相關申請案之交叉參考 本申請案主張2015年8月31日提出申請之美國臨時申請案第62/212,339號之權益，其全部內容以引用的方式併入本文中。 發明者已驚奇地發現，接骨木中發現之若干種化合物之組合可預防及治療流行性感冒及流行性感冒樣疾病且預防及治療套膜病毒感染。發明者亦發現化合物之具體相對濃度增強組合化合物起到預防及治療病毒感染之能力的作用。另外，發明者發現使用本發明之化合物與額外藥物(例如，抗流行性感冒化合物)增強組合化合物預防及治療病毒感染之能力。不期望受限於理論，據信本文所揭示之化合物及組合物能夠阻斷病毒進入細胞中。流行性感冒病毒之非限制性實例包括A型流行性感冒病毒及B型流行性感冒病毒屬內之病毒。該等屬內之流行性感冒病毒之非限制性實例包括H1N1、H3N2、H3N5、H5N1及B型流行性感冒病毒。引起流行性感冒樣疾病之病毒的非限制性實例包括鼻病毒。套膜病毒之非限制性實例包括茲卡病毒、登革熱病毒、HIV及單純疱疹病毒。亦相信，本文所揭示之化合物及組合物能夠治療及預防與流行性感冒感染相關之症狀及/或流行性感冒樣症狀。症狀之非限制性實例包括寒顫、咳嗽、疲勞、發熱、頭痛、肌肉疼痛及/或喉嚨痛。
A. 組合物之化合物
本發明組合物可包括一或多種在西洋接骨木(接骨木)中發現且由112.027 amu、126.032 amu、155.095 amu、160.087 amu、166.099 amu及507.342 amu之精確質量定義之生物標誌物及其組合。在另一實施例中，組合物可進一步包含一或多種由約358.146 amu、478.295 amu及606.436 amu之精確質量定義且在接骨木中發現之生物標誌物及其任一組合。不期望受限於理論，據信本發明之生物標誌物阻斷病毒進入細胞中。 在較佳實施例中，生物標誌物或生物標誌物之組合對於生物標誌物之相對豐度具有90%的批次間化學一致性。在另一較佳實施例中，化合物或化合物之組合對於生物標誌物之相對豐度具有95%及/或98%的批次間化學一致性。 在本發明之一些態樣中，組合物之化合物及衍生物及類似物可藉助已知合成方法製得。在本發明之一些態樣中，組合物之化合物及/或組合物可藉由根據熟悉化學合成技術者已知之方法產生該(等)化合物及/或該等組合物以合成方式獲得。在一個實例中，該(等)化合物及/或該等組合物係藉助有機化學方法合成。 在本發明之一些態樣中，組合物之化合物及/或組合物可自生物體(例如果實、植物、動物、真菌、細菌及/或古細菌)之提取物分離。果實之非限制性實例包括接骨木果實。組合物之化合物或組合物可使用已知提取方法自生物體提取，例如使提取物與CO
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接觸、使提取物與H
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O或EtOH:H
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O之任一組合接觸、利用聚合物分離提取物之任何方法。用於聚合物分離之聚合物的非限制性實例包括ADS 5聚合物(Nankai University, China)。提取物可包括在接骨木中所發現由112.027 amu、126.032 amu、155.095 amu、160.087 amu、166.099 amu及507.342 amu之精確質量定義之化合物中之任一者或組合。在一個實例中，提取物亦可包括在接骨木中所發現由約358.146 amu、478.295 amu及606.436 amu之精確質量定義之化合物中之一或多者及其任一組合。 在本發明之一些態樣中，組合物之化合物中之一或多者及其衍生物及類似物可藉助熟習此項技術者已知之已知合成方法來製得且組合物之化合物中之一或多者及其衍生物及類似物可自其他源(例如但不限於果實及植物之提取物)分離。
B. 由 DART TOF/MS 界定之活性劑
本發明組合物可包括一或多種在接骨木中所發現由約112.027 amu、126.032 amu、155.095 amu、160.087 amu、166.099 amu及507.342 amu之精確質量定義之化合物及其任一組合。本發明組合物可進一步包括：一或多種在接骨木中所發現約358.146 amu、478.295 amu及606.436 amu之精確質量定義之化合物生物及其任一組合；其他產物；及/或其任一組合。 本文所述之精確質量及相對豐度係基於使用特定儀器及特定設定之試驗且儀器與儀器之間可存在變化。在每一量測中均存在可變性。因此，精確質量及相對豐度係定義為接近如熟習此項技術者所理解者。在一個非限制性實施例中，術語定義為在20%內、較佳地10%、較佳地在5%內、更佳在1%內且最佳在0.5%內。在一個非限制性實施例中，精確質量之誤差在+/- 20 mmu內、較佳地10 mmu、更佳在5 mmu內且最佳在1 mmu內。在一個非限制性實施例中，相對豐度之誤差為+/- 20%、較佳地10%、較佳地在5%內、且更佳在1%內且最佳在0.5%內。 在非限制性實例中，本發明之化合物可使用即時直接分析(DART)飛行時間/質譜(TOF/MS)來鑑別。具體而言，可使用來自Jeol USA of Peabody, MA之JEOL DART™ AccuTOF-質譜儀(JMS-T100LC)。精確質量可藉由自試樣所產生離子之量測之量減去質子質量(1.007825 amu)來測定。化合物之質量可在試樣中藉助Dip-IT取樣器及Dip-IT取樣器固持器(ionSense™)將試樣直接引入至離子流來測定。儘管利用DART進行簡單分析不需要試樣準備，但可使用化學摻雜/摻加溶液用於相對於已知量進行定量。作為非限制性實例，薑黃素並不存在於接骨木提取物中且因此可用於產生生物活性分子之定量化學剖面。用於DART離子源之設定可係如下： 氣體：He 流速：2.52 LPM @ 50 PSI 溫度：250℃ 針電壓：3000 V 柵極電壓：250 V 放電電極電壓：400 V JEOL AccuTOF MS之設定可係如下： 峰值電壓：1000 V 孔口1溫度：120℃ 檢測器電壓：2600 V 反射器電壓：990.0 V 試樣可在六個複製品中藉由DART-TOF MS進行分析。該六個複製品可經分析以產生試樣之單一、經平均、經過濾且統計上顯著之DART指紋。此經處理之指紋然後可藉由比較質量用於測定生物活性標誌物之存在。由於該等生物活性標誌物之初始發現及鑑別，故簡單的質量比較足以確定其在任何提取物或化學品之混合物中之存在。 所有MS均具有質量公差，即圍繞所預測[M+H]或[M-H]值之可接受之報告質量範圍。對於AccuTOF而言，質量公差小於20毫質量單位(mmu) (預測質量 +/-10 mmu)。對於相同試樣及離子源，其他TOF-MS可具有較高或較低之質量公差。 在另一非限制性實例中，本發明化合物可藉由DART TOF/MS使用來自Jeol USA of Peabody, MA且以正離子模式([M+H]
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)執行之JEOL DART™ AccuTOF-質譜儀(JMS-T100LC)使用DART離子源之以下設定來測定： 氣體：He 流速：3.98 L/min 針電壓：3500 V 溫度：300℃ 電極1電壓：150 V 電極2電壓：250 V, JEOL AccuTOF MS之設定可係如下： 峰值電壓：1000 V 孔口1電壓：20 V 環形透鏡電壓：5 V 孔口2電壓：5 V 檢測器電壓：2550 V 校正可使用在整個100-1000 amu之所需質量範圍內提供質量標誌物之10% (重量/體積) PEG 600溶液(來自Ultra Chemical of North Kingston, RI)在內部利用每一試樣進行。校正公差可保持為5 mmu。試樣可使用硼矽酸鹽玻璃熔點毛細管之封閉端引入至DART He電漿中，直至在總離子層析(TIC)中達成信號為止。當TIC返回至基線含量時，可引入下一試樣。
C. 額外抗病毒藥物
抗病毒藥物可(但不限於)抑制病毒進入宿主細胞，防止病毒自宿主細胞出芽，防止在宿主細胞中複製，或破壞或抑制病毒粒子。抗病毒藥物包括特定針對一種或幾種病毒或廣譜針對若干類型之病毒之彼等。抗病毒藥物包括為組合藥物或單一藥物之彼等。抗流行性感冒藥物係抗病毒藥物之非限制性實例。在一個實施例中，本文所揭示之組合物進一步包括至少一種額外抗病毒藥物。 抗流行性感冒藥劑係用於降低流行性感冒病毒負荷或防止病毒感染之化合物或組合物。抗流行性感冒藥劑之非限制性實例包括奧司他韋(亦稱為TAMIFLU®)、紮那米韋(RELENZA®)、帕拉米韋(RAPIVAB®)、金剛乙胺(亦稱為FLUMADINE®)及金剛烷胺(亦稱為SYMMETREL®)。一些抗流行性感冒藥劑抑制神經胺糖酸苷酶，此阻止病毒後代自受感染細胞釋放。阻止病毒後代自受感染細胞釋放之抗流行性感冒藥劑之非限制性實例包括神經胺糖酸苷酶抑制劑，例如奧司他韋、紮那米韋及帕拉米韋。一些抗流行性感冒藥劑阻斷病毒編碼之M2離子通道。阻斷M2離子通道之抗流行性感冒藥劑的非限制性實例係金剛乙胺及金剛烷胺。流行性感冒病毒之非限制性實例包括A型流行性感冒病毒及B型流行性感冒病毒屬之病毒。在一個實例中，病毒包括(但不限於) H1N1、H3N2、H3N5、H5N1及B型流行性感冒病毒。在一個實施例中，本文所揭示之組合物進一步包括至少一種額外抗流行性感冒藥劑，其可為(但不限於)奧司他韋、紮那米韋、帕拉米韋、金剛乙胺及金剛烷胺。
D. 成份之量
預期本發明組合物可包括本說明書中所討論之任何量之成份。組合物亦可包括整個本說明書中所述之任何數量之額外成份之組合(例如，穩定劑、填充劑、醫藥上及/或營養品可接受之鹽及/或額外醫藥及/或營養品成份)。任何成份在組合物內之濃度均可有所變化。在非限制性實施例，舉例而言，組合物在其最終形式中可包含以下量之在整個說明書及申請專利範圍中所提及成份中之任一者、基本由其組成或由其組成：例如，至少約0.0001%、0.0002%、0.0003%、0.0004%、0.0005%、0.0006%、0.0007%、0.0008%、0.0009%、0.0010%、0.0011%、0.0012%、0.0013%、0.0014%、0.0015%、0.0016%、0.0017%、0.0018%、0.0019%、0.0020%、0.0021%、0.0022%、0.0023%、0.0024%、0.0025%、0.0026%、0.0027%、0.0028%、0.0029%、0.0030%、0.0031%、0.0032%、0.0033%、0.0034%、0.0035%、0.0036%、0.0037%、0.0038%、0.0039%、0.0040%、0.0041%、0.0042%、0.0043%、0.0044%、0.0045%、0.0046%、0.0047%、0.0048%、0.0049%、0.0050%、0.0051%、0.0052%、0.0053%、0.0054%、0.0055%、0.0056%、0.0057%、0.0058%、0.0059%、0.0060%、0.0061%、0.0062%、0.0063%、0.0064%、0.0065%、0.0066%、0.0067%、0.0068%、0.0069%、0.0070%、0.0071%、0.0072%、0.0073%、0.0074%、0.0075%、0.0076%、0.0077%、0.0078%、0.0079%、0.0080%、0.0081%、0.0082%、0.0083%、0.0084%、0.0085%、0.0086%、0.0087%、0.0088%、0.0089%、0.0090%、0.0091%、0.0092%、0.0093%、0.0094%、0.0095%、0.0096%、0.0097%、0.0098%、0.0099%、0.0100%、0.0200%、0.0250%、0.0275%、0.0300%、0.0325%、0.0350%、0.0375%、0.0400%、0.0425%、0.0450%、0.0475%、0.0500%、0.0525%、0.0550%、0.0575%、0.0600%、0.0625%、0.0650%、0.0675%、0.0700%、0.0725%、0.0750%、0.0775%、0.0800%、0.0825%、0.0850%、0.0875%、0.0900%、0.0925%、0.0950%、0.0975%、0.1000%、0.1250%、0.1500%、0.1750%、0.2000%、0.2250%、0.2500%、0.2750%、0.3000%、0.3250%、0.3500%、0.3750%、0.4000%、0.4250%、0.4500%、0.4750%、0.5000%、0.5250%、0.0550%、0.5750%、0.6000%、0.6250%、0.6500%、0.6750%、0.7000%、0.7250%、0.7500%、0.7750%、0.8000%、0.8250%、0.8500%、0.8750%、0.9000%、0.9250%、0.9500%、0.9750%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.1%、4.2%、4.3%、4.4%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%、5.0%、5.1%、5.2%、5.3%、5.4%、5.5%、5.6%、5.7%、5.8%、5.9%、6.0%、6.1%、6.2%、6.3%、6.4%、6.5%、6.6%、6.7%、6.8%、6.9%、7.0%、7.1%、7.2%、7.3%、7.4%、7.5%、7.6%、7.7%、7.8%、7.9%、8.0%、8.1%、8.2%、8.3%、8.4%、8.5%、8.6%、8.7%、8.8%、8.9%、9.0%、9.1%、9.2%、9.3%、9.4%、9.5%、9.6%、9.7%、9.8%、9.9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、或99%或其中可推導之任何範圍。在非限制性態樣中，百分比可藉由總組合物之重量或體積或相對豐度來計算。熟習此項技術者將理解，濃度可端視既定組合物中之成份的添加、取代及/或減去而變化。
E. 額外組份
本發明之化合物可調配成用於投與給人類或非人類動物患者之任何適宜組合物形式。 組合物可僅由所主張化合物組成或可包括該等化合物以及任何適宜之額外組份，例如一或多種醫藥上及/或營養品可接受之載劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑(例如，防腐劑、填充劑、崩解劑、潤濕劑、乳化劑、懸浮劑、甜味劑、矯味劑、芳香劑、抗細菌劑、抗真菌劑、潤滑劑及分配劑)，此取決於投與模式及劑型之性質。在可與調配物之其他成份相容且對患者無害之意義上，每一載劑必須係可接受的。
1. 賦形劑
本發明之組合物中所用之賦形劑可係固體、半固體、液體或其組合。較佳地，賦形劑係固體。本發明含有賦形劑之組合物可藉由任何已知技術來製備，包括例如將賦形劑與所主張化合物混合。本發明之醫藥組合物含有每一劑量單位期望量之所主張化合物，且若預期用於經口投與，可呈(例如)錠劑、囊片劑、丸劑、硬或軟膠囊、菱形錠劑、扁囊劑、可分配粉末、顆粒、懸浮液、酏劑、分散液之形式或適於該投與之適當地任何其他形式。若預期用於非經腸投與，則其可呈(例如)懸浮液或經皮貼劑之形式。若預期用於直腸投與，則其可呈(例如)栓劑之形式。目前較佳者係為離散劑量單位之經口劑型，每一者含有預定量之所主張化合物，例如錠劑或膠囊。
2. 載劑 / 稀釋劑
適宜載劑或稀釋劑說明性地個別地或以組合包括(但不限於)乳糖，包括無水乳糖及乳糖一水合物；澱粉，包括直接可壓縮澱粉及水解澱粉(例如，Celutab™及Emdex™)；甘露醇、山梨醇、木糖醇、右旋糖(例如，Cerelose™ 2000)及右旋糖一水合物、二鹼價磷酸鈣二水合物、基於蔗糖之稀釋劑、粉糖、單鹼價硫酸鈣一水合物、硫酸鈣二水合物、顆粒狀乳酸鈣三水合物、葡萄糖結合劑(dextrates)、肌醇、經水解之穀物固體、直鏈澱粉、纖維素(包括微晶纖維素、食品級源之α-及非晶形纖維素(例如，RexcelJ)、粉末狀纖維素、羥丙基纖維素(HPC)及羥丙基甲基纖維素(HPMC))、碳酸鈣、甘胺酸、黏土、膨潤土、嵌段共聚物、聚乙烯基吡咯啶酮及諸如此類。該等載劑或稀釋劑若存在，則總共佔組合物總重量之約5%至約99.999%、約10%至約85%及20%至約80%。所選擇之一種載劑、多種載劑、一種稀釋劑或多種稀釋劑較佳地展現適宜流動性質且在期望錠劑之情形中可壓縮性。
3. 崩解劑
本發明之組合物視情況可包括特定用於錠劑調配物之一或多種醫藥上及/或營養品可接受之崩解劑作為賦形劑。適宜崩解劑個別地或以組合包括(但不限於)澱粉(包括羥乙酸澱粉鈉及預糊化玉米澱粉)、黏土、纖維素(例如純化纖維素、微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素及羧甲基纖維素鈉、交聯羧甲基纖維素鈉)、藻酸鹽、交聚維酮及樹膠(例如，瓊脂、瓜爾膠、刺槐豆膠、刺梧桐膠、果膠及黃蓍膠。崩解劑可在組合物之製備期間、特定地粒化之前或在壓縮前之潤滑步驟期間之任何適宜步驟處加入。該等崩解劑若存在，則總共佔組合物總重量之約0.2%至約30%、較佳地約0.2%至約10%且更佳約0.2%至約5%。
4. 黏合劑
本發明之組合物可包括特定用於錠劑調配物之黏合劑或黏結劑。該等黏合劑及黏結劑較佳將足夠凝聚性賦予欲製錠之粉末以允許正常處理操作(例如上漿、潤滑、壓縮及包裝)，但仍允許錠劑崩解且在攝入時組合物被吸收。一旦鹽溶於溶液中，該等黏合劑亦可防止或抑制本發明之共晶體結晶或重結晶。適宜黏合劑及黏結劑個別地或以組合包括(但不限於)阿拉伯樹膠；黃蓍膠、蔗糖、明膠、葡萄糖、澱粉(例如但不限於預糊化澱粉)、纖維素(例如但不限於甲基纖維素及羧甲基纖維素鈉)、藻酸及藻酸鹽；矽酸鋁鎂、PEG、瓜爾膠、多醣酸、膨潤土、聚維酮(povidone)、聚甲基丙烯酸酯、HPMC、羥丙基纖維素及乙基纖維素。該等黏合劑及/或黏結劑若存在，則總共佔醫藥組合物總重量之約0.5%至約25%、較佳地約0.75%至約15%且更佳約1%至約10%。許多黏合劑係包含醯胺、酯、醚、醇或酮基團之聚合物且因此可包括在本發明之醫藥組合物中。聚乙烯基吡咯啶酮係用於緩慢釋放錠劑之黏合劑的非限制性實例。聚合黏合劑可具有聚合物之可變分子量、交聯度及等級。聚合黏合劑亦可係共聚物，例如含有環氧乙烷及環氧丙烷單元之混合物的嵌段共聚物。既定聚合物中該等單元比率之變化影響性質及性能。
5. 潤濕劑
潤濕劑可用於本發明之組合物中。潤濕劑可經選擇以維持晶體與水密切締合(一種可改良組合物之生物利用度之條件)。該等潤濕劑亦可用於使晶體增溶或增加晶體之溶解度。表面活性劑可用作潤濕劑。在本發明組合物中可用作潤濕劑之表面活性劑之非限制性實例包括四級銨化合物，例如苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)及氯化十六烷基吡啶鎓、二辛基磺基琥珀酸鈉、聚氧乙烯烷基苯基醚、泊洛沙姆(poloxamer) (聚氧乙烯及聚氧丙烯嵌段共聚物)、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯及油(例如聚氧乙烯(8)辛酸/癸酸甘油單酯及甘油二酯、聚氧乙烯(35)蓖麻油及聚氧乙烯(40)氫化蓖麻油)、聚氧乙烯烷基醚(例如聚氧乙烯(20)鯨蠟硬脂基醚)、聚氧乙烯脂肪酸酯(例如聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯去水山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20及聚山梨醇酯80)、丙二醇脂肪酸酯(例如丙二醇月桂酸酯、月桂基硫酸鈉)、脂肪酸及其鹽(例如，油酸、油酸鈉及三乙醇胺油酸酯)、脂肪酸甘油酯(例如單硬脂酸甘油酯)、去水山梨醇酯(例如去水山梨醇單月桂酸酯、去水山梨醇單油酸酯、去水山梨醇單棕櫚酸酯及去水山梨醇單硬脂酸酯)、泰洛沙泊(tyloxapol)及其混合物。該等潤濕劑若存在，則總共佔醫藥組合物總重量之約0.25%至約15%、較佳地約0.4%至約10%且更佳約0.5%至約5%。
6. 潤滑劑
潤滑劑可包括在本發明之組合物中。適宜潤滑劑個別地或以組合包括(但不限於)山崳酸甘油酯、硬脂酸及其鹽、包括硬脂酸鎂、硬脂酸鈣及硬脂酸鈉；氫化植物油、膠體二氧化矽、滑石、石蠟、硼酸、苯甲酸鈉、乙酸鈉、富馬酸鈉、氯化鈉、DL-白胺酸、PEG (例如，Dow Chemical Company之Carbowax™ 4000及Carbowax™ 6000)、油酸鈉、月桂基硫酸鈉及月桂基硫酸鎂。該等潤滑劑若存在，則總共佔組合物總重量之約0.1%至約10%、較佳地約0.2%至約8%且更佳約0.25%至約5%。
7. 其他藥劑
表面活性劑、乳化劑或泡騰劑可用於組合物中。乳化劑可用於幫助溶解軟明膠膠囊內之成份。表面活性劑、乳化劑或泡騰劑之非限制性實例包括D-山梨醇、乙醇、卡拉膠、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、瓜爾膠、甘油、甘油脂肪酸酯、膽固醇、白蜂蠟、二辛基磺基琥珀酸鈉、蔗糖脂肪酸酯、十八烷醇、硬脂酸、聚烴氧40硬脂酸酯、去水山梨醇倍半油酸酯、鯨蠟醇、明膠、去水山梨醇脂肪酸酯、滑石、去水山梨醇三油酸酯、石蠟、馬鈴薯澱粉、羥丙基纖維素、丙二醇、丙二醇脂肪酸酯、果膠、聚氧乙烯(105)聚氧丙烯(5)二醇、聚氧乙烯(160)聚氧丙烯(30)二醇、聚氧乙烯氫化蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油40、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚烴氧35蓖麻油、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80、聚乙二醇400、肉豆蔻酸辛基十二烷基酯、甲基纖維素、去水山梨醇單油酸酯、甘油單硬脂酸酯、去水山梨醇單棕櫚酸酯、去水山梨醇單月桂酸酯、月桂基二甲胺氧化物溶液、月桂基硫酸鈉、聚月桂乙二醇(lauromacrogol)、無水碳酸鈉、酒石酸、氫氧化鈉、經純化大豆卵磷脂、大豆卵磷脂、碳酸鉀、碳酸氫鈉、中鏈甘油三酯、檸檬酸酐、棉籽油-大豆油混合物及液體石蠟。
F. 媒劑
各種遞送系統已為業內已知且可用於遞送本發明之治療劑或組合物，例如囊封於脂質體中、微粒、微膠囊、受體介導之胞吞作用及諸如此類。投與方法包括(但不限於)非經腸、動脈內、肌內、靜脈內、鼻內及經口途徑。組合物可以錠劑、菱形錠劑、顆粒、膠囊、丸劑、安瓿、栓劑或氣溶膠形式之形式提供。組合物亦可以活性成份與水性或非水性稀釋劑中之懸浮液、溶液及乳液、糖漿、顆粒劑或粉末之形式提供。
G. 調配物及投與
組合物可係(例如)醫藥組合物(藥劑)及櫃台買賣組合物(over the counter, OTC)/營養品等。本發明之組合物包括適於經口或非經腸途徑之調配物。具體途徑之非限制性實例包括真皮內、皮下、肌內、靜脈內、局部注射、直腸、鼻內吸入、吹入、局部(包括經皮、經頰及舌下)、經陰道、非經腸(包括皮下、肌內、靜脈內及真皮內)及肺投與。調配物可便利地以單位劑型呈現且可藉由此項技術中熟知之任何方法來製備。該等方法包括使該活性成份(或該等成份)與組成一或多種輔助成份之載劑結合之步驟。一般而言，調配物係藉由使活性成份與適宜載劑(例如，液體載劑或精細固體載劑或二者)均勻且充分結合、且然後(若需要)使產物成形來製備。適於經口投與之本發明調配物可呈現為離散單元(例如膠囊、扁囊劑或錠劑，每一者含有預定量之活性成份)、或水包油液體乳液、油包水液體乳液或於水溶液內之補充劑(例如茶點)。活性成份亦可呈現為大丸劑、舐劑或糊劑。可用之可注射製劑包括化合物組合物於水性或油性媒劑中之無菌懸浮液、乳液或乳液。組合物亦可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑等調配劑。注射用調配物可以單位劑型(例如於安瓿或於多劑量容器中)呈現，且可含有添加之防腐劑。或者，可注射調配物可以粉末形式提供，以在使用之前利用適宜媒劑(包括但不限於無菌無熱原水、緩衝劑、右旋糖溶液等)重構。為此，化合物組合物可藉由任何已知技術(凍乾)乾燥，且在使用前重構。 適於口腔局部投與之調配物包括包含於矯味基質、通常蔗糖及阿拉伯樹膠或黃蓍膠中之活性成份之菱形錠劑、包括於惰性基質(例如，明膠及甘油、或蔗糖及阿拉伯樹膠)中之活性成份之軟錠劑、包括於適宜液體載劑中之活性成份之漱口劑及包含活性成份之巧克力(chocolate)。 根據本發明適於局部投與之調配物可調配成軟膏劑、霜劑、懸浮液、洗劑、粉末、溶液、糊劑、凝膠、噴霧劑、氣溶膠或油狀物。或者，調配物可包含貼劑或敷料，例如經活性成份及視情況一或多種賦形劑或稀釋劑浸漬之繃帶或絆創膏(adhesive plaster)。局部調配物較佳包含促使活性成份吸收穿過皮膚並進入血流之化合物。 適於鼻內投與之調配物(其中載劑係固體)包括粒徑(例如)在約20微米至約500微米範圍內之粗粉末，其係以鼻吸之方式投與，即藉由自保持緊靠鼻子之粉末容器穿過鼻道迅速吸入。其中載劑係(例如)藉由霧化器之非限制性實例用於鼻內投與之液體的適宜調配物包括藥劑之水性或油性溶液。調配物較佳可包括促使活性成份吸收穿過皮膚並進入血流之化合物。 適於非經腸投與之調配物包括水性及非水性等滲無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期受體之血液等滲之溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑及增稠劑、及脂質體或經設計以使化合物靶向血液組份或一或多個器官之其他微粒系統。該等調配物可以單位劑量或多劑量或多劑量密封容器(例如，安瓿及小瓶)呈現且可儲存於冷凍乾燥(凍乾)條件下，僅需在即將使用前添加無菌液體載劑(例如，注射用水)。即時注射溶液及懸浮液可自先前所述種類之無菌粉劑、顆粒及錠劑製備。 用於經口投與之液體製劑可採取(例如)酏劑、溶液、糖漿或懸浮液之形式，或其可呈現為乾燥產物以在使用前利用水或其他適宜媒劑構造。該等液體製劑可藉由習用方式用醫藥上及/或營養品可接受之添加劑來製備，例如懸浮劑(例如，山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯樹膠)；非水性媒劑(例如，杏仁油、油性酯、乙醇或經分餾植物油)；及防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。若適宜，製劑亦可含有緩衝鹽、防腐劑、矯味劑、著色劑及甜味劑。 對於經頰投與，組合物可採用以習用方式調配之錠劑或菱形錠劑之非限制性實例的形式。 對於直腸及陰道途徑投與，化合物組合物可調配成含有習用栓劑基質(例如可可脂或其他甘油酯)之溶液(用於保留灌腸)、栓劑或軟膏劑。 對於鼻投與或藉由吹入投與，化合物組合物可方便地以氣溶膠噴霧之形式自加壓包或噴霧器借助於適宜推進劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氟碳化合物、二氧化碳或其他適宜氣體)遞送。在加壓氣溶膠之情形中，劑量單位可藉由提供閥來確定以遞送計量量。用於吸入器或吹入器之膠囊及藥筒(例如由明膠構成之膠囊及藥筒)可經調配含有化合物與適宜粉末基質(例如，乳糖或澱粉)之粉末混合物。 對於長期遞送，化合物組合物可調配成初級製劑用於藉由植入或肌內注射來投與。化合物組合物可利用適宜聚合或疏水性材料(例如，作為可接受油中之乳液)或離子交換樹脂來調配，或調配為微溶性衍生物(例如，微溶性鹽)。或者，可使用製成黏結盤狀物或貼片之經皮遞送系統，其緩慢釋放化合物組合物用於經皮吸收。為此，可使用滲透增強劑以促進化合物組合物之經皮滲透。適宜經皮貼劑闡述於(例如)美國專利第5,407,713號；美國專利第5,352,456號；美國專利第5,332,213號；美國專利第5,336,168號；美國專利第5,290,561號；美國專利第5,254,346號；美國專利第5,164,189號；美國專利第5,163,899號；美國專利第5,088,977號；美國專利第5,087,240號；美國專利第5,008,110號；及美國專利第4,921,475號。 或者，可採用其他遞送系統。脂質體及乳液係可用於遞送化合物組合物之遞送媒劑之熟知實例。亦可採用某些有機溶劑，例如二甲亞碸(DMSO)，但通常以較大毒性為代價。 應瞭解，除以上所特定提及之成份以外，可用於本發明之調配物可包括此項技術中關於所討論調配物類型習用之其他試劑。舉例而言，適於經口投與之調配物可包括諸如甜味劑、增稠劑及矯味劑等其他試劑。亦期望本發明之試劑、組合物及方法與其他適宜組合物及療法相容。 在一個實施例中，本發明之醫藥及/或營養品組合物可局部投與至需要治療之區域；該等局部投與可藉由(例如)局部輸注、注射或藉助導管達成。在另一實施例中，本發明之化合物或組合物係以在患病位點達成活性化合物之峰值濃度之方式投與。患病位點處之峰值濃度可藉由(例如)靜脈內注射視情況於鹽水中之藥劑或經口投與(例如)含有活性成份之錠劑、膠囊或糖漿來達成。
H. 其他醫藥及 / 或營養品藥劑
本發明之醫藥、OTC及/或營養品調配物可與其他藥物或生物活性劑同時或依序投與。實例包括(但不限於)抗流行性感冒藥劑、抗氧化劑、自由基清除劑、止痛藥、麻醉劑、肛門直腸藥、抗組織胺藥、抗發炎劑(包括非類固醇消炎藥)、抗生素、抗真菌劑、抗病毒劑、抗菌劑、抗癌症活性劑、抗瘤劑、生物活性蛋白質及肽、酶、止血劑、類固醇(包括激素及皮質類固醇)等。
I. 治療方法及劑量
較佳單位劑量調配物係含有藥劑之日劑量或單位、每日分劑量或其適當分數之彼等。治療量可根據經驗確定且將隨所治療之病理、所治療之個體及藥劑之效能及毒性而變。類似地，適宜劑量調配物及投與藥劑之方法可由熟習此項技術者容易地確定。 在一些實施例中，本發明之治療方法可包括藉由向患有疾病或病況之個體以有效治療該疾病、病況或病症之量投與本文所述之穩定調配物來治療該疾病、病況或病症。在一些實施例中，向個體投與包含本文所主張化合物之穩定調配物。疾病、病況或病症可由流行性感冒病毒引起。此外，疾病、病況或病症可係流行性感冒(influenza, flu)及/或具有流行性感冒樣症狀之疾病及相關疾病、病況及病症。對於預防性投與，可將組合物投與給處於發展上述病況中之一者風險的患者。 所投與組合物之量將取決於各種因素，包括(例如)所治療之特定適應症、投與模式(無論期望益處係預防性還是治療性的)、所治療適應症之嚴重性及患者之年齡及體重等。有效劑量之確定在熟習此項技術者之能力之內。在本發明之一些態樣中，化合物組合物之總劑量量通常在約0.0001或0.001或0.01 mg/kg患者/天至約100 mg/kg患者/天之範圍內，但可更高或更低，此尤其取決於組份之活性、其生物利用度、投與模式及以上所討論之各種因素。可個別地調節劑量量及時間間隔以提供足以維持治療或預防效應之化合物的血漿含量。舉例而言，化合物可每週一次、每週若干次(例如，每隔一天)、每天一次或每天多次投與，此尤其取決於投與模式、所治療之具體適應症及處方醫師之判斷。在另一非限制性實例中，化合物可投與個體達1天、2天、3天、4天、5天、6天、一週或更長。熟習此項技術者將能夠無需過多試驗而最佳化有效局部劑量。
J. 套組
在本發明之另一態樣中，用於治療疾病、病況或病症之套組如本文所描述。例如，本發明之組合物可包括在套組中。A 套組可包括容器。容器可包括瓶子、金屬管、層壓管、塑膠管、分配器、吸管、加壓容器、阻隔容器、包裝、隔室或其他類型之容器，例如，分散液或組合物或期望的瓶子、分配器或包裝保留於其中之注射或吹塑模製之塑膠容器。套組及/或容器可包括其表面上之標記。標記可為(例如)單詞、語句、縮寫、圖片或符號。 容器可分配預定量之組合物。在其他實施例中，容器可經擠壓(例如，金屬管、層壓管或塑膠管)以分配期望量之組合物。組合物可作為噴霧劑、氣溶膠、液體、流體、半固體或固體分配。在較佳實施例中，組合物係作為錠劑或菱形錠劑分配。容器可具有噴霧、抽吸或擠壓機構。套組亦可包括關於使用套組組份以及容器中所包括之任何其他組合物之使用之說明書。說明書可包括如何施加、使用及維持組合物之解釋。若期望，組合物可呈現於可含有一或多個含有化合物組合物之單位劑型之包或分配器裝置中。包可(例如)包含金屬或塑膠箔，例如泡罩包。包或分配器裝置可伴有投與說明書。
實例
將以具體實例之方式更詳細地闡述本發明。提供以下實例用於說明性目的，而非意欲以任何方式限制本發明。熟習此項技術者將容易地識別各種非關鍵參數，可對該等參數進行改變或修改以獲得基本上相同之結果。 組合之結果令人驚訝地顯示，本文所揭示之組合物可用於治療及預防流行性感冒及流行性感冒樣疾病且可用於治療及預防套膜病毒感染。
實例 1 ( 藉由精確質量及相對豐度表徵化合物 )
發明者已驚奇地發現，接骨木中發現之若干種化合物之組合可預防及治療流行性感冒病毒感染。發明者亦發現，化合物之具體相對濃度用於增強組合化合物預防及治療流行性感冒病毒感染之能力。另外，發明者發現使用本發明之化合物與額外抗流行性感冒化合物亦增強組合化合物預防及治療流行性感冒病毒感染之能力。本發明之化合物包括生物標誌物化合物，其係由西洋接骨木中所發現具有112.027 amu、126.032 amu、155.095 amu、160.087 amu、166.099 amu及507.342 amu之精確質量之化合物所定義。該等化合物可以合成方式產生或自生物體(例如但不限於西洋接骨木)分離。組合物可進一步含有在西洋接骨木中所發現具有358.146 amu、478.295 amu及606.436 amu之精確質量之生物標誌物化合物。該等化合物可藉由熟習此項技術者已知之方法表徵。 本文所述之精確質量及相對豐度係基於使用特定儀器及特定設定之試驗且儀器與儀器之間可存在變化。在每一量測中均存在可變性。因此，精確質量及相對豐度係定義為接近如熟習此項技術者所理解者。在一個非限制性實施例中，術語定義為在20%內、較佳地10%、較佳地在5%內、更佳在1%內且最佳在0.5%內。在一個非限制性實施例中，精確質量之誤差在+/- 20 mmu內、較佳地10 mmu、更佳在5 mmu內且最佳在1 mmu內。在一個非限制性實施例中，相對豐度之誤差為+/- 20%、較佳地10%、較佳地在5%內、且更佳在1%內且最佳在0.5%內。
用於精確質量之方法
：使用即時直接分析(DART)離子源與飛行時間/質譜(TOF-MS)之組合表徵化合物並測定相對豐度。具體而言，DART TOF-MS係來自Jeol USA of Peabody, MA之JEOL DART™ AccuTOF-質譜儀(JMS-T100LC)。化合物之質量係在西洋接骨木提取物試樣中藉助Dip-IT取樣器及Dip-IT取樣器固持器(ionSense™)將試樣直接引入至離子流來測定。 用於DART離子源之設定係如下： 氣體：He 流速：2.52 LPM @ 50 PSI 溫度：250 C 針電壓：3000V 柵極電壓：250V 放電電極電壓：400V JEOL AccuTOF MS之設定係如下： 峰值電壓：1000V 孔口1溫度：120℃ 檢測器電壓：2600 V 反射器電壓：990.0 V 提取物試樣係在六個複製品中藉由DART-TOF MS進行分析。該六個複製品經分析以產生提取物之單一、經平均、經過濾且統計上顯著之DART指紋。此經處理之指紋然後藉由比較質量用於測定生物活性標誌物之存在。由於該等生物活性標誌物之初始發現及鑑別，故簡單的質量比較足以確定其在任何提取物或化學品之混合物中之存在。對於AccuTOF而言，質量公差小於20毫質量單位(mmu) (預測質量+/-10 mmu)。對於相同提取物及離子源，其他TOF-MS質譜儀可具有較高或較低之質量公差。
用於相對豐度之方法
：儘管利用DART進行簡單分析不需要試樣準備，但使用薑黃素摻雜/摻加之溶液用於藉助相對於已知量進行定量來測定測試組合物之相對豐度。已熟知且天然存在於接骨木中之標準品(例如芸香苷)將隨各種影響而變- 生長條件、收穫時間、植物健康等。出於量化生物標誌物之目的，芸香苷(或其他天然標準品)之天然變化使得其不能接受作為用於生物標誌物之絕對量化之基礎。為去除不一致性，使用並非接骨木中原生之化合物(在此情形中，薑黃素)作為生物活性分子之定量化學輪廓之基礎。 為測定具有未知濃度之本文所揭示生物標誌物之試樣的相對豐度，將1 mg/ml所揭示組合物之試樣摻雜/摻加0.01 mg/ml薑黃素。然後藉由以上所用之DART-TOF方法分析試樣。 表1揭示本文所揭示且在包含所有九種生物標誌物之組合物之非限制性、較佳實施例中所發現生物標誌物之相對豐度。
表 1
. 在較佳活性組合物中使用摻加有0.01 mg/ml薑黃素之1 mg/ml組合物所測定之生物標誌物的相對豐度.
實例 2 ( 用於實例 3 至 8 之調配物 )
包含具有活體外及活體內抗病毒活性之生物標誌物1至9之劑量可靠之接骨木提取物通常係根據Fink等人 2009及Roschek Jr.等人2009中所述之方法產生。 通常，將接骨木果實(西洋接骨木)磨碎並用EtOH:H
2
O (4:1, v/v)提取。將所收集部分在50℃下乾燥過夜以獲得結晶粉末。將程序重複多次以確保提取物之再現性。
實例 3 ( 安全性 )
測試HSRx 351以確定活體外細胞毒性。經測定，HSRx 351使用標準粒腺體還原酶活性分析(MTT)不顯示毒性徵象。MTT分析量測在MDCK細胞中之細胞代謝。在所測試之任何濃度(自0.02 mg/ml至2.4 mg/ml)下均未顯示毒性。
實例 4 ( 生物利用度 )
使用含有175 mg HSRx 351之經口菱形錠劑及含有350 mg HSRx 351之飲品測試HSRx 351以測定在人類個體中之生物利用度。經測定，最早在消耗後20分鐘時在人類個體之血液中看到生物標誌物，而一些在血流中保留達4小時。程序及結果闡述於Roschek及Alberte 2008中且結果顯示於下表2、圖8A及圖8B。 菱形錠劑 - 簡言之，在研究開始之前使六名個體接受無類黃酮飲食達24小時。在0分鐘與480分鐘之間在若干時間間隔處收集血液試樣。個體在時間零之後立即給予含有175 mg HSRx 351之菱形錠劑並使菱形錠劑在口腔中緩慢溶解。 飲品 - 簡言之，一名個體在開始血液收集及消耗飲品之前禁食24小時。在研究過程期間，個體僅接受水及無類黃酮之食品。在0分鐘與360分鐘之間在若干時間間隔處收集血液試樣。個體在時間零之後立即給予8盎司(ounce)飲品，其含有溶解於其中之兩片總共含有350 mg HSRx 351之菱形錠劑。
表 2
：在藉由在口腔中溶解菱形錠劑或攝取溶解之菱形錠劑經口遞送之HSRx 351中之生物標誌物6、7及9的生物利用度%(改編自Roschek及Alberte 2008)。
實例 5 ( 流行性感冒感染及 / 或流行性感冒樣症狀之治療 )
測試HSRx 351 (包含生物標誌物1至9之所揭示組合物之較佳實施例)以測定組合物之抗病毒性質及在人類個體中減輕流行性感冒症狀之效能。
人類研究
- 對於人類研究，評估HSRx 351治療六種流行性感冒及/或流行性感冒樣症狀之能力。研究顯示HSRx 351減少所有六種症狀。所用方法闡述於Kong 2009中。
治療
：簡言之，將HSRx 351組合物調配成緩慢溶解含有總共175 mg生物標誌物1至9之菱形錠劑。在外觀、味道及及除其缺少HSRx 351之組成方面相同之安慰劑菱形錠劑係在相似包裝中供應。實施隨機化、雙盲、安慰劑對照前導性臨床試驗以評估測試組合物用於治療流行性感冒及/或流行性感冒樣症狀之效能。研究中包括64名呈現流行性感冒症狀少於24小時但其他方面健康之志願者(年齡在16至60歲範圍內)。參與者具有以下症狀中之至少三者：發熱、頭痛、肌肉疼痛、咳嗽、黏液分泌及鼻塞。自研究排除懷孕、母乳哺育、患有慢性疾病之患者、懷疑具有細菌感染之患者、參與另一臨床試驗或最近接受流行性感冒藥物、抗病毒療法或流行性感冒疫苗接種之患者。要求患者一天服用四次HSRx 351菱形錠劑(n=32)或安慰劑菱形錠劑(n=32)達2天，在每餐之前一次且在睡覺之前一次。第一劑藥物係在研究者決定將患者選入研究中之後立即投與。
評估
：評價六種流行性感冒樣症狀之嚴重性以測定HSRx 351之效能：發熱、頭痛、肌肉疼痛、咳嗽、黏液分泌及鼻塞。為測定安慰劑及治療組是否臨床上相當，在治療開始時(基線)在視覺類比量表(VAS)上自0 = 沒有問題至10 = 有明顯問題來評價患者症狀。之後，指導患者在兩天治療期間在投與菱形錠劑之後一天四次藉由VAS自我評估其症狀並對其症狀改良進行評分。評價用於統計分析。
統計分析
：將假定認為係連續之變量表示為平均值，其中95%信賴區間係使用學生
t
(Student’s
t
)-分佈法構建。使用標準偏差及總範圍作為分佈之指數。使用雙尾測試以5%之顯著水準實施群組間及群組內分析二者。使用變異數分析模型利用重複量測分析連續分佈之變量以比較群組間及群組內二者。
結果
：在安慰劑組與HSRx 351治療組之間未觀察到人口統計特徵之明顯差異(表3)。在第一次治療前，評估患者之流行性感冒樣症狀(表4)。在第一次治療前大多數症狀之平均VAS分數在兩個組之間未顯示顯著差異(p＞0.05)，唯發熱之平均VAS分數除外(p=0.0256) (表5A)
表 3
. 所包括患者之人口統計特徵(改編自Kong 2009)。
表 4
. 在研究開始時治療及對照組中症狀之分佈(改編自Kong 2009)。
發熱：在研究起始時HSRx 351組中32名患者中的15名(46.9%)且安慰劑組中32名患者中的9名(28.1%)具有發熱(表4)。溫度範圍在37.3℃至38.8℃之間。第一個24小時治療後，HSRx 351組顯示發熱顯著降低，如由平均VAS分數自2.67 ±1.80降低至0.47 ±0.64 (p＜0.0001) (圖1)且60%發熱患者恢復至正常溫度(圖2)所證實。HSRx 351組中具有發熱之所有患者在48小時內恢復至正常溫度(圖2)。在安慰劑組中，大多數患者在48小時治療期內未能顯示發熱之任何改良，且此組中僅2名患者(22%)恢復至正常溫度(圖2)。 頭痛：在研究起始時兩個組中之所有患者均報告頭痛(表4)。經過24小時之治療，HSRx 351組顯示頭痛症狀之顯著減輕。平均VAS分數自4.47 ±2.14降低至1.53 ±1.41 (p＜0.0001) (圖1)。經過48小時，HSRx 351組之平均VAS分數接近零(0.28 ±0.63) (圖1)且此組中78%患者不再頭痛(圖2)，同時其餘22%報告僅輕微頭痛(VAS=1)。相比之下，在安慰劑組中頭痛變得更嚴重，其中平均VAS分數經48小時治療期自3.78 ±1.66增加至5.25 ±1.34 (p＜0.0001) (圖1)。安慰劑組中無任何單一個別個體報告頭痛之改良。 肌肉疼痛：兩個組中超過90%之患者報告肌肉疼痛(表4)。HSRx 351組之平均VAS分數在24小時內自2.87 ±2.13降低至1.19 ±1.05 (p=0.0002) (圖1)，此指示症狀之顯著改良。經過48小時，87%之患者已完全自肌肉疼痛恢復(圖2)，且平均VAS分數達到0.16 ±0.45 (圖1)。安慰劑組報告肌肉疼痛加劇，此乃因平均VAS分數自2.13 ±2.10增加至48小時時之3.47 ±1.50 (p=0.0013) (圖1)。 鼻塞：當入選於研究中時，HSRx 351組中之所有患者及安慰劑組中之87.5%患者報告鼻塞(表4)。經過24小時治療，HSRx 351組顯示症狀之顯著改良。此組之平均VAS分數自4.03 ±2.10降至1.47 ±1.14 (p＜0.0001) (圖1)。經過48小時，平均VAS分數降至0.56 ±0.62 (圖1)且50%之患者沒有症狀(圖2)。相比之下，安慰劑組中之鼻塞在大多數個體中在48小時時加劇。此組中之平均VAS分數自3.30 ±1.71增加至4.26 ±1.81 (p=0.049) (圖1)。安慰劑組中30名患者中僅2名(7%)顯示鼻塞緩和。 鼻黏液分泌：鼻黏液分泌係兩個研究組中患者間之較不常見且較不嚴重之症狀。HSRx 351組中僅50%患者且安慰劑組中34.3%患者報告鼻黏液分泌(表4)。儘管HSRx 351組之患者經24小時治療顯示一些改良(圖1)，但該改良並不顯著(p=0.26)。經過48小時治療，HSRx 351組顯示顯著症狀改良，其中平均VAS分數自1.94 ±1.61降低至0.50 ±0.52 (p=0.0019) (圖1)，16名患者中的8名(50%)報告無症狀且其餘50%報告僅輕微症狀(VAS=1)。在安慰劑組中，16名患者中僅1名(6%)報告症狀改良，而其餘15名患者顯示無症狀改良。 咳嗽：當入選於研究中時，兩個組中50%之患者報告咳嗽(表4)。在HSRx 351組中，咳嗽較其他症狀持續更長時間。此組經24小時治療期未記錄顯著改良(圖1)。經過48小時，16名患者中的5名(31%)咳嗽減輕且6名患者(37%)顯示症狀改良(VAS=1)。儘管平均VAS分數自2.07 ±2.19降低至1.00 ±0.926 (圖1)，但此降低統計上不顯著(p=0.093)。然而，群組間比較(表5C)揭露在HSRx 351組中咳嗽亦顯著改良(p＜0.0001)。在安慰劑組中，16名患者中的14名(87%)顯示症狀加劇且其餘2名患者 (13%)顯示輕微的症狀改良。安慰劑組之平均VAS分數自2.19 ±1.47增加至3.69 ±1.25 (p=0.0041) (圖1)。
不良效應
：任一組均未報告與治療有關之不良反應。
結果
：結果顯示HSRx 351可快速減輕流行性感冒樣症狀。HSRx 351組在治療起始之24小時內顯示症狀之顯著改良，而安慰劑組無症狀改良。在24小時內，全身性(發熱、頭痛及肌肉疼痛)及鼻症狀(鼻塞)在HSRx 351治療組中所有均顯著減輕。咳嗽及鼻黏液分泌在24小時時未顯示顯著改良，但在48小時治療內顯示改良。在48小時治療時，接近90% HSRx 351治療之患者無症狀或僅具有輕微症狀(VAS=1)。先前，接骨木糖漿顯示使流行性感冒症狀之持續時間減少3-4天(Zakay-Rones等人 1995；Zakay-Rones等人 2004)。相比之下，神經胺糖酸苷酶抑制劑藥物奧司他韋及紮那米韋治療報告僅減少2-2.5天(Monto等人 1999；Makela等人 2000；Nicholson等人 2000)。該等結果令人驚訝地顯示，HSRx 351在改良流行性感冒之症狀及縮短持續時間方面具有與目前所用抗病毒藥物或接骨木糖漿類似或甚至優於其之效能。 在此處臨床研究中，HSRx 351顯示係安全的，此乃因接受HSRx 351之患者未報告任何不良事件，包括噁心及嘔吐(其係抗病毒治療中常見之兩種嚴重事件)(Nicholson等人 2000)。
表 5.
在治療起始(A)、24小時(B)及48小時(C)時HSRx 351治療組及安慰劑治療組之VAS分數的比較(改編自Kong 2009)。
分數0指示沒有問題，且分數10指示有明顯問題。
實例 6 ( 與 TAMIFLU® 組合治療流行性感冒感染及 / 或流行性感冒樣症狀 )
招募具有流行性感冒症狀但其他方面健康之個體以評估HSRx 351當與Tamiflu®組合時在改良流行性感冒或流行性感冒樣疾病之徵象及症狀之效應。該研究係隨機化、單盲、安慰劑對照、比較治療臨床研究及評價。
方法
：將符合所有納入/排除準則且呈現與流行性感冒或流行性感冒樣疾病一致之症狀之58名個體入選於治療組D或C。排除準則包括年齡小於16歲及年齡超過70歲之個體(subject)、或懷孕、母乳哺育、患有慢性疾病、懷疑具有細菌感染、參與另一臨床試驗、或最近接受流行性感冒藥物、抗病毒療法或流行性感冒疫苗接種之個體(individual)。 將個體隨機化並置於五天之治療方案中。組C含有29名個體，其接受75 mg呈膠囊形式之Tamiflu® (磷酸奧司他韋)，一天兩次達五天。組D含有29名個體，其接受75 mg呈膠囊形式之Tamiflu® (磷酸奧司他韋)及兩片175 mg HSRx 351之菱形錠劑，一天兩次達5天。在篩選訪視後，個體在第3天、第5天及第10天返回進行訪視。 基於研究者評價症狀及整體健康評估治療效能。所評價之症狀係：1) 各種疼痛；2) 咳嗽程度；3)咳嗽頻率；4) 睡眠品質；5)呼吸道中之黏液分泌；6) 鼻塞；及7) 發熱減少。在基線訪視時評價症狀以確定兩個組在研究開始時是否臨床上相當。在基線訪視時且然後在5天治療期間一天四次及在治療結束後一天兩次持續5天使個體在視覺類比量表(VAS)上自0 = 沒有問題至10 = 有明顯問題對其症狀進行評分。亦指示個體記錄任何不良事件。在複診時，研究人員使用相同量表標注個體之評價。
統計分析 / 結果
- 實施存活分析以比較隨時間組C及D之流行性感冒症狀函數。計算存活與風險函數之時間依賴性事件係每一個體之最後一次數據收集訪視。運行廣義線性混合模型以測試在組合治療組D對僅Tamiflu® (磷酸奧司他韋)之治療組C中較少不良事件之假設。評估參數估計值(例如β權重及R2)，同時P值顯著水準設定為5%。
結果
：在除咳嗽程度之降低以外之所有參數中，HSRx 351之額外使用增加個體自流行性感冒及流行性感冒樣疾病恢復之速率，其中兩個組未顯示顯著差異(二者均在誤差邊際內)。參見表6B。組合治療亦減少流行性感冒及流行性感冒樣疾病之症狀並降低使用Tamiflu®之不良副作用。參見表6A及6B。
表 6A
：與Tamiflu®組合治療流行性感冒感染及/或流行性感冒樣症狀之臨床研究的主要結果
表 6B
：與Tamiflu®組合治療流行性感冒感染及/或流行性感冒樣症狀之臨床研究的主要統計結果
實例 7 ( 流行性感冒感染之預防 )
測試HSRx 351、生物標誌物6及生物標誌物7之類似物3-羥基黃烷酮(「生物標誌物7類似物」)以測定組合物在活體外及活體內二者之流行性感冒病毒感染預防性質。經測定，HSRx 351預防培養之Madin-Darby犬腎上皮(MDCK)細胞之H1N1、H3N2及H5N1感染並阻止病毒結合至紅血球。
在血球凝集抑制測試中之預防
- 血球凝集係一種凝集形式，其涉及紅血球結合至可在一些病毒(流行性感冒病毒)上發現之血球凝集素。在高濃度病毒下，紅血球結合病毒之血球凝集素蛋白質並保持懸浮於溶液中。在較低濃度之病毒下，紅血球相反可沉降於溶液底部。此處，已確定HSRx 351阻止紅血球結合至流行性感冒病毒之血球凝集素蛋白質(圖4)。
方法
：孔準備有磷酸鹽緩衝鹽水。跨越孔之所有列製備A型流行性感冒病毒(A/PR/8/34) (ATCC)之連續稀釋液，其中稀釋自左至右增加(病毒濃度自左至右降低)，唯僅含有於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中之紅血球且無病毒之陰性對照列(頂部列)除外。將恆定濃度之抑制血球凝集素(pAB)之抗體添加至亦含有病毒之陽性對照列(自頂部第三列)。將HSRx 351 (HS9)以恆定濃度添加至三個測試列(三個底部列)以一式三份測試HSRx 351抑制血球凝集之能力。陰性+病毒對照列(自頂部第二列)係藉由將病毒以與其他列中之孔相同之濃度稀釋於PBS中來產生，但未添加pAB或HSRx 351。將恆定濃度之紅血球(RBC)添加至所有孔。藉由目視檢查每一孔來測定血球凝集程度。其中紅血球在底部沉降以形成集中紅點之孔指示極少至沒有血球凝集及極少至沒有病毒結合至紅血球。其中紅血球未在底部沉降以形成集中紅點而是分散於溶液中之孔指示血球凝集且病毒結合至紅血球。血球凝集之抑制可藉由比較測試孔(三個底部列)與含有相同病毒稀釋液之陰性 +病毒對照孔(自頂部第二列)之分散紅血球之量來測定。
結果
：陰性對照列(頂部列, RBC + PBS)顯示在單獨PBS中紅血球無法血球凝集。陰性+病毒對照列(自頂部第二列，病毒+ PBS + RBC)顯示病毒能使紅血球血球凝集(參見左側兩個孔中之擴散紅色)，但該能力取決於病毒濃度，此乃因降低之病毒濃度降低血球凝集之量(參見中間孔中較少擴散紅色及在右側兩個孔中極少至沒有擴散紅色)。陽性對照列(自頂部第三列, pAb +病毒+ RBC)與陰性+病毒對照列相比，顯示恆定濃度之pAB在某些濃度之病毒下抑制血球凝集，參見自左側第二及第三孔。具有HSRx 351之三個測試列(三個底部列, HS9 +病毒+ RBC)顯示恆定濃度之HSRx 351 (HS9)類似於pAB抑制血球凝集，參見自左側第二及第三孔。因此，HSRx 351已顯示降低血球凝集且表明HSRx 351之組份可結合A型流行性感冒病毒之血球凝集素並阻止病毒結合至紅血球。
在細胞培養研究中之預防
- 使用病毒集中減少感染分析(viral focus reduction infection assay)以測定病毒感染之預防。方法遵循Roschek Jr 2009中所述之彼等。簡言之，將HSRx 351、生物標誌物6類似物、生物標誌物7類似物或陽性對照：奧司他韋或金剛烷胺溶於EtOH中且然後溶於達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)中。將病毒株：H1N1病毒株A/PR/8/34 (ATCC, Manassas, VA；ATCC No. VR-1469)；H3N2 (ATCC)；或H5N1 (ATCC)之病灶形成單位(FFU)與HSRx351、生物標誌物6類似物、生物標誌物7類似物或對照稀釋液一起在室溫下培育1小時。然後在室溫下使FFU感染鋪滿的MDCK細胞達1小時。然後將細胞用新鮮甲醛固定並利用EtOH進行滲透化處理。使用山羊A型流行性感冒病毒IgG多株抗體(H&L)及兔抗山羊辣根過氧化物酶偶聯親和純化抗體(Chemicon, Temecula, CA)及AEC色素原受質(Dako, Carpinteria, CA)使FFU可視化。
結果
：病毒與HSRx 351、生物標誌物6類似物或生物標誌物7類似物一起預培育使得結合至MDCK細胞及/或在MDCK細胞中發現之FFU降低超過未預先暴露於測試化合物/組合物之病毒。測試針對病毒之活體外HSRx 351 IC
50
值，如表7中所示。此外，在1,000 µg/ml時達成H1N1感染之100%抑制(圖3)。此外，已發現，基於生物標誌物於HSRx 351中之濃度，生物標誌物6類似物及7類似物之活性並不負責HSRx 351之整個活性。實際上，HSRx 351組合物之活性分別比藉由組合物中生物標誌物6或生物標誌物7之濃度所預期之活性高超過18倍及超過500倍(圖5及圖6)。此表明，HSRx 351之生物標誌物之間可存在協同作用。
表 7
：HSRx 351、生物標誌物6類似物及生物標誌物7類似物對抗若干種流行性感冒病毒之活性(部分地改編自Roschek Jr 2009)。
實例 8 ( 與 TAMIFLU® 組合預防流行性感冒感染 ) 人類患者中之預防
- 對於人類研究，評估HSRx 351與Tamiflu®組合以預防流行性感冒及/或流行性感冒樣症狀之能力。招募健康個體以評估HSRx 351當與Tamiflu®組合時對預防流行性感冒之效應。該研究係隨機化、單盲、安慰劑對照、比較治療臨床研究及評價。研究顯示該組合預防流行性感冒及/或流行性感冒樣症狀。
方法
：簡言之，將HSRx 351組合物調配成含有總共175 mg欲投與之生物標誌物1至9與75 mg Tamiflu®之組合物之緩和溶解菱形錠劑 實施利用Tamiflu® (開放標籤)之隨機化、單盲、比較治療臨床研究及評價以評估測試組合物用於預防流行性感冒及/或流行性感冒樣症狀之效能。 將符合所有納入/排除準則且在研究起始時藉由QuickVue流行性感冒A+B套組(Quidell Corporation, SAN DIEGO, CA)針對A型或B型流行性感冒之兩次測試為陰性且不展現流行性感冒之任何其他症狀之健康個體招募於預防組C或D。排除準則包括年齡小於16歲及年齡超過70歲之個體、或懷孕、母乳哺育、患有慢性疾病、懷疑具有細菌感染、參與另一臨床試驗、或最近接受流行性感冒藥物、抗病毒療法或流行性感冒疫苗接種之個體。 將個體隨機化並置於10天之預防方案中。組C含有30名個體，其接受單獨的Tamiflu® (磷酸奧司他韋)。組D含有30名個體，其接受Tamiflu® (磷酸奧司他韋)及HSRx 351。要求兩個組中之個體每天服用1粒含有75 mg Tamiflu® (磷酸奧司他韋)之膠囊且要求組D中之個體在服用Tamiflu® (磷酸奧司他韋)之後亦立即服用兩片菱形錠劑，每一片含有175 mg HSRx 351。遵循治療方案達10天。第一劑藥物係在研究者決定將患者選入研究中之後立即投與。在篩選訪視後，個體在第3天、第5天及第10天返回進行訪視並評估。
評估
：基於研究者評價症狀及整體健康評估治療效能。所評價之症狀係：1) 各種疼痛；2) 咳嗽程度；3)咳嗽頻率；4) 睡眠品質；5)呼吸道中之黏液分泌；6) 鼻塞；及7) 發熱減少。在基線訪視時評價症狀以確定兩個組在研究開始時是否臨床上相當。在基線訪視時且然後一天四次達10天使個體自0至10 (0為無症狀且10為有明顯問題)對其症狀進行評分。個體亦記錄任何不良事件。在複診時，研究人員使用相同量表標注個體之評價。另外，使用碧迪公司柔軟植絨鼻拭子(Becton Dickinson Flexible Flocked Nasal Swab)以在第一、第二、第三及第四訪視(分別在第1天、第3天、第5天及第10天)時擦拭個體的鼻子並使用即時聚合酶鏈式反應(PCR)程序以測定流行性感冒病毒感染之存在及數量(若有)。
統計分析
- 由於組D中之個體未感染流行性感冒病毒感染，故不能實施統計比較研究。
結果：
研究係在CDC歸類為中重度流行年(2014-2015)之地區進行。流行性感冒樣疾病升高超過國家基線2%達14個連續週，峰值為6%。在研究開始時，所獲得並一式兩份分析之QuickVue鼻拭子對於患者而言均為陰性。在第1天、第3天、第5天及第10天自患者獲得之鼻拭子的PCR分析證實任一組中之患者在研究過程中均未感染流行性感冒。 在研究過程中組C (Tamiflu®單獨)中報告五例醫學相關之不良事件，而在組D (Tamiflu®及HSRx 351)中僅報告一例醫學相關之不良事件。 結果顯示HSRx 351與Tamiflu®組合可預防流行性感冒及流行性感冒樣感染。在研究期間，HSRx 351與Tamiflu®組合組中之個體均為感染流行性感冒。此外，HSRx 351顯示降低Tamiflu®單獨服用所發生之不良事件的數量。
實例 9 ( 協同 )
如前所述，本文之試驗結果表明本文所揭示之生物標誌物之間的協同作用(圖5及圖6)。此外，由於本文所揭示生物標誌物作用之預測方法，據信生物標誌物與藉助單獨機制起作用之其他抗病毒化合物協同作用。為進一步證實該協同作用並測定與其他化合物/組合物之協同作用，本文所揭示生物標誌物中之一或多者與本文所揭示其他生物標誌物中之一或多者及/或一或多種抗流行性感冒藥物組合測試。組合研究可顯示用於治療及/或預防流行性感冒病毒感染之競爭性、加性或協同相互作用、該組合在細胞培養、動物研究、人類研究等中之細胞存活率、細胞毒性、副作用等。研究之非限制性實例可包括彼等上文及此處所述者以及熟習此項技術者已知之彼等。作為非限制性實例，可測試HSRx 351及奧司他韋之組合。 可實施以測定組合之競爭性、加性或協同相互作用之組合分析的非限制性實例可利用常用於檢查藥物相互作用及協同作用之相互作用矩陣。在一個實例中，在細胞培養之流行性感冒病毒感染的預防研究中使用相互作用矩陣。簡言之，試驗可具有25份試樣：4份具有單獨的第一測試化合物/組合物(例如HSRx 351)，4份具有單獨的第二測試化合物/組合物(例如奧司他韋)，1份不具有化學品，且其餘16份可為第一及第二測試化合物/組合物之組合。可測試第一測試化合物/組合物自起始濃度(例如對於HSRx 351，1 mg/ml)之1:4稀釋液及第二測試化合物/組合物自起始濃度(例如對於奧司他韋，1.0 µg/ml)之1:4稀釋液。流行性感冒病毒之感染及培養可在抑制化合物之恆定存在下發生。以此方式，該試驗模擬儘管進行預防性治療但仍感染之患者並測試感染藉由單獨的第一測試化合物/組合物、單獨的第二測試化合物/組合物及二者在一系列濃度下之組合之組合。數據可利用Berenbaum方法分析以測定競爭性、加性或協同相互作用。(Berenbaum 1977)。
實例 10 ( 針對流行性感冒之直接結合分析 )
如上所述，HSRx 351已使用流行性感冒病毒顯示抑制血球凝集，此僅由病毒血球凝集素蛋白質(圖4)介導且表明組合物結合至流行性感冒血球凝集素。此外，使用Roscheck Jr 2009中所述之方法評估HSRx 351中之測試生物標誌物至流行性感冒病毒及血球凝集素之直接結合。其顯示，生物標誌物3、6、7類似物及9結合H1N1病毒粒子且生物標誌物6及7預計結合血球凝集素。所用方法闡述於Roschek Jr 2009中。
病毒粒子
- 簡言之，將H1N1病毒粒子與HSRx 351或合成生物標誌物6或7類似物一起培育，以結合HSRx 351內之化合物。培育之後，藉助100 kDa分子量截留膜過濾器(Amicon 100 kDa過濾器, Ultracel PL-100；Millipore Corp. Billerica, MA)利用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)將病毒粒子洗滌三次去除未結合化合物。然後收集病毒粒子並固定於100% EtOH中。收集經固定之病毒粒子及含有未結合化學品之洗滌部分並直接藉由DART TOF-MS分析用於比較。
結果
：生物標誌物3、6、7及9藉由DART TOF-MS鑑別為在經固定病毒試樣中顯著富集超過洗滌部分(關於生物標誌物6及生物標誌物7，參見Roschek Jr 2009)。
血球凝集素
- 簡言之，採用使用Chem 3D Ultra (Cambridgesoft, Cambridge, MA)分子建模軟體包之三維自由能最小化使用分子力學二能級理論用於生物標誌物6及7之自由能最小化。
結果
：最小化自由能建模分析揭露生物標誌物6及7之A及B環形成軸，其中酚間環距離分別為10.5 Å及109 Å。此距離充分地在流行性感冒病毒之血球凝集素(HA)結合結構域袋(14-15 Å) (其負責宿主細胞受體結合及病毒進入)之大小限制內。生物標誌物6之酚區域最可能結合至病毒甘露糖富集HA結合結構域。
實例 11 ( 茲卡病毒之抑制 )
測試HSRx 351以確定活體外茲卡病毒感染預防性質。經測定，HSRx 351以小於100 µg/ml且大約80 µg/ml之IC
50
預防培養之非洲綠猴纖維母細胞樣腎細胞(Vero E6細胞)之茲卡感染。
在細胞培養研究中之茲卡預防
- 使用病毒噬斑減少中和測試(PRNT)以測定病毒感染之預防。簡言之，將HSRx 351溶於200 µl DMSO中且然後稀釋於達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM) (pH 7.2)中。將茲卡病毒株之噬斑形成單位(PFU)與HSRx 351或對照稀釋液於室溫下培育1小時。然後使PFU在室溫下感染鋪滿之Vero細胞達1小時。噬斑藉由利用中性紅染色來可視化。
結果
：病毒與HSRx 351一起預培育使得結合至Vero E6細胞及/或在Vero E6細胞中發現之噬斑形成單位(PFU)降低超過未預先暴露於測試化合物之病毒。參見圖7。經測定，針對茲卡病毒之活體外HSRx 351 IC
50
值為大約80 µg/ml。此外，在250 µg/ml時達成茲卡感染之100%抑制。
實例 12 ( 其他套膜病毒之抑制 )
測試HSRx 351以確定活體外針對套膜病毒HIV (多種亞型)、單純皰疹1 (HSV-1)及登革(DEN-2)之病毒感染預防性質。經測定，HSRx 351對於每一病毒以表8中所示之IC
50
預防培養之細胞感染。該等結果與其他套膜病毒之額外結合、治療、預防及抑制結果組合令人驚訝地顯示，本文所揭示之組合物係對抗套膜病毒之廣譜抗病毒組合物。
細胞培養研究中之感染預防
- 使用病毒病灶減少感染分析以測定病毒感染之預防。簡言之，將HSRx 351溶於100% DMSO中且然後稀釋於達爾伯克改良伊格爾培養基(DMEM)中。將測試病毒株之噬斑形成單位(PFU)或病灶形成單位(FFU)與HSRx 351或對照稀釋液於室溫下培育1小時。然後使PFU/FFU在室溫下感染鋪滿之用於HIV之GHOST細胞 (關於試驗條件，參見Fink等人，2009)、用於HSV-1之Vero細胞或用於登革熱病毒之LLCMK2細胞達1小時。然後將細胞用新鮮甲醛固定並利用EtOH進行滲透化處理。使用對抗登革熱病毒之山羊IgG多株抗體(H&L)及兔抗山羊辣根過氧化物酶偶聯親和純化抗體(Chemicon, Temecula, CA)及AEC色素原受質(Dako, Carpinteria, CA)使登革感染細胞中之FFU可視化。使用光學顯微鏡以測定HSV-1之感染率。使用螢光顯微鏡以測定HIV之感染率。
結果
：病毒與HSRx 351一起預培育使得結合至細胞及/或在細胞中發現之FFU及PFU降低超過未預先暴露於測試組合物之病毒。經測試，針對HIV-1亞型B1、B2、C1及C2之活體外HSRx 351 IC
50
值在201 µg/ml至36 µg/ml範圍內。針對HSV-1之活體外HSRx 351 IC
50
值為40 µg/ml且對於DEN-2，其為63 µg/ml。
表 8
：HSRX 351對抗若干套膜病毒之活性。
實例 13 ( 針對登革熱病毒之直接結合分析 )
如上所述，HSRx 351已顯示抑制登革熱病毒且表明組合物結合至登革。此外，評估HSRx 351至登革熱病毒之直接結合。已顯示，HSRx 351中之若干化合物在活體外結合登革熱病毒。
病毒粒子
- 簡言之，將登革熱病毒粒子(DEN-2)與HSRx 351一起培育，以結合HSRx 351內之化合物。培育之後，藉助100 kDa分子量截留膜過濾器(Amicon 100 kDa過濾器, Ultracel PL-100；Millipore Corp. Billerica, MA)利用磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)將病毒粒子洗滌三次去除未結合化合物。然後收集病毒粒子並固定於100% EtOH中。收集經固定之病毒粒子及含有未結合化學品之洗滌部分並直接藉由DART TOF-MS分析用於比較。
結果
：生物標誌物3、6、7及9藉由DART TOF-MS鑑別為在經固定病毒試樣中顯著富集超過洗滌部分。
實例 14 ( 人類鼻病毒之抑制 )
測試HSRx 351以確定活體外對於人類鼻病毒(HRV)(一種通常感染人類且與普通感冒相關之非套膜病毒)之病毒感染預防性質。經測定，HSRx 351以90 µg/ml之IC
50
預防HRV-16感染培養之HeLa細胞。該等結果連同流行性感冒及流行性感冒樣疾病治療及預防、關於流行性感冒病毒之抑制及結合研究一起令人驚訝地顯示，本文所揭示之組合物可用於治療及預防流行性感冒及流行性感冒樣疾病。
在細胞培養研究中之人類鼻病毒預防
- 使用病毒病灶減少感染分析以測定病毒感染之預防。簡言之，將HSRx 351溶於100% DMSO中且然後稀釋於達爾伯克改良伊格爾培養基/F12 (DMEM/F12) (pH 7.2)中。將HRV-16病毒株之噬斑形成單位(PFU)與HSRx 351或對照稀釋液於室溫下培育1小時。然後使PFU在室溫下感染80%鋪滿之HeLa細胞達1小時。然後將細胞用新鮮甲醛固定並利用EtOH進行滲透化處理。使用山羊HRV病毒IgG多株抗體(H&L)及兔抗山羊辣根過氧化物酶偶聯親和純化抗體(Chemicon, Temecula, CA)及AEC色素原受質(Dako, Carpinteria, CA)使PFU可視化。
結果
：病毒與HSRx 351一起預培育使得結合至HeLa細胞及/或在HeLa細胞中發現之PFU及PFU降低超過未預先暴露於測試組合物之病毒。針對人類鼻病毒之活體外HSRx 351 IC
50
值經測定為90 µg/ml。 * * * * * * * * * * * * * * 根據本揭示內容，本文中所揭示及主張之所有組合物及/或方法可在無需過度實驗之情形下製得及執行。儘管本發明之組合物及方法已根據較佳實施例予以闡述，但熟習此項技術者應明瞭，可對該等組合物及/或方法及本文所述方法中之步驟或步驟之順序作出改變，此並不背離本發明之概念、精神及範圍。更具體而言，應明瞭，某些在化學及生理上相關之試劑可代替本文所述試劑，同時將達成相同或類似結果。對於熟習此項技術者顯而易見之所有該等類似替代物及修改皆視為在由隨附申請專利範圍界定之本發明精神、範圍及概念內。
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