120℃

检测器电压:2600V

反射器电压:990.0V。

样品可以通过DART-TOF MS以一式六份来分析。可以分析这六个样品以生成样品的单个的、平均的、过滤的和统计上显著的DART指纹。该经处理的指纹之后可以用于通过质量比较来确定生物活性标志物的存在。由于这些生物活性标志物的最初发现和鉴定，简单的质量对比足以确定在任意提取物或化学物质的混合物中它们的存在。

所有的MS都具有质量公差——在预测的[M+H]或[M-H]值附近的可接受的报告质量的范围。对于AccuTOF，该质量公差小于20毫质量单位(mmu)(预测质量+/-10mmu)。假定相同的样品和离子源，其他TOF-MS可能具有更高或更低的质量公差。

在另一个非限制性实例中，本发明的化合物可以使用美国皮博迪，MA的Jeol的JEOL DART^TMAccuTOF-质谱仪(JMS-T100LC)通过DART TOF/MS确定，其使用以下DART离子源的设置在阳离子模式([M+H]⁺)下执行：

气体:He

流量:3.98L/分钟

针电压:3500V

温度:300℃

电极1电压:150V

电极2电压:250V。

JEOL AccuTOF MS的设置可以如下：

峰值电压:1000V

孔1电压:20V

环形透镜电压:5V

孔2电压:5V

检测器电压:2550V。

可以对每个样品使用来自罗得岛州Ultra Chemical of North Kingston的提供整个100amu至1000amu的所需质量范围的质量标志物的PEG 600的10％(重量/体积)溶液内部地进行校准。校准公差可以保持在5mmu。可以使用封端的硼硅酸盐玻璃熔点毛细管将样品引入到DART He等离子体中直至在总离子色谱图(TIC)中获得信号。然后在TIC回到基线水平时可以引入下一个样品。

C.另外的抗病毒药物

抗病毒药物可以但不限于抑制病毒进入宿主细胞、阻止病毒从宿主细胞萌出、阻止在宿主细胞中复制、或破坏或抑制病毒颗粒。抗病毒药物包括对一种或一些病毒特异的或对几种类型的病毒广谱的那些。抗病毒药物包括是复方药物和单一药物的那些。抗流感药物是抗病毒药物的非限制性实例。在一个实施方案中，本文公开的组合物还包含至少一种另外的抗病毒药物。

抗流感剂是用于减少流感病毒载量或预防病毒感染的化合物或组合物。抗流感剂的非限制性实例包括奥司他韦(也称为)、扎那米韦帕拉米韦金刚烷乙胺(也称为)和金刚烷胺(也称为)。一些抗流感剂抑制神经氨酸酶，其阻止病毒后代从受感染的细胞中释放。阻止病毒后代从受感染的细胞中释放的抗流感剂的非限制性实例包括神经氨酸酶抑制剂，例如奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦。一些抗流感剂阻断病毒编码的M2离子通道。阻断M2离子通道的抗流感剂的非限制性实例是金刚烷乙胺和金刚烷胺。流感病毒的非限制性实例包括甲型流感病毒属和乙型流感病毒属的病毒。在一个实例中，病毒包括但不限于H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和乙型流感病毒。在一个实施方案中，本文公开的组合物还包含至少一种另外的抗流感剂，其可以是但不限于奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、金刚烷乙胺和金刚烷胺。

D.成分的量

预期本发明的组合物可以包含任意量的本说明书所讨论成分。组合物还可包含任意数目的在本说明书全文中所描述的另外成分的组合(例如，稳定剂、填充剂、药学上和/或营养学上可接受的盐、和/或另外的药学和/或营养学成分)。在组合物中任意成分的浓度可以改变。例如，在非限制性实施方案中，组合物在其最终形式中可以包含例如至少约0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.0008％、0.0009％、0.0010％、0.0011％、0.0012％、0.0013％、0.0014％、0.0015％、0.0016％、0.0017％、0.0018％、0.0019％、0.0020％、0.0021％、0.0022％、0.0023％、0.0024％、0.0025％、0.0026％、0.0027％、0.0028％、0.0029％、0.0030％、0.0031％、0.0032％、0.0033％、0.0034％、0.0035％、0.0036％、0.0037％、0.0038％、0.0039％、0.0040％、0.0041％、0.0042％、0.0043％、0.0044％、0.0045％、0.0046％、0.0047％、0.0048％、0.0049％、0.0050％、0.0051％、0.0052％、0.0053％、0.0054％、0.0055％、0.0056％、0.0057％、0.0058％、0.0059％、0.0060％、0.0061％、0.0062％、0.0063％、0.0064％、0.0065％、0.0066％、0.0067％、0.0068％、0.0069％、0.0070％、0.0071％、0.0072％、0.0073％、0.0074％、0.0075％、0.0076％、0.0077％、0.0078％、0.0079％、0.0080％、0.0081％、0.0082％、0.0083％、0.0084％、0.0085％、0.0086％、0.0087％、0.0088％、0.0089％、0.0090％、0.0091％、0.0092％、0.0093％、0.0094％、0.0095％、0.0096％、0.0097％、0.0098％、0.0099％、0.0100％、0.0200％、0.0250％、0.0275％、0.0300％、0.0325％、0.0350％、0.0375％、0.0400％、0.0425％、0.0450％、0.0475％、0.0500％、0.0525％、0.0550％、0.0575％、0.0600％、0.0625％、0.0650％、0.0675％、0.0700％、0.0725％、0.0750％、0.0775％、0.0800％、0.0825％、0.0850％、0.0875％、0.0900％、0.0925％、0.0950％、0.0975％、0.1000％、0.1250％、0.1500％、0.1750％、0.2000％、0.2250％、0.2500％、0.2750％、0.3000％、0.3250％、0.3500％、0.3750％、0.4000％、0.4250％、0.4500％、0.4750％、0.5000％、0.5250％、0.0550％、0.5750％、0.6000％、0.6250％、0.6500％、0.6750％、0.7000％、0.7250％、0.7500％、0.7750％、0.8000％、0.8250％、0.8500％、0.8750％、0.9000％、0.9250％、0.9500％、0.9750％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2.0％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3.0％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4.0％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5.0％、5.1％、5.2％、5.3％、5.4％、5.5％、5.6％、5.7％、5.8％、5.9％、6.0％、6.1％、6.2％、6.3％、6.4％、6.5％、6.6％、6.7％、6.8％、6.9％、7.0％、7.1％、7.2％、7.3％、7.4％、7.5％、7.6％、7.7％、7.8％、7.9％、8.0％、8.1％、8.2％、8.3％、8.4％、8.5％、8.6％、8.7％、8.8％、8.9％、9.0％、9.1％、9.2％、9.3％、9.4％、9.5％、9.6％、9.7％、9.8％、9.9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％或其中可得到的任何范围的在本说明书和权利要求通篇所提及的至少一种成分、主要由其构成或由其构成。在非限制性方面，百分比可以通过总组合物的重量或体积或者相对丰度来计算。本领域普通技术人员应理解，给定组合物中的浓度可以根据成分的添加、替换和/或减少而改变。

E.另外的组分

本发明的化合物可以配制成用于向人类或非人类动物患者施用的任何合适的组合物形式。

根据施用方式和剂型的性质，组合物可以仅由要求保护的化合物构成、或可以包含这些化合物和任意合适的另外组分，例如一种或多于一种药学上和/或营养学上可接受的载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂，例如防腐剂、填充剂、崩解剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、香料、抗细菌剂、抗真菌剂、润滑剂和分散剂。各个载体在与制剂的其他成分相容且对患者无害的方面必须是可接受的。

1.赋形剂

本发明的组合物中采用的赋形剂可以是固体、半固体、液体或其组合。优选地，赋形剂是固体。含有赋形剂的本发明的组合物可以通过任意已知技术来制备，包括例如将赋形剂与要求保护的化合物混合来制备。本发明的药物组合物每单位剂量含有期望量的要求保护的化合物，如果预期用于口服施用，它可以是例如片剂、囊片、丸剂、硬胶囊或软胶囊、锭剂、扁囊剂、可分配的散剂、颗粒剂、悬浮液、酏剂、分散剂的形式，或合理地适用于这种施用的任意其他形式。如果预期用于肠胃外施用，它可以是例如悬浮剂或透皮贴剂的形式。如果预期用于直肠施用，它可以是例如栓剂的形式。目前优选的是口服剂型，其为各自含有预定量的要求保护的化合物的离散剂量单位，例如片剂或胶囊。

2.载体/稀释剂

合适的载体或稀释剂示例性地包括但不限于，单独地或组合地，乳糖，包括无水乳糖和一水合乳糖；淀粉，包括直接可压性淀粉和水解淀粉(例如，Celutab^TM和Emdex^TM)，甘露醇、山梨醇、木糖醇、右旋糖(例如，Cerelose^TM2000)和一水合右旋糖、二水合磷酸氢钙、基于蔗糖的稀释剂、糖粉，一水合单碱硫酸钙、二水合硫酸钙、颗粒状三水合乳酸钙、葡萄糖结合剂、肌醇、水解麦片固体、直链淀粉、纤维素，包括微晶纤维素、食品级来源的α-纤维素和非晶纤维素(例如，RexcelJ)、粉状纤维素、羟丙基纤维素(HPC)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)、碳酸钙、甘氨酸、黏土、膨润土、嵌段共聚物、聚乙烯吡咯烷酮等。这类载体或稀释剂，如果存在的话，总计构成组合物的总重量的约5％至约99.999％、约10％至约85％和约20％至约80％。优选地选择的载体或稀释剂表现出合适的流动特性以及在片剂的情况下合适的压缩性。

3.崩解剂

本发明的组合物任选地可以包含一种或多于一种药学上和/或营养学上可接受的崩解剂作为赋形剂，尤其是用于片剂制剂。合适的崩解剂包括但不限于，单独地或组合地，淀粉，包括羧基乙酸淀粉钠和预胶化的玉米淀粉、黏土、纤维素例如纯化的纤维素、微晶纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素和羧甲基纤维素纳、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐、交联聚维酮和树胶例如琼脂胶、瓜尔豆胶、槐豆胶、卡拉胶、果胶和黄蓍胶。崩解剂可以在组合物制备期间的任意合适的步骤、尤其是在造粒之前或在压制之前的润滑步骤期间添加。这类崩解剂，如果存在的话，总计构成组合物的总重量的约0.2％至约30％、优选约0.2％至约10％和更优选0.2％至约5％。

4.黏合剂

本发明的组合物可以包含黏合剂或胶黏剂，尤其是对于片剂制剂。这类黏合剂和胶黏剂优选地赋予被压片的粉末足够的内聚力以允许正常的加工操作，例如上浆、润滑、压制和包装，但仍允许片剂崩解和在摄入后组合物被吸收。这类黏合剂还可以在盐被溶于溶液中后防止或抑制本发明共结晶的结晶或重结晶。合适的黏合剂和胶黏剂包括但不限于，单独地或组合地，阿拉伯胶；黄蓍胶、蔗糖、明胶、葡萄糖、淀粉，例如但不限于预胶化的淀粉，纤维素，例如但不限于甲基纤维素和羧甲基纤维素纳，海藻酸和海藻酸的盐；硅酸镁铝、PEG、瓜尔豆胶、多糖酸、膨润土、聚维酮、聚甲基丙烯酸酯、HPMC、羟丙基纤维素和乙基纤维素。这类黏合剂和/或胶黏剂，如果存在的话，总计构成药物组合物的总重量的约0.5％至约25％、优选约0.75％至约15％和更优选1％至约10％。许多黏合剂是包含酰胺、酯、醚、醇或酮基团的聚合物，就其本身而言，可以被包含在本发明的药物组合物中。聚乙烯吡咯烷酮是用于缓释片剂的黏合剂的非限制性实例。聚合物黏合剂可以具有不同的分子量、交联度和聚合度。聚合物黏合剂还可以是共聚物，例如含有亚乙基氧和亚丙基氧单元的嵌段共聚物。给定聚合物中这些单元比例的变化影响特性和性能。

5.润湿剂

润湿剂可以在本发明的组合物中使用。可以选择润湿剂为使晶体保持与水紧密缔合，其为一种可以提高组合物的生物可利用度的条件。这类润湿剂还可以用于使晶体增溶或增加晶体的溶解度。表面活性剂可以用作润湿剂。可以用作本发明组合物中的润湿剂的表面活性剂的非限制性实例包括季铵化合物，例如苯扎氯铵、苄索氯铵和西吡氯铵、硫琥辛酯钠、聚氧乙烯烷基苯基醚、泊洛沙姆(聚氧乙烯和聚氧丙烯嵌段共聚物)、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯和油，例如聚氧乙烯(8)辛酸/癸酸单甘油酯和聚氧乙烯(8)辛酸/癸酸二甘油酯、聚氧乙烯(35)蓖麻油和聚氧乙烯(40)氢化蓖麻油，聚氧乙烯烷基酯，例如聚氧乙烯(20)鲸蜡硬脂基醚，聚氧乙烯脂肪酸酯，例如聚氧乙烯(40)硬脂酸酯，聚氧乙烯失水山梨醇酯，例如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80，丙二醇脂肪酸酯，例如丙二醇月桂酸酯，月桂基硫酸钠，脂肪酸及其盐，例如油酸、油酸钠和油酸三乙醇胺，甘油基脂肪酸酯，例如单硬脂酸甘油酯，失水山梨醇酯，例如失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单油酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯和山梨醇酐单硬脂酸酯，四丁酚醛，和其混合物。这类润湿剂，如果存在的话，总计构成药物组合物的总重量的约0.25％至约15％、优选约0.4％至约10％和更优选0.5％至约5％。

6.润滑剂

润滑剂可以包含在本发明的组合物中。合适的润滑剂包括但不限于，单独地或组合地，山嵛酸甘油酯(glyceryl behapate)，硬脂酸及其盐，包括硬脂酸镁、硬脂酸钙和硬脂酸钠；氢化植物油、胶体二氧化硅、滑石、蜡、硼酸、苯甲酸钠、乙酸钠、富马酸钠、氯化钠、DL-亮氨酸、PEG(例如，陶氏化学公司的Carbowax^TM4000和Carbowax^TM6000)、油酸钠、月桂基硫酸钠和月桂基硫酸镁。这类润滑剂，如果存在的话，总计构成组合物的总重量的约0.1％至约10％、优选约0.2％至约8％和更优选0.25％至约5％。

7.其他试剂

表面活性剂、乳化剂或泡腾剂可以用于组合物。乳化剂可以用于帮助成分在软明胶胶囊内溶解。表面活性剂、乳化剂或泡腾剂的非限制性实例包括D-山梨醇、乙醇、角叉菜胶、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、瓜尔豆胶、甘油、甘油脂肪酸酯、胆固醇、白蜂蜡、磺基丁二酸钠二辛酯、蔗糖脂肪酸酯、硬脂醇、硬脂酸、聚乙二醇40硬脂酸酯、失水山梨醇倍半油酸酯、鲸蜡醇、明胶、失水山梨醇脂肪酸酯、滑石、失水山梨醇三油酸酯、石蜡、马铃薯淀粉、羟丙基纤维素、丙二醇、丙二醇脂肪酸酯、果胶、聚氧乙烯(105)聚氧丙烯(5)二醇、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油40、聚氧乙烯氢化蓖麻油60、聚烃氧35蓖麻油、聚山梨酯20、聚山梨酯60、聚山梨酯80、聚乙二醇400、辛基十二醇肉豆蔻酸酯、甲基纤维素、失水山梨醇单油酸酯、甘油单硬脂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、月桂基二甲基胺氧化物溶液、月桂基硫酸钠、聚桂醇、干燥碳酸钠、酒石酸、氢氧化钠、纯化的大豆卵磷脂、大豆卵磷脂、碳酸钾、碳酸氢钠、中链甘油三酸脂、柠檬酸酐、棉籽油-大豆油混合物、和液体石蜡。

F.载剂

各种递送体系是本领域已知的并且可以用于施用本发明的治疗剂或组合物，例如在脂质体中的包封、微颗粒、微胶囊、受体介导的內吞等。施用的方法包括但不限于肠胃外、动脉内、肌肉内、静脉内、鼻内和口服途径。组合物可以以下形式提供：片剂、锭剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、安瓿、栓剂或气溶胶形式。组合物还可以以下形式提供：活性成分在水性或非水性稀释剂中的悬浮液、溶液和乳液，糖浆剂、颗粒剂或散剂。

G.制剂和施用

组合物可以例如是药物组合物(药物)和非处方组合物(OTC)、营养制剂等。根据本发明的组合物包括适合用于口服或肠胃外途径的制剂。特定途径的非限制性实例包括真皮内、皮下、肌肉内、静脉内、局部注射、直肠、鼻内吸入、吹入、局部的(包括经皮的、口腔的和舌下的)、阴道的、肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮肤内)和经肺的施用。制剂可以方便地以单位剂量形式存在和可以通过本领域众所周知的任意方法制备。这类方法包括使活性成分与构成一种或多于一种配合成分的载体结合的步骤。通常，制剂是通过使活性成分与合适的载体例如液体载体或细分的固体载体或两者均匀地且充分地结合，然后如果必要的话使产品成形来制备的。适用于口服施用的本发明的制剂可以作为各自含有预定量的活性成分的离散单位例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，或作为水包油液体乳液、油包水液体乳液，或作为水溶液例如茶内的补充物存在。活性成分也可以作为大丸药、药糖剂或糊剂存在。有用的可注射制剂包括复方组合物在水性或油性载剂中的无菌悬浮液、溶液或乳液。组合物还可含有配制剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。注射用制剂可以以单位剂量形式存在，例如在安瓿或在多剂量容器中，并且可以含有添加的防腐剂。或者，可注射的制剂可以以粉末形式来提供，以在使用之前利用包括但不限于无菌无热原的水、缓冲液、右旋糖溶液等的合适的载剂来进行重构。为此，可以通过领域内已知的任何技术如冻干将复方组合物干燥，并在使用之前重构。

适用于在嘴中局部施用的制剂包括在调味基质中，通常在蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶中包含活性成分的锭剂；在惰性基质例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯树胶中包含活性成分的软锭剂；在合适的液体载体中包含活性成分的漱口水和包含活性成分的巧克力。

根据本发明的适合局部施用的制剂可以配制成软膏、霜剂、悬浮剂、洗剂、散剂、溶液剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气溶胶或油状物。或者，制剂可以包括贴剂或辅料，例如浸渍有活性成分和任选地一种或多于一种赋形剂或稀释剂的绷带或橡皮膏。局部制剂优选地包含有利于活性成分通过皮肤吸收并进入血流的化合物。

适用于鼻内施用的、其中载体是固体的制剂包括粒度为例如约20微米至约500微米的粗粉末，其以以下方式施用：其中进行用力吸气的方式，即通过从紧挨鼻子保持的粉末的容器通过鼻通道快速吸入。合适制剂包含试剂的水性或油性溶液，该制剂中的载体是用于例如通过雾化器的非限制性实例进行鼻内施用的液体。制剂优选可以包含有利于活性成分通过皮肤吸收并进入血流的化合物。

适用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使得制剂与预计的接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠剂和设计为将化合物靶向至血液组分或一种或多于一种器官的脂质体或其他微颗粒体系。制剂可以以单剂量或多剂量或多剂量密封的容器，例如安瓿和小瓶存在，并且可以储存在冷冻干燥的(冻干的)条件下，其仅需要在使用前立即添加无菌液体载体例如注射用水。临时的注射溶液和悬浮液可以由先前描述种类的无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。

用于口服施用的液体制剂可以采用例如酏剂、溶液、糖浆或混悬剂的形式，或者其可以作为在使用之前与水或其它合适的载剂重构的干燥产品存在。可以通过常规方法用如以下的药学上和/或营养学上可接受的添加剂来制备这种液体制剂：悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪)、乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水载剂(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏植物油)和防腐剂(例如，甲基或丙基对羟基苯甲酸酯或山梨酸)。制剂也可根据需要含有缓冲盐、防腐剂、调味剂、着色剂和甜味剂。

对于口腔施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的非限制性实例的形式。

对于直肠和阴道途径的施用，复方组合物可以配制为含有常规栓剂基质例如可可油或其他甘油酯的溶液(用于保留灌肠)、栓剂、或软膏。

对于经鼻施用或者通过吸入或吹入的施用，在使用合适的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氟碳化合物、二氧化碳或其他合适的气体的情况下，复方组合物可以方便地从加压容器或喷雾器以气溶胶喷雾的形式递送。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供递送计量的量的阀来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如由明胶组成的胶囊和药筒)可以配制成含有化合物与适当的粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。

对于延长的递送，复方组合物可以配制为储库型(depot)制剂，用于通过植入或肌内注射施用。复方组合物可以用适当的聚合物或疏水材料(例如，作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或者配制为微溶的衍生物，例如微溶的盐。或者，可以使用被制造为缓慢释放复方组合物以用于经皮吸收的黏附片或贴剂的经皮递送体系。为此，可以使用渗透促进剂来促进复方组合物的经皮渗透。合适的经皮贴剂在例如以下专利中描述：美国专利第5407713号、美国专利第5352456号、美国专利第5332213号、美国专利第5336168号、美国专利第5290561号、美国专利第5254346号、美国专利第5164189号、美国专利第5163899号、美国专利第5088977号、美国专利第5087240号、美国专利第5008110号和美国专利第4921475号。

或者，可以采用其它递送体系。脂质体和乳剂是已知可用于递送复方组合物的递送载剂的实例。尽管通常代价为较大的毒性，也可以采用一些有机溶剂例如二甲亚砜(DMSO)。

应理解，除了以上具体提及的成分之外，可用于本发明的制剂可以包含关于所讨论制剂类型的本领域常规的其他试剂。例如，适用于口服施用的制剂可以包含如甜味剂、增稠剂和调味剂的其他试剂。还预期的是本发明的试剂、组合物和方法与其他合适的组合物和疗法组合。

在一个实施方案中，本发明的药学和/或营养学组合物可以局部地施用至需要治疗的区域，这种局部施用可以通过例如局部输注、注射或借助于导管来实现。在另一个实施方案中，本发明的化合物或组合物是以在疾病部位获得活性化合物的峰值浓度的方式来施用。在疾病部位的峰值浓度可以例如通过任选地在生理盐水中的试剂的静脉内注射、或口服施用例如含有活性成分的片剂、胶囊剂或糖浆。

H.其他药学和/营养学试剂

本发明的药物、OTC制剂和/营养制剂可以与其他药物或生物活性剂同时地或顺序地施用。实例包括但不限于抗流感剂、抗氧化剂、自由基清除剂、镇痛剂、麻醉剂、肛肠药剂、抗组胺、抗炎剂，包括非甾类抗炎药物、抗生素、抗真菌剂、抗病毒剂、抗微生物剂、抗癌活性物、抗肿瘤剂、生物活性蛋白质和肽、酶、止血剂、类固醇，包括激素和皮质类固醇等。

I.治疗方法和剂量

优选的单位剂量制剂是含有每日剂量或单位试剂、每日子剂量或其合适部分的试剂的那些。治疗量可以经验地确定和会随着被治疗的病理、被治疗的对象和试剂的效力和毒性变化。相似地，本领域普通技术人员可以容易地确定合适剂量的制剂和施用试剂的方法。

在一些实施方案中，本发明的治疗方法可以包括通过以治疗疾病、病症或病况有效的量向患有这类疾病或病症的对象施用如本文所描述的稳定制剂来治疗疾病、病症或病况。在一些实施方案中，向对象施用包含本文要求保护的化合物的稳定制剂。疾病、病症或病况可以是由流感病毒引起的。此外，疾病、病症或病况可以是流行性感冒、流感和/或具有流感样症状的疾病和相关的疾病、病症和病况。对于预防性施用，可以对有发展前述病况之一的风险的患者施用组合物。

组合物的施用量取决于多种因素，包括例如正在治疗的具体适应症、施用方式、预期益处是预防性还是治疗性的、正在治疗的适应症的严重性以及患者的年龄和体重等。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力范围之内。在本发明的一些方面，复方组合物的总剂量通常为约0.0001mg/kg患者/天至约100mg/kg患者/天、或0.001mg/kg患者/天至约100mg/kg患者/天、或0.01mg/kg患者/天至约100mg/kg患者/天，但可以更高或更低，除其他因素，这取决于组分的活性、其生物利用度、施用方式、以及以上讨论的各种因素。可单独调整剂量和间隔以提供足以保持治疗或预防作用的化合物血浆水平。例如，除其他因素，根据施用的方式、所治疗的特定适应症和处方医师的判断，可以每周一次、每周几次(例如每隔一天)、每天一次、每天多次地施用化合物。在另一个非限制性实例中，可以向对象施用化合物1天、2天、3天、4天、5天、6天、一周或更长时间。技术人员会能够优化有效局部剂量而无需过度实验。

J.试剂盒

在本发明的另一个方面，提供用于治疗本文所述的疾病、病症或病况的试剂盒。例如，本发明的组合物可以包含在试剂盒内。试剂盒可以包括容器。容器可以包括瓶子、金属管、层压管、塑料管、分配器、吸管、压力容器、屏障容器、包装、分室、或其它类型的容器，例如注塑成型或吹塑成型的塑料容器，其中保存分散体或组合物或期望的瓶子、分配器或包装。试剂盒和/或容器在其表面上可包含标记。举例来说，标记可以是字词、短语、缩写、图片或符号。

容器可以分配预定量的组合物。在其他实施方案中，可以挤压容器(例如金属管、层压管或塑料管)以分配期望量的组合物。组合物可以以喷雾、气溶胶、液体、流体、半固体或固体的形式分配。在优选的实施方案中，组合物以片剂或锭剂的形式分配。容器可以具有喷雾、抽吸或挤压机构。试剂盒还可以包含使用试剂盒组分以及使用任何其他包含于容器内的组合物的说明书。说明书可以包含如何施用、使用和保存组合物的说明。如果需要的话，组合物可以存在于包装或分配装置中，其可含有一个或多于一个包含复方组合物的单位剂型。包装可以例如包括金属箔或塑料箔，如泡罩包装。包装或分配装置可以附有施用说明书。

实施例

本发明会通过具体的实施例更加详细地描述。以下实施例是为了说明性目的而提供，不打算以任何方式限制本发明。本领域技术人员会容易地识别出可以变化或改变以产生基本相同结果的各种非关键性参数。

组合的结果出人意料地表明本文公开的组合物可以用于治疗和预防流感和流感样疾病并且可以用于治疗和预防包膜病毒感染。

实施例1

(通过精确质量和相对丰度的化合物表征)

发明人已经出人意料地发现接骨木中发现的几种化合物的组合可以预防和治疗流感病毒感染。发明人还发现特定相对浓度的化合物起到提高组合的化合物预防和治疗流感病毒感染的能力的作用。此外，发明人已经发现与另外的抗流感化合物一起使用本发明的化合物也提高组合的化合物预防和治疗流感病毒感染的能力。本发明的组合物包含在接骨木中发现的具有112.027amu、126.032amu、155.095amu、160.087amu、166.099amu、和507.342amu的精确质量的化合物限定的生物标志物化合物。这些化合物可以合成地制备或者从例如但不限于西洋接骨木的生物体中分离。组合物还可以含有在西洋接骨木中发现的具有358.146amu、478.295amu、和606.436amu的精确质量的生物标志物化合物。可以通过本领域技术人员已知的方法表征化合物。

用于精确质量的方法：表征化合物并且使用实时直接分析(DART)离子源结合飞行时间/质谱仪(TOF-MS)来确定相对丰度。特别地，DART TOF-MS是美国皮博迪，MA的Jeol的JEOL DART^TMAccuTOF-质谱仪(JMS-T100LC)。化合物的质量是在西洋接骨木提取物样品中通过借助于Dip-IT取样器和Dip-IT取样器支撑物(ionSense^TM)直接将样品引入离子流来确定。

DART离子源的设置如下：

气体:He

流量:2.52LPM@50PSI

温度:250℃

针电压:3000V

栅极电压:250V

放电电极电压:400V。

JEOL AccuTOF MS的设置如下：

峰值电压:1000V

孔1温度:120℃

检测器电压:2600V

反射器电压:990.0V。

提取物样品通过DART-TOF MS以一式六份来分析。分析这六个样品以生成提取物的单个的、平均的、过滤的和统计上显著的DART指纹。该经处理的指纹之后用于通过质量比较来确定生物活性物的存在。由于这些生物活性标志物的最初发现和鉴定，简单的质量对比足以确定在任意提取物或化学物质混合物中它们的存在。对于AccuTOF，该质量公差小于20毫质量单位(mmu)(预测质量+/-10mmu)。假定相同的提取物和离子源，其他TOF质谱仪可能具有更高或更低的质量公差。

用于相对丰度的方法：虽然利用DART的简单分析不需要样品制备，但使用姜黄素掺杂的/掺入的溶液以通过相对于已知量的定量来确定所测试组合物的相对丰度。众所周知的并且天然存在于接骨木中的标准物质，例如芦丁，会鉴于任意数量的影响因素—生长条件、收获时间、植物健康状况等而变化。为了定量生物标志物，芦丁(或其他天然存在的标准物质)的天然变化使得其不能被接受用作生物标志物的绝对定量的基础。为了消除该不一致性，使用非天然产自于接骨木的化合物(在该情况下为姜黄素)作为用于生物活性分子的化学定量曲线的基础。

为了确定具有未知浓度的本文公开的生物标志物的样品的相对丰度，用0.01mg/ml姜黄素掺杂/掺入1mg/ml所公开组合物的样品。然后通过以上使用的DART-TOF方法分析样品。

表1公开了在包含全部9种生物标志物的非限制性的优选实施方案中发现的本文公开的生物标志物的相对丰度。

表1.使用掺入有0.01mg/ml姜黄素的1mg/ml组合物确定的在优选的活性组合物中的生物标志物的相对丰度。

实施例2

(用于实施例3至实施例8的制剂)

包含具有体外和体内抗病毒活性的生物标志物1至生物标志物9的剂量可靠的接骨木提取物一般地根据Fink等人2009和Roschek Jr.等人2009中描述的方法制备。

一般地，研磨接骨木果实(西洋接骨木)并用EtOH:H₂O(4:1，体积/体积)提取。将收集的部分在50℃下干燥过夜以产生结晶粉末。多次重复步骤以确保提取物的重现性。

实施例3

(安全性)

测试HSRx 351以确定体外细胞毒性。使用标准线粒体还原酶活性分析(MTT)确定了HSRx 351没有表现出毒性的迹象。MTT分析测量MDCK细胞中的细胞代谢。在任何测试浓度下(0.02mg/ml至2.4mg/ml)都显示没有毒性。

实施例4

(生物可利用度)

使用含有175mg HSRx 351的锭剂和含有350mg HSRx 351的饮剂对HSRx 351进行测试以确定在人类对象中的生物可利用度。确定了在消耗后早在20分钟在人类对象的血液中看到了生物标志物，而一些生物标志物在血流中保留超过4小时。Roschek和Alberte2008中描述了步骤和结果，结果在以下表2、图8A和图8B中示出。

锭剂—简单地说，在研究开始之前24小时使6个对象的饮食不含有黄酮类化合物。以0至480分钟的几个时间间隔收集血液样品。在时间零点之后立即给予对象含有175mgHSRx 351的锭剂并使锭剂在口腔中缓慢溶解。

饮剂—简单地说，一个对象在血液收集开始和消耗饮剂之前24小时禁食。在研究过程期间，对象仅接收水和无黄酮类化合物的食物。以0至360分钟的几个时间间隔收集血液样品。在时间零点后立即给予对象8盎司饮剂，其含有溶解于其中的含有总计350mg HSRx351的两个锭剂。

表2：在HSRx 351中的生物标志物6、生物标志物7和生物标志物9的生物可利用度百分比，其通过使锭剂溶解在口腔中或通过咽下溶解的锭剂口服递送(由Roschek和Alberte 2008适应性修改)。

实施例5

(流感感染和/或流感样症状的治疗)

对HSRx 351，即包含生物标志物1至生物标志物9的所公开组合物的优选实施方案，进行测试以确定组合物的抗病毒特性和在人类对象中缓解流感症状的效力。

人类研究——为进行人类研究，评价HSRx 351治疗六种流感和/流感样症状的能力。研究表明HSRx 351减少全部六种症状。所使用的方法在Kong 2009中描述。

处理：简单地说，将HSRx 351组合物配制成含有总计175mg的生物标志物1至生物标志物9的缓慢溶解的锭剂。以相似的包装提供外观、味道和除了缺少HSRx 351之外组成相同的安慰锭剂。进行随机双盲安慰剂对照的试点临床试验以评价所测试组合物用于治疗流感和/或流感样症状的效力。研究中包含健康的、仅出现流感症状短于24小时的64名志愿者(年龄范围为16岁至60岁)。参与者具有以下症状的至少三种：发热、头痛、肌肉痛、咳嗽、黏液排出和鼻塞。从研究中排除怀孕的、哺乳的、患有慢性疾病的、被怀疑具有细菌感染的、参与其他临床试验、或最近接受流感药物、抗病毒治疗或流感疫苗的患者。要求患者一天服用四次HSRx 351锭剂(n＝32)或安慰锭剂(n＝32)，持续两天，每餐前一次，睡前一次。在研究者决定将患者纳入到研究中之后立即施用第一剂药物。

评价：评估六种流感样症状的严重性以确定HSRx 351的效力：发热、头痛、肌肉痛、咳嗽、黏液排出和鼻塞。为了确定安慰剂和处理组是否是临床上可比较的，以视觉模拟评分(VAS)在处理开始时(基线)从0＝没有问题至10＝显著的问题来评估患者症状。之后，指示患者通过VAS自我评价他们的症状并在两天处理期间一天四次地在施用锭剂后对其症状改善评分。将评估用于统计分析。

统计分析：假定为连续的变量被表示为平均值，其具有使用Student’s t分布方法构建的95％置信区间。标准偏差和总范围用作分布指数。使用显著水平为5％的双边检验进行组内和组间分析。为了在组间和组内进行比较，利用重复测量使用方差模型的分析来分析连续分布变量。

结果：在安慰剂组和HSRx 351处理组之间没有观察到人口统计学特征的明显差异(表3)。在第一次处理之前，评价患者的流感样症状(表4)。除了发热的平均VAS分数之外(p＝0.0256)，在第一次处理前的多数症状的平均VAS分数在两组之间没有表现出显著差异(p＞0.05)(表5A)。

表3.所包括患者的人口统计学特征(由Kong 2009适应性修改)。

表4.在研究开始时处理组和对照组中症状的分布(由Kong 2009适应性修改)。

发热：HSRx 351组32名患者中的15名(46.9％)和安慰剂组32名患者中的9名(28.1％)在研究开始时发热(表4)。温度为37.3℃至38.8℃。在处理的第一个24小时后，HSRx 351组表现出发热的显著减轻，如平均VAS分数从2.67±1.80减少至0.47±0.64(p＜0.0001)(图1)以及60％的发热患者回到正常温度(图2)所证明的。HSRx 351组中的所有发热患者在48小时内都回到正常温度(图2)。在安慰剂组，大多数患者在48小时处理期内没有表现出发热的任何改善，并且该组中仅2名患者(22％)回到正常温度(图2)。

头痛：两个组中的所有患者在研究开始时报告了头痛(表4)。经过24小时的处理，HSRx 351组表现出头痛症状的显著减轻。平均VAS分数从4.47±2.14降低至1.53±1.41(p＜0.0001)(图1)。经过48小时，HSRx 351组的平均VAS分数接近零(0.28±0.63)(图1)，且该组中78％的患者不头痛(图2)而剩余22％仅报告轻度头痛(VAS＝1)。相反地，安慰剂组中头痛变得更严重，其中在48小时处理期内平均VAS分数从3.78±1.66增加至5.25±1.34(p＜0.0001)(图1)。安慰剂组中没有任何单个个体对象报告头痛的改善。

肌肉痛：两个组中超过90％的患者报告了肌肉痛(表4)。在24小时内HSRx 351组的平均VAS分数从2.87±2.13降低至1.19±1.05(p＝0.0002)(图1)，这表明症状的显著改善。经过48小时，87％的患者已经完全从肌肉痛恢复(图2)，平均VAS分数达到0.16±0.45(图1)。安慰剂组中报告了肌肉痛的恶化，因为在48小时平均VAS分数从2.13±2.10增加至3.47±1.50(p＝0.0013)(图1)。

鼻塞：HSRx 351组中所有患者和安慰剂组中87.5％的患者在加入研究时报告了鼻塞(表4)。经过24小时处理，HSRx 351组表现出症状的显著改善。该组的平均VAS分数从4.03±2.10降低至1.47±1.14(p＜0.0001)(图1)。经过48小时，平均VAS分数降低至0.56±0.62(图1)，且50％的患者没有症状(图2)。相反地，安慰剂组中在48小时时大多数个体中的鼻塞恶化。该组的平均VAS分数从3.30±1.71增加至4.26±1.81(p＝0.049)(图1)。安慰剂组30名患者中仅2名(7％)表现出鼻塞的缓解。

鼻黏液排出：鼻黏液排出在两个研究组的患者中是较不常见和不太严重的症状。HSRx 351组中仅50％的患者和安慰剂组中34.3％的患者报告了鼻黏液排出(表4)。尽管HSRx 351组中的患者在24小时处理期间表现出一些改善(图1)，但是该改善不显著(p＝0.26)。经过48小时的处理，HSRx 351组表现出显著的症状改善，平均VAS分数从1.94±1.61降低至0.50±0.52(p＝0.0019)(图1)，16名患者中的8名(50％)报告无症状，其余50％仅报告轻度症状(VAS＝1)。在安慰剂组中，16名中仅1名(6％)报告了症状改善，而其余15名患者没有表现出症状改善。

咳嗽：两个组中百分之五十的患者在加入研究时报告了咳嗽(表4)。在HSRx 351组，咳嗽比其他症状的持续时间更长。在24小时处理期内该组没有记录显著的改善(图1)。经过48小时，16名患者中的5名(31％)的咳嗽得到缓解，6名患者(37％)表现出症状改善(VAS＝1)。尽管平均VAS分数从2.07±2.19降低至1.00±0.926(图1)，该降低在统计学上不显著(p＝0.093)。然而，组间比较(表5C)显示在HSRx 351组中咳嗽也得到显著改善(p＜0.0001)。在安慰剂组中，16名中的14名(87％)患者表现出恶化的症状，其余2名患者(13％)表现出轻微的症状改善。安慰剂组中的平均VAS分数从2.19±1.47增加至3.69±1.25(p＝0.0041)(图1)。

不良作用：两组中都没有报告与处理有关的不良反应。

结果：结果表明HSRx 351可以快速缓解流感样症状。HSRx 351组在处理开始的24小时内表现出症状的显著改善，而安慰剂组没有表现出症状改善。在24小时内，在HSRx 351处理组中全身症状(发热、头痛和肌肉痛)和鼻部症状(鼻塞)全都显著减轻。咳嗽和鼻黏液排出在24小时没有表现出显著改善，但是在处理的48小时内确实表现出改善。在处理的48小时，近90％经HSRx 351处理的患者不具有症状或者仅具有轻度症状(VAS＝1)。之前，证明了接骨木糖浆使流感症状的持续时间减少3天至4天(Zakay‐Rones等人1995；Zakay‐Rones等人2004)。相比之下，神经氨酸酶抑制剂药物奥司他韦和扎那米韦处理报告了仅2天至2.5天的减少(Monto等人1999；Makela等人2000；Nicholson等人2000)。这些结果出人意料地表明HSRx 351与当前使用的抗病毒药物或接骨木糖浆相比在改善症状和缩短流感持续时间方面具有相似或者甚至更好的效力。

在此处的临床研究中，HSRx 351表现为安全的，因为没有接受HSRx 351的患者报告过任何不良事件，包括在抗病毒治疗中常见的两种不良事件恶心和呕吐(Nicholson等人，2000)。

表5：在处理的开始(A)、24小时(B)和48小时(C)时HSRx 351处理组和安慰剂处理组的VAS分数的比较(由Kong 2009适应性修改)。

A.

B.

C.

分数0表示无问题，分数10表示显著的问题。

实施例6

(与组合的对流感感染和/或流感样症状的治疗)

纳入了具有流感症状而在其他方面健康的对象来评价当与组合时HSRx 351对改善流感或流感样疾病的迹象和症状的作用。该研究是随机单盲安慰剂对照的比较性治疗临床研究和评估。

方法：将满足所有纳入/排除标准且表现出符合流感或流感样疾病的症状的58名对象纳入在处理组D或C中。排除标准包括小于16岁和超过70岁的对象、或怀孕的、哺乳的、患有慢性疾病的、被怀疑具有细菌感染的、参与其他临床试验、或最近接受流感药物、抗病毒治疗或流感疫苗的个体。

对象被随机安排并接受5天的处理方案。组C包含29名对象，其接受胶囊形式的75mg(奥司他韦磷酸盐)一天两次，持续5天。组D包含29名对象，其接受胶囊形式的75mg(奥司他韦磷酸盐)和HSRx351的两个175mg锭剂一天两次，持续5天。在筛选访视后，对象在第3天、第5天和第10天回来访视。

基于研究者评估的症状和整体健康状况来评价治疗的效力。评估的症状是：1)痛和疼；2)咳嗽程度；3)咳嗽频率；4)睡眠质量；5)呼吸道中的黏液排出；6)鼻塞和7)退热。在基线访视时评估症状以确定两个组在研究开始时是否是临床上可比较的。在基线访视时和之后在5天处理期间每天4次和处理完成后一天两次持续5天，对象以视觉模拟评分(VAS)给他们的症状从0＝没有问题至10＝显著问题打分。还指示对象记录任何不良事件。在回访时，研究人员使用相同的评分标准来标注他们对对象的评估。

统计分析/结果——进行生存分析来比较组C和组D的流感症状随时间的函数。生存和风险函数对于时间依赖的事件而计算，其是对每个对象访视收集的最终数据。运行广义线性混合模型来检验组合处理组D相对于仅(奥司他韦磷酸盐)处理组C的较少不良事件的假设。例如β重量和R2的参数估计是与设置为5％的P值显著水平一起评价的。

结果：除了两个组都没有表现出显著差异(均在误差幅度内)的咳嗽程度之外，对其他所有参数，HSRx 351的另外使用增加了对象从流感和流感样疾病恢复的速率。参见表6B。组合处理还减少了流感和流感样疾病的症状并且减小来自使用的不良副作用。参见表6A和表6B。

表6A：与组合的对流感感染和/或流感样症状的治疗的临床研究的初步结果

表6B：与组合的流感感染和/或流感样症状的治疗的临床研究的主要统计结果

实施例7

(流感感染的预防)

对HSRx 351、生物标志物6、和生物标志物7的类似物，3-羟基二氢黄酮(“生物标志物7类似物”)进行测试以确定组合物在体外和体内对流感病毒感染的预防特性。确定了HSRx 351预防培养的Madin-Darby狗肾上皮(MDCK)细胞的H1N1、H3N2和H5N1感染，并且防止病毒与红细胞结合。

血细胞凝集抑制分析中的预防——血细胞凝集是涉及红细胞与血凝素结合的凝集的形式，其发现于一些病毒例如流感病毒。在高浓度的病毒下，红细胞结合病毒的血凝素蛋白并保持悬浮在溶液中。在较低浓度的病毒下，红细胞相反地可以沉淀在溶液底部。本文中已经确定HSRx 351防止红细胞与流感病毒的血凝素蛋白结合(图4)。

方法:用磷酸盐缓冲盐水准备孔。除了仅含有在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的红细胞且不含病毒的阴性对照行(首行)外，所有行的孔中制备甲型流感病毒(A/PR/8/34)(ATCC)的系列稀释液，其中稀释从左至右增加(病毒浓度从左至右降低)。将恒定浓度的抑制血凝素(pAB)的抗体添加至也含有病毒的阳性对照行(从顶端开始的第三行)。以恒定浓度将HSRx 351(HS9)添加至三个测试行(底部三行)以一式三份地测试HSRx 351抑制血细胞凝集的能力。通过以与其他行中的孔相同的浓度将病毒稀释在PBS中，但不添加pAB或HSRx 351来产生阴性+病毒对照行(从顶端开始的第二行)。添加恒定浓度的红细胞(RBC)至所有孔。通过目视检查每个孔来确定血细胞凝集的水平。其中红细胞沉淀在底部形成浓缩的红点的孔指示少量至没有血细胞凝集和少量至没有病毒结合至红细胞。其中红细胞不沉淀以形成浓缩的红点而是分散在溶液中的孔指示血细胞凝集和病毒结合至红细胞。可以通过比较测试孔(底部三行)和含有相同病毒稀释液的阴性+病毒对照孔(从顶端开始的第二行)中红细胞分散的量来确定血细胞凝集的抑制。

结果：阴性对照行(首行，RBC+PBS)示出在单独的PBS中红细胞不能够血细胞凝集。阴性+病毒对照行(从顶端开始的第二行，病毒+PBS+RBC)示出病毒能够引起红细胞的血细胞凝集(参见在左边两个孔中扩散的红色)，但是该能力依赖于病毒浓度，因为降低的病毒浓度使血细胞凝集的量降低(参见在中间的孔的较少扩散和在右边两个孔的少量扩散至没有扩散)。阳性对照行(从顶端开始的第三行，pAb+病毒+RBC)示出当与阴性+病毒对照行相比时，在一定病毒浓度下恒定浓度的pAB抑制血细胞凝集，参见从左边开始的第二和第三个孔。含有HSRx 351的三个测试行(底部三行，HS9+病毒+RBC)示出恒定浓度的HSRx 351(HS9)与pAB相似地抑制血细胞凝集，参见从左边开始的第二和第三个孔。因此，HSRx 351已经表现出减少血细胞凝集并表明HSRx 351的组分可以结合甲型流感病毒的血球凝集素并防止病毒与红细胞的结合。

细胞培养研究中的预防—使用病毒斑点减少感染分析(viral focus reductioninfection assay)来确定病毒感染的预防。方法按照Roschek Jr 2009中描述的那些。简单地说，将HSRx 351、生物标志物6类似物、生物标志物7类似物或阳性对照：奥司他韦或金刚烷胺溶解在EtOH中，然后稀释在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中。用HSRx 351、生物标志物6类似物、生物标志物7类似物或对照稀释液将病毒株的斑点形成单位(FFU)：H1N1病毒株A/PR/8/34(ATCC，马纳萨斯，VA；ATCC No.VR-1469)、H3N2(ATCC)或H5N1(ATCC)在室温下孵育1小时。然后允许FFU在室温下感染融合MDCK细胞1小时。然后将细胞用新鲜甲醛固定并用EtOH透化。使用羊甲型流感病毒IgG多克隆抗体(H&L)和兔抗羊辣根过氧化物酶缀合的亲和性纯化的抗体(Chemicon，特曼库拉，CA)和AEC显色底物(Dako，卡平特里亚，CA)使FFU可视化。

结果：用HSRx 351、生物标志物6类似物或生物标志物7类似物预孵育的病毒相对于没有预先暴露于测试化合物/组合物的病毒减少与MDCK细胞结合的FFU和/或MDCK细胞中发现的FFU。病毒的体外HSRx 351IC₅₀值经确定为如表7中所示。此外，在1000μg/ml下实现H1N1感染的100％抑制(图3)。此外，基于生物标志物在HSRx 351中的浓度，发现HSRx 351的全部活性不包括生物标志物6类似物和生物标志物7类似物的活性。实际上，HSRx 351组合物具有分别超过组合物中生物标志物6或生物标志物7的浓度所预期的活性18倍和500倍的更高活性(图5和图6)。这表明HSRx 351的生物标志物之间可能存在协同作用.

表7：HSRx 351、生物标志物6类似物和生物标志物7类似物针对几种流感病毒的活性(由Roschek Jr 2009部分适应性修改)。

实施例8

(与组合的流感感染的预防)

在人类患者中的预防—对于人类研究，评价与组合的HSRx 351预防流感和/流感样症状的能力。纳入了健康对象来评价当与组合时HSRx 351对预防流感的作用。该研究是随机、单盲、安慰剂对照的比较性治疗临床研究和评估。研究表明该组合预防流感和/流感样症状。

方法：简单地说，将HSRx 351组合物配制成含有总计175mg的生物标志物1至生物标志物9的缓慢溶解的锭剂以与75mg组合地施用。进行具有(开放性试验)的随机、单盲、比较性治疗临床研究和评估以评价所测试组合物用于预防流感和/或流感样症状的效力。

将满足所有纳入/排除标准、在研究开始时通过甲型+乙型流感快速筛检试剂盒(Quidell Corporation,SAN DIEGO,CA)经两次测试甲型或乙型流感为阴性的以及没有显示流感的任何其他症状的健康个体纳入到预防组C或D中。排除标准包括小于16岁和超过70岁的对象、或怀孕的、哺乳的、患有慢性疾病的、被怀疑具有细菌感染的、参与其他临床试验、或最近接受流感药物、抗病毒治疗或流感疫苗的个体。

对象被随机安排并接受10天的预防方案。组C包含仅接受(奥司他韦磷酸盐)的30名对象。组D包含接受(奥司他韦磷酸盐)和HSRx 351的30名对象。在两个组中的对象都被要求每天服用含有75mg(奥司他韦磷酸盐)的1个胶囊，组D中的对象被要求在服用(奥司他韦磷酸盐)之后还立即服用每个含有175mgHSRx 351的两个锭剂。遵从处理方案10天。在研究者决定将患者纳入到研究中之后立即施用第一剂药物。在筛选访视后，对象在第3天、第5天和第10天回来访视和评价。

评价：基于研究者评估的症状和整体健康状况来评价处理的效力。评估的症状是：1)痛和疼；2)咳嗽程度；3)咳嗽频率；4)睡眠质量；5)呼吸道中的黏液排出；6)鼻塞和7)退热。在基线访视时评估症状以确定两个组在研究开始时是否是临床上可比较的。对象在基线访视时和之后一天四次持续10天地对他们的症状从0至10打分，0为没有症状，10为显著的问题。对象还记录任何不良事件。在回访时，研究人员使用相同的评分标准来标注他们对对象的评估。另外，使用贝迪医疗柔性植绒鼻拭子(Becton Dickinson Flexible FlockedNasal Swab)来擦拭对象鼻部和使用实时聚合酶链反应(PCR)过程在第一次、第二次、第三次和第四次访视(分别为第1天、第3天、第5天和第10天)确定流感病毒感染的存在和量(如果有的话)。

统计分析—组D中没有对象感染流感病毒，因此不能进行统计比较研究。

结果：在CDC分类为中等严重的流行病年(2014-2015)进行研究。流感样疾病连续14周升高超过国家基线2％，峰值为6％。在研究开始时患者一式两份地获取和分析的快速筛检鼻拭子都为阴性。在第1天、第3天、第5天和第10天从患者获取的鼻拭子的PCR分析证实两个组中的患者都没有在研究过程期间感染流感。

在研究过程期间，在组C(单独的)中报告了5例医学相关的不良事件，而在组D(和HSRx 351)中仅报告了1例医学相关的不良事件。

结果表明与组合的HSRx 351可以预防流感和流感样感染。在研究期间，在与组合的HSRx 351组中没有对象感染流感。此外，HSRx 351表现出减小单独服用发生的不良事件的数量。

实施例9

(协同作用)

如前所述，本文的实验结果表明了本文公开的生物标志物之间的协同作用(图5和图6)。此外，由于本文公开的生物标志物的预测的作用方法，认为生物标志物会与通过单独的机制起作用的其他抗病毒化合物协同地起作用。为了确认这种协同作用和确定与其他化合物/组合物的协同作用，本文公开的一种或多于一种生物标志物可以与本文公开的一种或多于一种其他生物标志物和/或一种或多于一种抗流感药物组合地进行测试。组合研究可以示出在细胞培养、动物研究、人类研究等中的组合的对流感病毒感染的治疗和/或预防、细胞活力、细胞毒性、副作用等的竞争的、添加的或协同的相互作用。研究的非限制性实例可以包括以上和本文中描述的那些和本领域技术人员已知的那些。作为非限制性实例，可以测试HSRx 351和奥司他韦的组合。

组合分析可以进行以确定组合的竞争的、添加的或协同的相互作用，组合分析非限制性实例可以利用通常用来观察药物相互作用和协同作用的相互作用基质。在一个实例中，在细胞培养中、在流感病毒感染的预防研究中使用相互作用基质。简单地说，实验可以具有25个样品：4个仅用第一测试化合物/组合物(例如HSRx 351)，4个仅用第二测试化合物/组合物(例如奥司他韦)，1个不用化学成分，其余16个可以是第一和第二测试化合物/组合物的组合。可以对第一测试化合物/组合物对于起始浓度的1:4稀释液(例如对于HSRx351的1mg/ml)和第二测试化合物/组合物对于起始浓度的1:4稀释液(例如对于奥司他韦的1.0μg/ml)进行测试。在抑制性化合物的持续存在下，可以进行流感病毒的感染和培养。以这种方式，实验模拟在预防性处理时感染的患者并测试在一系列浓度范围下单独的第一测试化合物/组合物、单独的第二测试化合物/组合物和两者的组合对感染的预防。可以利用Berenbaum的方法学分析数据以确定竞争的、添加的或协同的相互作用(Berenbaum 1977)。

实施例10

(流感的直接结合分析)

如上示出的，HSRx 351已经表现出抑制使用流感病毒的仅由病毒血球凝集素蛋白介导的血细胞凝集(图4)，并且表明组合物与流感血球凝集素的结合。此外，使用RoscheckJr 2009中描述的方法评价HSRx 351中测试生物标志物与流感病毒和血球凝集素的直接结合。表明生物标志物3、生物标志物6、生物标志物7类似物和生物标志物9结合H1N1病毒颗粒，预测生物标志物6和生物标志物7结合血球凝集素。所使用的方法学在Roschek Jr 2009中描述。

病毒颗粒—简单地说，用HSRx 351或合成的生物标志物6或生物标志物7类似物孵育H1N1病毒颗粒，以允许HSRx 351内化合物的结合。在孵育后，通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)并使其穿过100kDa分子量截止膜过滤器(Amicon 100kDa过滤器,Ultracel PL-100；Millipore Corp.比勒利卡,MA)清洗病毒颗粒三次来去除未结合的化合物。然后收集病毒颗粒并固定在100％EtOH中。收集经固定的病毒颗粒和含有未结合化学物质的清洗部分并通过DART TOF-MS直接分析以比较。

结果：通过DART TOF-MS确定了生物标志物3、生物标志物6、生物标志物7和生物标志物9在经固定病毒样品中相对于清洗部分显著地富集(关于生物标志物6和生物标志物7参见Roschek Jr 2009)。

血球凝集素—简单地说，对于使用分子力学两层理论的生物标志物6和生物标志物7的自由能最小化，采用使用Chem 3D Ultra(剑桥软件,剑桥,MA)分子建模方案的三维自由能最小化。

结果：最小自由能建模分析揭示了生物标志物6和生物标志物7的A环和B环形成轴，其中酚环间距离分别为和该距离在流感病毒的血球凝集素(HA)结合域口袋的尺寸限制(至)内，结合域口袋负责宿主细胞受体结合和病毒进入。生物标志物6的酚区域最有可能结合至富含病毒甘露醇的HA结合域。

实施例11

(Zika病毒的抑制)

测试HSRx 351以确定体外对Zika病毒感染的预防特性。确定了HSRx 351在小于100μg/ml和约80μg/ml的IC₅₀下预防培养中的非洲绿猴成纤维细胞样肾细胞(Vero E6细胞)的Zika感染。

细胞培养研究中的Zika预防—使用病毒空斑减少中和测试(PRNT)来确定病毒感染的预防。简单地说，将HSRx 351溶解在200μl DMSO中，然后稀释在pH 7.2的Dulbecco改良的Eagle培养基中(DMEM)。用HSRx 351或对照稀释液在室温下孵育Zika病毒株的空斑形成单位(PFU)1小时。然后允许PFU在室温下感染融合Vero细胞1小时。通过用中性红染色使空斑可视化。

结果：用HSRx 351预孵育的病毒相对于没有预先暴露于测试组合物的病毒减少与Vero E6细胞结合的空斑形成单位(PFU)和/或Vero E6细胞中发现的空斑形成单位(PFU)。参见图7。Zika病毒的体外HSRx 351IC₅₀值经确定为约80μg/ml。此外，在250μg/ml下实现Zika感染的100％抑制。

实施例12

(其他包膜病毒的抑制)

对HSRx 351进行测试以确定对包膜病毒HIV(多种亚型)、单纯疱疹病毒1(HSV-1)和登革病毒(DEN-2)的体外病毒感染预防特性。确定了HSRx 351在IC₅₀下对于表8中所示的病毒的每一种都预防培养的细胞的感染。这些结果，结合其他包膜病毒的另外的结合、治疗、预防和抑制结果，出人意料地表明本文公开的组合物是针对包膜病毒的广谱抗病毒组合物。

细胞培养中的感染预防研究—使用病毒斑点减少感染分析(viral focusreduction infection assay)来确定对病毒感染的预防。简单地说，将HSRx 351溶解在100％DMSO中，然后稀释在Dulbecco改良的Eagle培养基中(DMEM)。用HSRx 351或对照稀释液在室温下培养测试病毒株的空斑形成单位(PFU)或斑点形成单位(FFU)1小时。然后允许PFU/FFU在室温下将以下细胞感染1小时：HIV感染融合GHOST细胞(实验条件参见Fink等人2009)，HSV-1感染Vero细胞或登革病毒感染LLCMK2细胞。然后将细胞用新鲜甲醛固定并用EtOH透化。使用针对登革病毒的羊IgG多克隆抗体(H&L)和兔抗羊辣根过氧化物酶缀合的亲和性纯化的抗体(Chemicon,特曼库拉,CA)和AEC显色底物(Dako,卡平特里亚,CA)使登革感染细胞中的FFU可视化。使用光学显微镜来确定HSV-1的感染率。使用荧光显微镜来确定HIV的感染率。

结果：用HSRx 351预孵育的病毒相对于没有预先暴露于测试组合物的病毒减少与细胞结合的FFU和PFU和/或细胞中发现的FFU和PFU。HIV-1亚型B1、B2、C1和C2的体外HSRx351IC₅₀值经确定为201μg/ml至36μg/ml。HSV-1的体外HSRx 351IC₅₀值为40μg/ml，对于DEN-2，体外HSRx 351IC₅₀值为63μg/ml。

表8:针对几种包膜病毒的HSRx 351的活性。

实施例13

(登革病毒的直接结合分析)

如上示出的，HSRx 351已经表现出抑制登革病毒并且表明组合物与登革病毒的结合。此外，评价了HSRx 351与登革病毒的直接结合。表明了HSRx 351中的几种化合物在体外结合登革病毒。

病毒颗粒—简单地说，用HSRx 351孵育登革病毒颗粒(DEN-2)，以允许HSRx 351内化合物的结合。在培养后，通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)并使其穿过100kDa分子量截止膜过滤器(Amicon 100kDa过滤器,Ultracel PL-100；Millipore Corp.比勒利卡,MA)清洗病毒颗粒三次来去除未结合的化合物。然后收集病毒颗粒并固定在100％EtOH中。收集经固定的病毒颗粒和含有未结合化学物质的清洗部分并通过DART TOF-MS直接分析以比较。

结果：通过DART TOF-MS确定了生物标志物3、生物标志物6、生物标志物7和生物标志物9在经固定病毒样品中相对于清洗部分显著地富集。

实施例14

(人类鼻病毒的抑制)

对HSRx 351进行测试以确定对于人类鼻病毒(HRV)的体外病毒感染抑制特性，人类鼻病毒是通常感染人类并且与普通感冒相关的非包膜病毒。确定了HSRx 351以90μg/ml的IC₅₀预防培养的海拉(HeLa)细胞的HRV-16感染。这些结果，以及流感和流感样疾病治疗和预防、关于流感病毒的抑制和结合研究出人意料地表明本文公开的组合物可以用于治疗和预防流感和流感样疾病。

细胞培养研究中的人类鼻病毒预防—使用病毒斑点减少感染分析来确定病毒感染的预防。简单地说，将HSRx 351溶解在100％DMSO中，然后稀释在pH 7.2的Dulbecco改良的Eagle培养基/F12中(DMEM/F12)中。用HSRx 351或对照稀释液在室温下孵育HRV-16病毒株的空斑形成单位(PFU)1小时。然后允许PFU在室温下感染80％融合的海拉细胞1小时。然后将细胞用新鲜甲醛固定并用EtOH透化。使用羊HRV病毒IgG多克隆抗体(H&L)和兔抗羊辣根过氧化物酶缀合的亲和性纯化的抗体(Chemicon,特曼库拉,CA)和AEC显色底物(Dako,卡平特里亚,CA)使PFU可视化。

结果：用HSRx 351预孵育的病毒相对于没有预先暴露于测试化合物/组合物的病毒减少与海拉细胞结合的PFU和/或海拉细胞中发现的PFU。对于人类鼻病毒的体外HSRx351IC₅₀值经确定为90μg/ml。

**************

鉴于本公开，本文中所公开和要求保护的所有组合物和/或方法不需要过度实验即可制成和实现。尽管本发明的组合物和方法已经按照优选实施方案进行了描述，但是在不脱离本发明的构思、精神和范围的情况下，可以对本文描述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序所做的改变对于本领域技术人员是明显的。更具体地，明显的是化学和生理两方面都相关的一些试剂可以替代本文所描述的试剂，同时会得到相同或相似的结果。所有对本领域技术人员明显的所有这些相似的替代和改变都被视为在如由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和构思内。

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US 2009/0149530

Claims

1.一种组合物，其包含以下生物标志物的任一种、或任意组合：

(a)精确质量为112.027amu和相对丰度为至少2.36％的生物标志物1；

(b)精确质量为126.032amu和相对丰度为至少33.26％的生物标志物2；

(c)精确质量为155.095amu和相对丰度为至少1.86％的生物标志物3；

(d)精确质量为160.087amu和相对丰度为至少5.03％的生物标志物4；

(e)精确质量为166.099amu和相对丰度为至少9.26％的生物标志物5；或

(f)精确质量为507.342amu和相对丰度为至少0.60％的生物标志物8，

其中各个生物标志物是在西洋接骨木中发现的，

且其中所述相对丰度是与1mg/ml的所述组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。

2.根据权利要求1所述的组合物，其具有生物标志物1至生物标志物5和生物标志物8中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或全部。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含以下另外的生物标志物的任一种、或任意组合或全部：

(g)精确质量为358.146amu的生物标志物6；

(h)精确质量为478.295amu的生物标志物7；

(i)精确质量为606.436amu的生物标志物9，

其中各个生物标志物是在西洋接骨木中发现的。

4.根据权利要求3所述的组合物，其还包含：

(j)相对丰度为至少11.37％的生物标志物6；

(k)相对丰度为至少1.20％的生物标志物7；和

(l)相对丰度为至少0.07％的生物标志物9，

其中所述相对丰度是与1mg/ml的所述组合物中掺入的0.01mg/ml姜黄素相比的相对丰度。

5.根据权利要求1所述的组合物，其还包含：

(a)相对丰度为2.36％至6.94％的生物标志物1；

(b)相对丰度为33.26％至85.75％的生物标志物2；

(c)相对丰度为1.86％至4.69％的生物标志物3；

(d)相对丰度为5.03％至12.89％的生物标志物4；

(e)相对丰度为9.26％至24.11％的生物标志物5；

(f)相对丰度为0.60％至1.75％的生物标志物8，

6.根据权利要求4所述的组合物，其还包含：

(j)相对丰度为11.37％至31.81％的生物标志物6；

(k)相对丰度为1.20％至3.40％的生物标志物7；和

(l)相对丰度为0.07％至1.38％的生物标志物9，

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中各个生物标志物的质量是通过实时直接分析-TOF(DART-TOF)质谱仪确定的质量。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中生物标志物1至生物标志物9中的至少一种是合成得到的。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中生物标志物1至生物标志物9中的至少一种是从生物体中得到的。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中生物标志物1至生物标志物9中的至少一种是从西洋接骨木果实得到的。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有至少90％、优选至少95％、或至少98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含抗病毒药物。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述组合物还包含抗流感药物。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述抗流感药物是奥司他韦、扎那米韦、金刚烷乙胺、金刚烷胺、帕拉米韦、或其盐或其任意组合。

15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述抗流感药物是奥司他韦、其盐或其任意组合。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制为用于口服施用。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物是锭剂、散剂、片剂、明胶胶囊、缓释胶囊、速释胶囊、凝胶剂、液体溶液和/或可溶解的膜中的一种或多于一种。

18.根据权利要求1至15中任一项所述的组合物，其中所述组合物配制为用于局部应用、静脉内施用和/或鼻内递送。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物具有针对流感病毒的低于500μg/ml的IC₅₀。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中生物标志物1至生物标志物5和生物标志物8中的至少一种能够与流感病毒结合并阻断流感病毒进入细胞。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中生物标志物1至生物标志物5和生物标志物8中的至少一种能够与所述流感病毒的血凝素结合。

22.一种治疗患有流感和/或流感样疾病的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述对象被治疗。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述对象具有发热、头痛、肌肉痛、咳嗽、黏液排出、或鼻塞、或其任意组合的症状。

24.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中所述对象患有流感且被甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述流感病毒是H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和/或乙型流感病毒。

26.根据权利要求22至23中任一项所述的方法，其中所述对象患有流感样疾病并且被鼻病毒感染。

27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。

28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中施用所述组合物至少一天一次，持续至少三天。

29.一种治疗被包膜病毒感染的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述对象被治疗。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述对象被HIV、单纯疱疹病毒、黄病毒属病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒感染。

31.根据权利要求29至30中任一项所述的方法，其中所述对象被黄病毒属病毒感染，且所述黄病毒属病毒是Zika病毒和/或登革病毒。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述对象被Zika病毒感染。

33.根据权利要求29至32中任一项所述的方法，其中所述对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。

34.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中施用所述组合物至少一天一次，持续至少三天。

35.一种在对象中预防流感和/或流感样疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中流感和/或流感样疾病被预防。

36.根据权利要求35所述的方法，其中由甲型流感病毒和/或乙型流感病毒引起的流感被预防。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述流感病毒是H1N1、H3N2、H3N5、H5N1和/或乙型流感病毒。

38.根据权利要求35所述的方法，其中预防由鼻病毒引起的流感样疾病。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的方法，其中所述对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。

40.根据权利要求35至39中任一项所述的方法，其中施用所述组合物至少一天一次，持续至少三天。

41.一种预防对象的包膜病毒感染的方法，所述方法包括向所述对象施用权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中包膜病毒感染被预防。

42.根据权利要求41所述的方法，其中被预防的所述包膜病毒感染是HIV、单纯疱疹病毒、黄病毒属病毒、甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的感染。

43.根据权利要求41至42中任一项所述的方法，其中黄病毒属病毒感染被预防，且所述黄病毒属病毒是Zika病毒和/或登革病毒。

44.根据权利要求43所述的方法，其中Zika病毒感染被预防。

45.根据权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述对象在24小时期间被施用总量为1mg至5000mg、优选10mg至1500mg、50mg至1000mg、或100mg至500mg的生物标志物。

46.根据权利要求41至45中任一项所述的方法，其中施用所述组合物至少一天一次，持续至少三天。

47.一种权利要求1至21中任一项所述的组合物的制备方法，其中所述制备方法制备具有至少90％、优选至少95％、或至少98％的生物标志物相对丰度的批次间化学一致性的组合物。