CN108410969A - 肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用 - Google Patents

肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用，该方法使用内侧引物对，采用多重PCR法进行第一轮扩增，扩增产物序列分别为DNA转化的正链和负链，内侧引物5’端使用与外侧引物3’端互补的20~25个碱基，3’端使用根据目标靶点外侧的序列所设计的特异性引物序列，然后使用illumina Multiplexing PCR Primer 1.0为外侧引物F和使用3’端截断后的illumina RNA PCR Primer为外侧引物R进行第二轮扩增，从而构建文库。采用本方法可同时富集多个肿瘤相关基因，所需样本起始量超低，测序成本较低，通过双链扩增和二代测序分析，可剔除转化效率问题导致的假阳性，提高ctDNA检出率。

Description

肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤基因甲基化检测技术领域，特别涉及肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用。
背景技术
现有的肿瘤早期诊断包括了基于影像学的诊断、基于组织细胞层面的病理诊断和基于基因检测的肿瘤标志物诊断等手段。CT诊断的假阳性较高，成本也较高，对病人有一定的伤害；组织细胞诊断，取样较困难，病人较痛苦。
近年来一些研究发现，肿瘤的发生与某些基因的甲基化程度密切相关，且该甲基化在肺癌早期发生，并能特异性的反应该癌种的肿瘤发生情况。通过检测相关基因的甲基化程度，能够在肿瘤发生初期较早的检出肿瘤细胞的存在，从而为肿瘤的早期预防、治疗提供帮助。
现在市场上已有的甲基化检测方法有：甲基化特异性的PCR(MSP),亚硫酸氢盐测序法(BSP),高分辨率熔解曲线法(HRM),荧光探针PCR法，以及高通量测序法。其中除了高通量测序法，其余方法均只能间接检测甲基化的程度，无法直观的看到甲基化的具体情况，并且检测的信息较少，无法整体评估该基因的甲基化情况,且每次只能检测一个基因，无法准确而全面的反馈出病人的全面信息。此外，由于血液游离DNA(cfDNA)含量极低，血液中游离循环肿瘤DNA(ctDNA)的含量更低，约占cfDNA的0.1-1％，而普通甲基化全基因组高通量测序需要样本起始量(30-100ng)较大，测序深度较浅，成本高，不能用于早期肿瘤病人的甲基化检测。
发明内容
本发明的一个目的是提供肿瘤相关基因甲基化检测建库方法，采用该建库方法可同时富集多个肿瘤相关基因，所需要的样本起始量超低(10ng)，测序成本较低，且通过双链扩增和二代测序分析，可剔除转化效率问题导致的假阳性，提高ctDNA的检出率。
本发明的另一个目的是提供采用上述建库方法所构建的肿瘤相关基因甲基化检测文库在高通量测序中的应用。
本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：肿瘤相关基因甲基化检测建库方法，包括以下步骤：
S1：从受检样本中提取DNA；
S2：对S1提取的DNA进行亚硫酸盐化处理，得到转化后的DNA，由于转化后DNA序列不再互补，DNA呈现为解链状态；
S3：使用内侧引物对，采用多重PCR法对S2的转化后DNA进行第一轮扩增，使得扩增的产物序列分别为DNA转化的正链和负链；
S4：对S3获得的第一轮扩增产物进行纯化，去除非特异性扩增的小片段DNA和二聚体；
S5：使用外侧引物，对S4所得的纯化产物进行第二轮扩增；
S6：对S5获得的第二轮扩增产物进行纯化，即得肿瘤相关基因甲基化检测文库；
其中，S3中的内侧引物包括针对S2的甲基化的DNA的正、负链分别设计而成的两对引物，每对内侧引物的5’端使用与外侧引物的3’端互补的20～25个碱基，3’端使用根据目标靶点外侧的序列所设计的特异性引物序列；
S5中的外侧引物包括外侧引物F和外侧引物R，所述外侧引物F与illuminaMultiplexing PCR Primer 1.0引物相同，所述外侧引物R采用截断了3’端的illumina RNAPCR Primer引物。
为适用于illumina平台，本申请的内侧引物的5’端序列采用了与illumina的测序引物的3’端互补的20～25个碱基，但通用接头序列直接使用，会有一段互补序列，导致相应的二聚体，因此通过多种接头序列的排列组合测试，选择将现有的序列进行保留，并在3’端进行了截断，减少了相应的捕获序列长度，并利用illumina测序平台测序引物为混合体系的特点，能够在一次检测中检测不同系列的接头引物，从而实现添加不同来源的接头序列的文库能被检测；同时，本申请的内侧引物的3’端使用了根据目标靶点外侧的序列所设计的特异性引物序列，在设计时保留了甲基化位点的兼并性，同时利用3’端互补的特点，剔除低转化率的DNA造成的假阳性。
针对DNA转化(甲基化)后序列产生较大变化，使得序列不在互补的特点，本申请针对甲基化DNA的正、负链分别设计内侧引物，使得第一轮扩增的产物不具有互补性从而形成2个独立的片段，而该2个片段可以通过计算机程序与原始模板进行比对，定位在同一个区域，通过正链和负链的相互校准，可以确定甲基化状态的真实性，并对由于SNP导致的结果误读，通过另一条链进行纠错。例如，某个位点的C由于基因多态性变成了T，而无法与非甲基化的C被转化后测序形成的T信号进行区分，此时，可通过另一条链的互补序列测序产生的A信号，可以与非甲基化的C的互补碱基G产生区分，从而判断该位置是由于基因多态性而不是由低甲基化状态导致的变化，从而可排除基因突变对甲基化判断的影响。
进一步地，S3中，将所有内侧引物放入一个引物池中，在同一个反应体系内进行第一轮扩增，同时完成多个靶点基因的扩增，从而节约时间和成本。除了引物，所述反应体系中包括根据引物的特点所选择的各种酶，本领域技术人员可根据实际需要并结合常规技术手段进行实验以确定，此处不再赘述。
进一步地：所有内侧引物通过设计，使得其tm值差异范围控制在±1℃。
通过上述技术方案，在进行内侧引物设计时，对其tm值进行均一化控制，从而可防止多重扩增的产物扩增效率存在差异。
再进一步地，S3中进行第一轮扩增过程中，先富集原始模板，循环数控制5～10轮，其退火温度与特异性的引物退火温度一致；然后再进行后续富集，使得退火温度与内侧引物全长的tm值一致；退火时间均控制为1-2分钟。
通过采用上述方案，在进行原始模板富集时，使得退火温度与特异性的引物退火温度一致，并相对于现有扩增过程(退火时间一般为30秒)增加了退火时间，可最大程度的让模板在前5～10轮反应中与引物进行结合，使得模板能与样本充分反应；再在后续富集步骤中，使得退火温度与内侧引物全长的tm值一致，该退火温度在本申请中一般高于富集原始模板时的退火温度，从而可提高反应特异性，使得不同引物对有相对一致的扩增效率，减少扩增的不均一性，从而反映模板的真实信息。
进一步地，所述受检样本为受检者的活检组织或其灌洗液。
此外，本发明提供了采用上述建库方法所构建的肿瘤相关基因甲基化检测文库在高通量测序中的应用。
进一步地，所述高通量测序为illumina平台测序。
综上所述，本发明具有以下有益效果：
1、本申请通过多重PCR技术和巢式PCR技术相结合，实现适用于二代测序技术的特异性甲基化检测文库的构建，通过相应的二代测序平台，特异性的对肿瘤相关位点甲基化的测序，除了可以定性的检测样本是否出现甲基化，同时可以对甲基化的程度进行定量检测，并可以查看具体的甲基化位点信息。
2、采用本申请的方法，所需要的检测样本起始量超低，测序成本较低，可检出极其微量的甲基化DNA，从而使得早期筛查成为可能。
3、采用本申请的方法，可排除非CpG区域甲基化对检测的影响，剔除低转化片段的干扰，提高检出率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例
本实施例采用肺癌患者的外周血为受检样本，说明本发明提供的肿瘤相关基因甲基化检测建库方法。
建库方法包括以下步骤：
S1：根据qiagen公司提供的游离血浆DNA抽提试剂盒的使用说明书，使用该试剂盒从肺癌患者的外周血中提取血浆游离DNA。
S2：使用Zymo Research公司提供的甲基化转化试剂盒EZ DNA methylation-goldkit对S1步骤提取的血浆游离DNA进行甲基化处理，使DNA呈解链状态。
S3：使用内侧引物对，采用多重PCR法对S2步骤的亚硫酸盐处理的解链状态的DNA进行第一轮扩增，使得扩增的产物序列分别为DNA转化的正链和负链。
此处针对DNA转化的正链和负链，所使用的内侧引物为分别为下文所述外侧引物3’端互补序列与特异性引物序列的拼接序列，并将特异性引物序列的退火温度控制在55℃。
以SHOX2基因为例，其中针对正链的上游引物、下游引物序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；针对正链的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
所有内侧引物具有经均一化设计处理的tm值，控制为68℃。
均一化设计处理的实现方式具体如下：通过引物序列的长度，碱基构成的调整，使得tm值趋向于68℃。
在该步骤中，将上述两对内侧引物对均放入一个引物池中，在同一个反应体系内，进行第一轮扩增，具体反应体系如表1所示：
表1
成分 体积
多重扩增mix 10μl
引物池 1μl
DNA 10ng
补水 至20μl
多重扩增mix主要包括以下试剂：KAPA高保真热启动酶(KAPA HiFi Hot StartUracil)。
反应过程如下：
第一阶段
95℃预变性5分钟；
第二阶段(10个循环)
98℃变性20秒；
50℃退火2分钟；
72℃延伸2分钟；
第三阶段(15～20个循环)
95℃变性20秒；
63℃退火2分钟；
72℃延伸2分钟；
第四阶段
72℃下延伸5分钟
第五阶段
4℃下，保存。
显然，所得到的第一轮扩增产物为多个扩增子在不同区域内的扩增产物的混合物，且每个区域分别表现两条链的状态，以便在测序和分析时用于相互矫正，确定甲基化状态的真实性。
S4：对S3步骤获得的第一轮扩增产物纯化，去除非特异性扩增的小片段DNA和引物二聚体，残留的单链引物。
采用磁珠纯化法进行纯化。采用Beckman公司的磁珠试剂纯化第一轮扩增产物。将磁珠试剂中的磁珠摇匀悬浮，按照第一轮扩增产物和磁珠悬浮液的体积比为1:1比例混合，室温孵育5分钟，而后放到磁力架上，然后按照试剂说明书操作。
S5：使用外侧引物，对S4步骤所得的纯化产物进行第二轮扩增。
本实施例中的外侧引物包括外侧引物F和外侧引物R。
其中，外侧引物F与illumina Multiplexing PCR Primer 1.0引物相同，序列如SEQ ID NO.5所示；外侧引物R与illumina RNA PCR Primer引物类似，并截断了3’端，序列如SEQ ID NO.6所示。
使用Multiplexing PCR Primer1.0和3’截短后的illumina RNA PCR Primer，可以有效提高扩增效率，减少二聚体和非特异扩增。
具体反应体系如表2所示：
表2
成分 体积
多重扩增mix 10μl
外侧引物F 1μl
外侧引物R 1μl
第一轮扩增产物的纯化回收产物 8μl
多重扩增mix主要包括以下试剂：KAPA高保真热启动酶(KAPA HiFi Hot StartUracil)。
PCR反应程序如下：
反应过程如下：
第一阶段
95℃预变性5分钟；
第二阶段(5～10个循环)
98℃变性20秒；
60℃退火2分钟；
72℃延伸2分钟；
第三阶段(1个循环)
72℃下延伸5分钟
第四阶段
4℃下，保存。
S6：对S5获得的第二轮扩增产物进行纯化，即得肿瘤相关基因甲基化检测文库。
本步骤中仍采用采用Beckman公司的磁珠试剂对第二轮扩增产物进行纯化，控制第二轮扩增产物和磁珠悬浮液混合体积比为1:0.7。
文库高通量测序
通过illumina测序平台对上述实施例构建的文库进行高通量测序，通过生物学手段分析数据，评估文库reads mapping率。评估结果见表3。
表3
序列类别 百分比(％)
非基因组序列 0.12
多次比对序列 97.15
比对不上序列 2.73
从表3可以看出，reads mapping率高于95％,文库质量合格。
同时，特异性的对目的区域进行检测，通过深度测序，获得低丰度的甲基化片段信息。表4显示了对SHOX2基因外显子chr3的基因测序结果。
表4
通过检测每一个点的转化率，我们可以看到每个样本的CpG点和CH(非CG)点的转化率，可以评估本次转化的整体效率及各区域的转化率均一性，并评估每个点的转化率，判断其肿瘤状态。通过双链校正，可以确定157821420位点为亚洲人群的常见多态性位点，CpG应该被加入分析；157821382位点在阴性样本中出现了一个少见的杂合突变，导致该序列整体甲基化统计偏高。通过双链扩增和二代测序，该影响因素可以被纠正及消除。
如表5所示，通过测序，可以看到每一条reads的甲基化状态，以阴性样本为例，通过计算其中的CpG点的甲基化个数，可以直观的观察到甲基化在每一条reads上的分布情况，因此，当样本中有痕量的超甲基化序列时，可以直观的被机器读取，并通过调取该reads的序列查看CH转化率情况，判断该reads是否可信。
表5
从以上的描述中可以看出，与现有甲基化二代测序方法(起始模板含量1μg)相比，由于本方法起始模板含量(10ng)较低，可以检测血液低含量的ctDNA等样本，并能从数据中找到极其微量的甲基化DNA，从而使得早期筛查成为可能；同时由于该方法通过二代测序，可以直观地排除点突变、基因多态性、低转化率造成的干扰。
本发明具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
序列表
<110> 上海渥恩生物科技有限公司
<120> 肿瘤相关基因甲基化检测建库方法及应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> 扩增引物
<400> 1
tacacgacgc tcttccgatc tggttttttg gatagttagg taatt 45
<210> 2
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(49)
<223> 扩增引物
<400> 2
ggagttcctt ggcacccgag aattccacta ccttctaacc cgacttaaa 49
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(45)
<223> 扩增引物
<400> 3
tacacgacgc tcttccgatc tgagtttttt gggtagttaa tatgg 45
<210> 4
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(52)
<223> 扩增引物
<400> 4
ggagttcctt ggcacccgag aattccaaca taaaatcccc taaacaacca aa 52
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(58)
<223> 扩增引物
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(59)
<223> 扩增引物
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatagtcat cggtgactgg agttccttgg cacccgaga 59

Claims (7)

1.肿瘤相关基因甲基化检测建库方法，包括以下步骤：
S1：从受检样本中提取DNA；
S2：对S1提取的DNA进行亚硫酸盐化处理，得到转化后的DNA，由于转化后DNA序列不再互补，DNA呈现为解链状态；
S3：使用内侧引物对，采用多重PCR法对S2的转化后DNA进行第一轮扩增，使得扩增的产物序列分别为DNA转化的正链和负链；
S4：对S3获得的第一轮扩增产物进行纯化，去除非特异性扩增的小片段DNA和二聚体；
S5：使用外侧引物，对S4所得的纯化产物进行第二轮扩增；
S6：对S5获得的第二轮扩增产物进行纯化，即得肿瘤相关基因甲基化检测文库；
其中，S3中的内侧引物包括针对S2的甲基化的DNA的正、负链分别设计而成的两对引物，每对内侧引物的5’端使用与外侧引物的3’端互补的20～25个碱基，3’端使用根据目标靶点外侧的序列所设计的特异性引物序列；
S5中的外侧引物包括外侧引物F和外侧引物R，所述外侧引物F与illuminaMultiplexing PCR Primer 1.0引物相同，所述外侧引物R采用截断了3’端的illumina RNAPCR Primer引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：S3中，将所有内侧引物放入一个引物池中，在同一个反应体系内进行第一轮扩增，同时完成多个靶点基因的扩增。
3.根据权利要求2所述的建库方法，其特征是：所有内侧引物通过设计，使得其tm值差异范围控制在±1℃。
4.根据权利要求1所述的建库方法，其特征是：S3中进行第一轮扩增过程中，先富集原始模板，循环数控制5～10轮，其退火温度与特异性引物的退火温度一致；然后进行后续富集，使得退火温度与内侧引物全长的tm值一致；退火时间均控制为1-2分钟。
5.根据权利要求1所述的建库方法，其特征是：所述受检样本为受检者的活检组织或其灌洗液。
6.一种如权利要求1-5任一所述的建库方法所构建的肿瘤相关基因甲基化检测文库在高通量测序中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是：所述高通量测序为illumina平台测序。
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