CN108451938A - 亚硫酸氢钠甲萘醌在预防和治疗阿尔兹海默病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有预防和治疗阿尔兹海默病作用的药物——亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)，本发明研究发现亚硫酸氢钠甲萘醌具有能够显著抑制阿尔兹海默病(AD)致病蛋白‑‑β‑淀粉样蛋白1‑42(Aβ42)的聚集、延缓β‑淀粉样蛋白1‑42淀粉样聚集过程中的二级结构由无规则卷曲向β片层转变、减弱β‑淀粉样蛋白1‑42毒性聚集体的破坏细胞膜能力及抑制细胞内β‑淀粉样蛋白1‑42的聚集、在秀丽隐杆线虫AD模型中亚硫酸氢钠甲萘醌能明显延长线虫寿命且安全性高等作用，揭示亚硫酸氢钠甲萘醌能用于制备具有预防或/和治疗阿尔兹海默病作用的药物。

Description

亚硫酸氢钠甲萘醌在预防和治疗阿尔兹海默病中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及治疗阿尔兹海默病的药物，具体涉及亚硫酸氢钠甲萘醌在预防和治疗阿尔兹海默病中的应用。

背景技术

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)，又称老年痴呆，是一种起病缓慢的、患病人数最多的、与年龄相关的不可逆发展的神经系统退行性疾病，临床表现为短期记忆退化、理解表达能力下降、认知障碍及性格改变等。AD患者从确诊至死亡平均历时9年，给患者本身、家人乃至整个社会带来了沉重的负担。随着全球人口老龄化加速，AD患病人数逐年攀升，预计至2050年全球AD患者人数将远超过1亿人。β-淀粉样蛋白1-42(amyloid-β1-42,Aβ42)错误折叠聚集形成的聚集体的毒性作用被认为是导致AD的重要病因。现在的治疗AD的药物仅能在一定程度上改善症状，而不能达到深刻的治疗疾病的效果，所以寻找治疗和预防AD的药物迫在眉睫。

目前，针对抑制β-淀粉样蛋白1-42聚集的先导化合物，其它类型的化合物由于毒性、溶解性等等成药性的问题，尚未有成功进入临床的例子。而醌类化合物对β-淀粉样蛋白1-42聚集的作用还未有人研究过。

发明内容

本发明的任务是提供一种预防和治疗阿尔兹海默病的药物。

实现本发明的技术方案是：

本发明提供的预防和治疗阿尔兹海默病的药物是亚硫酸氢钠甲萘醌。

在本发明的研究中，1,4-萘醌显示了强大的抑制淀粉样蛋白聚集的效果，但由于其较强的生物毒性，临床应用受到限制。我们推测具有和萘醌类似结构，但毒性较小的化合物有希望成为更有潜力的治疗和预防AD的药物。按照此思路我们发现了亚硫酸氢钠甲萘醌(menadione sodium bisulfite,MSB)一个具有1,4-萘醌母核(1,4-naphthoquinone,NQ)结构的化合物，属于维生素K3家族，是人工合成的维生素K3系列化合物之一，具有良好的水溶性，现已被制成注射剂及片剂，在国内临床上主要用于出血性疾病，如低凝血酶原血症、维生素K缺乏症及新生儿自然出血等，大剂量时还可用于胆镇痛。本发明研究了亚硫酸氢钠甲萘醌对β-淀粉样蛋白1-42淀粉样聚集的影响。

本发明研究发现亚硫酸氢钠甲萘醌能浓度依赖性地抑制β-淀粉样蛋白1-42的淀粉样聚集、延缓β-淀粉样蛋白1-42聚集过程中的二级结构由无规则卷曲向β片层转变、减弱β-淀粉样蛋白1-42毒性聚集体的破膜能力、抑制细胞内β-淀粉样蛋白的聚集及延长表达人β-淀粉样蛋白1-42的转基因秀丽隐杆线虫株CL2120的寿命，本发明为亚硫酸氢钠甲萘醌用于制备用于预防和治疗阿尔兹海默病的药物提供了依据。

本专利申请的实施例提供了亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制β-淀粉样蛋白1-42的淀粉样聚集、亚硫酸氢钠甲萘醌能够延缓β-淀粉样蛋白1-42聚集过程中的二级结构由无规则卷曲向β片层转变、亚硫酸氢钠甲萘醌能够减弱β-淀粉样蛋白1-42毒性聚集体的破坏细胞膜能力和溶血作用、亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制转基因秀丽隐杆线虫株CL2120中Aβ42的聚集及延长线虫寿命、以及亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制细胞内β-淀粉样蛋白的聚集的实验资料，揭示亚硫酸氢钠甲萘醌能用于制备具有预防或/和治疗阿尔兹海默病作用的药物，具体可以由作为活性成分的亚硫酸氢钠甲萘醌和药学上可接受的载体或可药用辅料制成用于治疗阿尔兹海默病的药物制剂。

附图说明

图1中1A和1B分别是1,4-萘醌(NQ)和亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB)的化学结构，1C是β-淀粉样蛋白1-42的氨基酸序列；

图2是本发明化合物对β-淀粉样蛋白1-42的淀粉样聚集的抑制作用：2A是硫磺素T荧光检测结果，2B是电镜检测结果；

图3是本发明化合物对β-淀粉样蛋白1-42的淀粉样聚集过程中二级结构变化的影响测试；

图4是本发明化合物对β-淀粉样蛋白1-42聚集体的破膜作用和溶血作用测试；

图5是本发明化合物对表达人β-淀粉样蛋白1-42的转基因秀丽隐杆线虫株CL2120体内β-淀粉样蛋白1-42的聚集及寿命的影响测试；

图6是本发明化合物对细胞内β-淀粉样蛋白聚集的影响测试。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

本发明的亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制β-淀粉样蛋白1-42的淀粉样聚集；能够延缓β-淀粉样蛋白1-42聚集过程中的二级结构由无规则卷曲向β片层转变；能够减弱β-淀粉样蛋白1-42毒性聚集体的破坏细胞膜能力；能够抑制细胞内β-淀粉样蛋白的聚集；能够延长表达人β-淀粉样蛋白1-42的转基因秀丽隐杆线虫株CL2120的寿命。

以下为实施例：

实施例1

亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制β-淀粉样蛋白1-42的淀粉样聚集。

具体操作：将β-淀粉样蛋白1-42(Aβ42)干粉(购买于北京泽溪源生物科技有限公司)溶解成浓度为20微摩尔每升的溶液，分别加入亚硫酸氢钠甲萘醌(MSB，购买于上海阿拉丁生化科技有限公司)和1,4-萘醌(NQ，购买于上海阿拉丁生化科技有限公司)，配制成混合溶液，按摩尔比分组为Aβ42,Aβ42:NQ1:0.5,Aβ42:MSB 1:0.5/1:1/1:2(见表1)，在37℃水浴中静置孵育12h，于0、1、3、6、9、12h取孵育后的溶液进行硫磺素T荧光检测(见图2A)，并于4、12h取样进行透射电子显微镜检测(见图2B)。

表1.Aβ42溶液及其与NQ、MSB混合溶液的分组

实验结果如图2所示，Aβ42在实验条件下迅速聚集，荧光读值明显增强，硫磺素T可与蛋白质聚集产物特异结合，结合后在450nm激发光照射下发出荧光，荧光读值增强表明聚集产物的形成增多，结合电镜，Aβ42形成了典型的成熟的线状纤维结构，此过程在人体内与阿尔兹海默症的发生相关(ACS Chem.Biol.8(2013)856–865.)；与NQ共同孵育的Aβ42，聚集的荧光强度明显下降，仅形成少量无定型的聚集物；与不同浓度MSB共同孵育的Aβ42，聚集的荧光强度呈梯度明显下降，形成的纤维密度明显低于Aβ42组，表明亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制Aβ42的淀粉样聚集。

实施例2

亚硫酸氢钠甲萘醌能够延缓β-淀粉样蛋白1-42聚集过程中的二级结构由无规则卷曲向β片层转变。

具体操作：将20微摩尔每升的Aβ42样品置于37℃水浴孵育2h，每隔30min将样品取出转入到光程为1mm的圆二色专用比色皿中，进行波长扫描，参数设置为波长从260nm至200nm，带宽2nm，数据间隔1nm，响应时间1s，扫描速度100nm/min，全程以流量3ml/min通以氮气，每个样品累计扫描3次并取平均值，以磷酸盐缓冲液为对照，处理数据时减去对照组(见图3)。

实验结果如图3所示，孵育初始时刻，各组Aβ42在圆二色谱中均表现为200nm处的负峰，显示为无规则卷曲结构；孵育0.5h后，Aβ42原先在200nm处的负信号减弱至0，转而在218nm处表现为很强的负信号(见图3A)，显示出Aβ42的二级结构由无规则卷曲转变为β片层；给予NQ及不同浓度MSB后，未明显抑制Aβ42二级结构的转变过程，但均显著降低了Aβ42错误折叠形成β片层结构的程度(见图3B-D)，表明亚硫酸氢钠甲萘醌能够延缓β-淀粉样蛋白1-42聚集过程中的二级结构由无规则卷曲向β片层转变。

实施例3

亚硫酸氢钠甲萘醌能够减弱β-淀粉样蛋白1-42毒性聚集体的破坏细胞膜能力和溶血作用。

具体操作：1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰甘油(POPG，购买于美国Sigma-Aldrich公司)溶解于氯仿中，氮气吹干，再用含有羧基荧光素(购买于美国Sigma-Aldrich公司)的溶液溶解，形成包裹羧基荧光素的POPG脂质体膜。用PD-10层析柱(购买于生工生物工程股份有限公司)去除未包裹进脂质体的荧光素。然后将此膜与孵育好的Aβ42样品混合，检测样品的荧光强度。Aβ42的聚集产物在人体内通过破坏细胞膜产生毒性作用，在此实施例中，用POPG包裹羧基荧光素构成人工脂质体膜，用于模拟人细胞膜的结构，将此膜与孵育好的Aβ42样品混合使充分作用，Aβ42的聚集产物可以破坏膜结构，使包裹的羧基荧光素泄露导致荧光读值升高，进行荧光检测并计算破膜率，破膜率可用于衡量毒性聚集体的破坏细胞膜作用；将Aβ42与血细胞共同孵育后，β42的聚集产物可破坏红细胞膜，使细胞内容物泄露，测定特定波长下的吸光度并计算溶血率，溶血率也可用于衡量毒性聚集体的破坏细胞膜作用。实验结果如图4所示，Aβ42样品与脂质膜孵育后引起了明显的破膜作用而NQ和MSB无膜损伤作用；给予NQ后，Aβ42的破膜作用显著下降；给予不同浓度MSB后，Aβ42的破膜作用呈梯度下降，表明MSB能够减弱Aβ42毒性聚集体的破膜作用并具有浓度依赖性(见图4A)。溶血实验显示，Aβ42与血细胞共孵育后产生了明显的溶血作用；给予NQ后，Aβ42引起的溶血作用明显降低；给予不同浓度的MSB也降低了溶血作用，表明MSB能够减弱Aβ42毒性聚集体的溶血作用并具有浓度依赖性(见图4B)。

实施例4

亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制转基因秀丽隐杆线虫株CL2120中Aβ42的聚集及延长线虫寿命。

转基因秀丽隐杆线虫株CL2120是一个常用的阿尔兹海默症疾病动物模型，其可自身在体内表达人Aβ42，低温下Aβ42聚集不明显，温度升高可引起Aβ42的聚集加快，聚集产物对虫体产生毒性作用，最终导致虫体死亡。

具体操作：将2种浓度的MSB及NQ混合于大肠杆菌OP50中给药，升高线虫培养温度刺激转基因秀丽隐杆线虫株CL2120表达人β-淀粉样蛋白1-42，24小时后收集线虫进行斑点杂交(蛋白免疫印迹)实验、逆转录-聚合酶链式反应实验及毒性检测；线虫给予低浓度化合物后，在线虫生长温度下进行寿命实验。实验结果如图5所示，斑点杂交实验中A11和OC抗体分别识别淀粉样蛋白聚集形成的寡聚体(初级聚集产物)和纤维(成熟聚集产物)、6E10抗体识别β-淀粉样蛋白1-16氨基酸序列，actin抗体识别细胞骨架蛋白(用于标记用于检测的总蛋白量)，实验表明低浓度NQ及MSB(2mM)在不影响β-淀粉样蛋白1-42总量情况下可抑制β-淀粉样蛋白1-42淀粉样聚集(见图5A)，提高MSB浓度后能够降低β-淀粉样蛋白1-42总量(见图5B)，而不影响β-淀粉样蛋白1-42的mRNA水平(见图5C&5D)；检测时间内MSB对线虫几乎无毒性作用，而NQ却展现了明显的毒性(见图5E)。寿命实验表明，MSB可明显延长线虫CL2120的寿命，而NQ却缩短了线虫CL2120的寿命(见图5F-H)。

实施例5

亚硫酸氢钠甲萘醌能够抑制细胞内β-淀粉样蛋白的聚集。

具体操作：将pCI-APP WT(APP是β-淀粉样蛋白的前体蛋白)及pCI-APP E693△质粒转染入HEK293细胞中后给予NQ及MSB，收集细胞提取蛋白后进行蛋白免疫印迹及免疫点杂交分析，使用82E1(识别N端游离的β-淀粉样蛋白1-16氨基酸序列)、11A1(识别β-淀粉样蛋白寡聚体)及6E10抗体进行检测。

实验结果如图6所示，蛋白免疫印迹分析表明HEK293细胞本底就有β-淀粉样蛋白的表达及聚集，转染APP质粒后β-淀粉样蛋白的含量及聚集程度明显升高显示APP质粒高表，NQ及MSB能够明显抑制胞内β-淀粉样蛋白的聚集(见图6A-B)；免疫点杂交分析表明，在不影响APP及β-淀粉样蛋白总量的情况下，NQ及MSB能够明显抑制β-淀粉样蛋白寡聚体(初级聚集产物)的形成(见图6C)。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的部分实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.亚硫酸氢钠甲萘醌在制备用于预防或/和治疗阿尔兹海默病药物中的应用。

2.一种用于治疗阿尔兹海默病的药物，含有亚硫酸氢钠甲萘醌。

3.一种用于治疗阿尔兹海默病的药物制剂，由作为活性成分的亚硫酸氢钠甲萘醌和药学上可接受的载体或可药用辅料组成。

4.亚硫酸氢钠甲萘醌在制备用于抑制人β-淀粉样蛋白1-42淀粉样聚集及其淀粉样聚集体毒性作用的药物中的应用。