CN108398303A - 一种冰冻组织芯片制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种冰冻组织芯片制备方法，包括芯片微阵列设计、取样、采集组织芯、切片、贴片、干燥、贮存步骤，本发明应用使用自行研制的受体模具所制造的冰冻组织芯块成功率高，其点与点之间均匀统一，而且操作简便，技术可靠，费用低廉，经济实用；所取得的冰冻组织芯片，具有体积小，容量大，定位准确，节省时间，节约成本特点，冰冻组织芯片中信息含量丰富，通过一次试验可以获得大量研究结果，可以简单、经济、规范地进行蛋白及基因原位分析，在形态学观察和蛋白表达方面的研究方面具有良好的应用前景和价值。

Description

一种冰冻组织芯片制备方法
技术领域
本发明涉及基因研究技术领域，尤其是涉及一种冰冻组织芯片制备方法。
背景技术
组织芯片也称为组织微阵列(Tissue Microarray)，它是将许多不同组织以规则阵列排布于同一载玻片上而制成的组织切片，主要用于研究同一种基因或蛋白质分子在不同细胞或组织中表达的情况，是一种高通量，大样本以及快速分子水平的分析工具。
冰冻组织芯片与传统的石蜡包埋的组织芯片相比，可以克服石蜡包埋的组织芯片的多种缺陷，石蜡包埋的组织芯片处理时，要经过组织固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的石蜡切片的步骤，可能会对抗原的性质造成影响，冰冻组织芯片能够较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，现有技术对于冰冻组织芯片研究中，对于组织芯和OCT融合的问题、温度、时间控制的问题、操作过程中组织芯移位变形的问题、组织样本正确取样问题以及如何防止脱片的问题均鲜有技术公开。
发明内容
针对上述背景技术所阐述的问题，本发明所要解决的技术问题是提供一种冰冻组织芯片制备方法，应用自制模具进行冰冻组织芯片的研制，可以简单、经济、规范地进行蛋白及基因原位分析，适用于形态学观察和蛋白表达方面的研究。
冰冻组织芯片是通过组织细针打孔的方法，从众多的组织块(即供体块)中采集到数十至上百的圆柱形小组织(即组织芯)，并将其整齐排列而制成冰冻组织芯片块，然后对冰冻组织芯片块进行切片，再将切片转移到载玻片上制成组织芯片。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种冰冻组织芯片制备方法，包括如下步骤：
步骤一、芯片微阵列设计，预先计划检测多少样本，然后相应地进行设计；
步骤二、取样，在供体块中采集组织芯，先将供体块从-70℃冰箱拿出，转移到-20℃温度中，放置10-15分钟后再取样，取样时，采用常规HE染色，形成HE切片，通过显微镜检查，避开组织出血及坏死部位，对样本中有代表性的部位进行选择，标记并采样；
步骤三、采集组织芯，根据相应的标记位置，采用打孔仪打孔采集组织芯，受体模具预先放在-70℃温度里预冷15-20分钟，将组织芯转移到受体模具中，并按芯片微阵列设计表的位置将组织芯排列在模具中，当组织芯排列全部完成后，将OCT化合物迅速加入已排好组织芯的模具中，OCT的量应已全部覆盖组织芯为准，当OCT的颜色由无色变为白色后，继续在-70℃温度中停留10-20分钟，直至组织芯与OCT化合物完全融合制成冰冻组织芯片块；
步骤四、切片，将已冻结的组织芯片块从-70℃温度中取出，室温下放置2分钟后，即可取下受体模具，将冰冻组织芯片块在-20℃中放置5-10分钟，然后夹在切片机上进行修正，以修到全部组织完整为止，切片刀角度为2-4度，切片温度使用恒冷箱切片机将温度设定为零下15-18度；
步骤五、贴片，将切片贴在经正电荷处理的载玻片上，使用固定剂固定5分钟；
步骤六、干燥，在通风厨里干燥2-3小时，即可对切片进行常规HE染色或免疫组化及原位杂交染色；
步骤七、贮存，在-70℃冰箱保存。
上述技术方案中，所述步骤四切片时，应当避免切片时出现皱褶，卷边及裂痕等现象。
上述技术方案中，所述步骤五用载玻片贴附组织切片时，不能上下移动。
上述技术方案中，所述固定剂为丙酮，预先将50ml丙酮放置在-20℃冰箱中，冷却30分钟。
上述技术方案中，所述受体模具底座设置50个组织芯存放孔，每个组织芯存放孔直经2mm，孔间距2mm。
本发明应用使用自行研制的受体模具所制造的冰冻组织芯块成功率高，其点与点之间均匀统一，而且操作简便，技术可靠，费用低廉，经济实用；所取得的冰冻组织芯片，具有体积小，容量大，定位准确，节省时间，节约成本特点，冰冻组织芯片中信息含量丰富，通过一次试验可以获得大量研究结果，可以简单、经济、规范地进行蛋白及基因原位分析，在形态学观察和蛋白表达方面的研究方面具有良好的应用前景和价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是受体模具结构示意图。
其中：1是受体模具；2是组织芯存放孔。
具体实施方式
下面将结合本发明的附图和实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
作为实施例所示的一种冰冻组织芯片制备方法，实施例以肠癌组织芯片的制作为例，其制作步骤如下：
步骤一、芯片微阵列设计，预先计划检测多少样本，然后相应地进行设计；
实施例中，对于芯片微阵列设计为：以5×8阵列设计，每例芯片选择肠癌点和肠癌点旁各设置一点，5×8阵列共40点，即原发癌20点，癌旁正常组织20点，组织点直径2mm，各点间距2mm，设计好后通过电脑制表并将设计表打印；
步骤二、取样，在供体块中采集组织芯，先将供体块从-70℃冰箱拿出，转移到-20℃温度中，放置10-15分钟后再取样，取样时，按照设计要求为5×8阵列共40点，即原发癌20点，癌旁正常组织20点，组织点直径2mm，各点间距2mm，采用常规HE染色，形成HE切片，通过显微镜检查，避开组织出血及坏死部位，经病理医生阅片后对病变部位进行选择和标记；
步骤三、采集组织芯，根据相应的标记位置，选择直经2mm的打孔仪打孔采集组织芯，受体模具预先放在-70℃温度里预冷15-20分钟，将组织芯转移到受体模具中，并按芯片微阵列设计表的位置将组织芯排列在模具中，当组织芯排列全部完成后，将OCT化合物迅速加入已排好组织芯的模具中，OCT的量应已全部覆盖组织芯为准，当OCT的颜色由无色变为白色后，继续在-70℃温度中停留10-20分钟，直至组织芯与OCT化合物完全融合制成冰冻组织芯片块；OCT全称为Optimal Cutting Temperaturem，OCT化合物：OCT Compound，OCT化合物也称为OCT包埋剂，或OCT冰冻切片包埋剂，是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其作用是在冰冻切片时支撑组织，减少邹折及碎裂，利用OCT化合物预先浸润组织，然后再进行冰冻切片，有利于改善切片质量。
步骤四、切片，将已冻结的组织芯片块从-70℃温度中取出，室温下放置2分钟后，即可取下受体模具，将冰冻组织芯片块在-20℃中放置5-10分钟，然后夹在切片机上进行修正，以修到全部组织完整为止，切片刀角度为2-4度，切片温度使用恒冷箱切片机将温度设定为零下15-18度；
步骤五、贴片，将切片贴在经正电荷处理的载玻片上，使用丙酮固定剂固定5分钟，固定时预先将50ml丙酮放置在-20℃冰箱中，冷却30分钟后，将切片放在冷丙酮中固定5分钟。
步骤六、干燥，在通风厨里干燥2-3小时，即可对切片进行常规HE染色或免疫组化及原位杂交染色；
步骤七、贮存，在-70℃冰箱保存。
根据图1所示，受体模具尺寸：4cm×2.2cm×1.5cm，受体模具底座设置50个组织芯存放孔，每个组织芯存放孔直经2mm，孔间距2mm。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种冰冻组织芯片制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一、芯片微阵列设计，预先计划检测多少样本，然后相应地进行设计；
步骤二、取样，在供体块中采集组织芯，先将供体块从-70℃冰箱拿出，转移到-20℃温度中，放置10-15分钟后再取样，取样时，采用常规HE染色，形成HE切片，通过显微镜检查，避开组织出血及坏死部位，对样本中有代表性的部位进行选择，标记并采样；
步骤三、采集组织芯，根据相应的标记位置，采用打孔仪打孔采集组织芯，受体模具预先放在-70℃温度里预冷15-20分钟，将组织芯转移到受体模具中，并按芯片微阵列设计表的位置将组织芯排列在模具中，当组织芯排列全部完成后，将OCT化合物迅速加入已排好组织芯的模具中，OCT的量应已全部覆盖组织芯为准，当OCT的颜色由无色变为白色后，继续在-70℃温度中停留10-20分钟，直至组织芯与OCT化合物完全融合制成冰冻组织芯片块；
步骤四、切片，将已冻结的组织芯片块从-70℃温度中取出，室温下放置2分钟后，即可取下受体模具，将冰冻组织芯片块在-20℃中放置5-10分钟，然后夹在切片机上进行修正，以修到全部组织完整为止，切片刀角度为2-4度，切片温度使用恒冷箱切片机将温度设定为零下15-18度；
步骤五、贴片，将切片贴在经正电荷处理的载玻片上，使用固定剂固定5分钟；
步骤六、干燥，在通风厨里干燥2-3小时，即可对切片进行常规HE染色或免疫组化及原位杂交染色；
步骤七、贮存，在-70℃冰箱保存。
2.根据权利要求1所述的一种冰冻组织芯片制备方法，其特征在于：所述步骤四切片时，应当避免切片时出现皱褶，卷边及裂痕等现象。
3.根据权利要求1或2所述的一种冰冻组织芯片制备方法，其特征在于：所述步骤五用载玻片贴附组织切片时，不能上下移动。
4.根据权利要求3所述的一种冰冻组织芯片制备方法，其特征在于：所述固定剂为丙酮，预先将50ml丙酮放置在-20℃冰箱中，冷却30分钟。
5.根据权利要求4所述的一种冰冻组织芯片制备方法，其特征在于：所述受体模具底座设置50个组织芯存放孔，每个组织芯存放孔直经2mm，孔间距2mm。
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