CN108396020A

CN108396020A - USP2a的D357A或S207/225A突变体在抑制肿瘤转移中的应用

Info

Publication number: CN108396020A
Application number: CN201810107046.1A
Authority: CN
Inventors: 钟波; 赵银; 李康; 林丹丹
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2018-08-14
Anticipated expiration: 2038-02-02
Also published as: CN108396020B

Abstract

本发明公开了USP2a的D357A或S207/225A突变体在抑制肿瘤转移中的应用，属于生物技术和医学领域。本发明发现了USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白，抑制TGFβ介导的上皮间质转化(EMT)过程，抑制肿瘤转移。本发明提供USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白在如下a)‑f)至少一种中的应用：a)制备抑制肿瘤转移产品；b)制备抑制肿瘤细胞迁移产品；c)制备抑制肿瘤细胞侵袭能力产品；d)制备抑制于肿瘤转移相关的基因表达的产品；e)制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；f)制备抑制肿瘤转移的模型。

Description

USP2a的D357A或S207/225A突变体在抑制肿瘤转移中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及USP2a的D357A或S207/225A突变体在抑制肿瘤转移中的应用。

背景技术

肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位，经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的过程。统计表明，超过90％的肿瘤患者死亡源于肿瘤转移，60％以上的肿瘤患者于初次就诊时已发现有转移(Hanahan and Weinberg,2011)，恶性肿瘤的转移是肿瘤治疗失败的主要原因。

基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的、可遗传的变异现象。根据碱基变化一般分为两类，点突变和移码突变。基因突变可以发生在发育的任何时期，通常发生在DNA复制时期，在自然界各物种中普遍存在。基因突变和脱氧核糖核酸的复制、DNA损伤修复、癌变和衰老都有关系。从一定程度上来说，肿瘤就是因为相关基因突变产生的，基因突变会使相关蛋白质的结构或者功能发生变化。研究发现，基因编码区的突变与恶性肿瘤有很大关系，相关基因的点突变、小片段缺失或插入，都会引起密码子的同义、错义、终止和移码的突变现象，导致基因表达的蛋白质由于序列的改变使其相关功能的丧失，最终发生为恶性肿瘤。例如抑癌基因TP53的纯合性缺失和点突变在很多癌症中被发现，超过50％的肿瘤有TP53基因的突变，尤其是肺癌、结肠癌、乳腺癌和胰腺癌中突变更为多见。基因突变具有少利多害性，一般基因突变会产生不利的影响，致使生物被淘汰或是死亡，例如镰刀型细胞贫血症，就是因为控制血红蛋白分子合成的基因发生突变导致合成的血红蛋白分子结构的改变，进一步导致红细胞由正常的圆饼状变成镰刀型，不能顺利通过毛细血管而聚集在一起破裂，最终造成贫血。但也有极少数会使物种增强适应性，对人类也是有用的，如将基因突变用于诱变育种，以色列的科学家将辣椒种子送上太空，种子在失重条件下发生基因突变，从而培育出优良品种“彩色辣椒”。

EMT是指在特定的生理和病理情况下，具有极性的上皮细胞向在细胞基质间自由移动的间质细胞转化的现象。目前EMT被认为是启动肿瘤转移反应的关键步骤，可参与多种肿瘤(前列腺癌、食管癌及胃癌等)的侵袭、转移过程，而TGFβ可以诱导EMT过程的发生。

TGFβ信号转导通路根据配体分子激活的不同的下游特异性通路可以分为TGFβ/Activin/Nodal和BMP/GDF/MIS两个亚家族通路。TGFβ结合到其特异性受体TGFBR2和TGFBR1后，激活了TGFBR1的丝氨酸/苏氨酸激酶活性，再进一步磷酸化受体调节的SMAD2/3(R-SMADs)，(Moses et al.,2016)。磷酸化的R-SMADs脱离受体复合体，与SMAD4结合形成三聚转录复合体，进一步迁移入核并调控下游相关基因的表达(Feng and Derynck,2005；Schmierer and Hill,2007)。TGFβ信号通路通过调节细胞的生长、增殖、分化、迁移和凋亡等过程，在组织与器官的发生和形成(胚胎发育、骨骼等器官形成)、机体的免疫反应等生物过程发挥重要的功能。

去泛素化酶家族为半胱氨酸蛋白酶，是一种重要的特异性去泛素化水解酶。已有很多去泛素化酶被报道参与TGFβ信号通路的调控，例如USP4和USP15可以去除TGFBR1的泛素链从而调控TGFBR1的稳定性(Eichhorn et al.,2012；Zhang et al.,2012)。去泛素化酶USP2a曾被报道调控细胞周期蛋白CyclinD1和CyclinA1(Kim et al.,2012；Shan et al.,2009；Shi et al.,2011)的稳定性从而调控细胞周期，以及通过增强MDM2的稳定性和抑癌基因p53的降解来抑制细胞凋亡(Gewies and Grimm,2003；Stevenson et al.,2007；Wanget al.,2014)；USP2a还参与了脂肪酸的代谢过程以及神经胶质母细胞瘤的调控(Benassiet al.,2012；Graner et al.,2004)；据报道USP2a的第357位天冬氨酸是USP2a的去泛素化酶活位点，突变了该位点将使USP2a失去去泛素化酶活性(Xiao H et al.,2012)；但目前尚未见报道USP2a能通过调控TGFβ信号通路来调控肿瘤转移，为抑制肿瘤细胞转移，提高化疗或预后效果，寻找合适的抑制肿瘤转移的关键靶点就显得至关重要。

发明内容

本发明的首要目的是提供USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白。

所述USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白的氨基酸序列为如下1)或2)：

1)将USP2a蛋白的氨基酸序列第357位天冬氨酸或者第207位和第225位丝氨酸突变为丙氨酸得到的序列；

2)将1)所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白。

所述USP2a蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，其编码序列如SEQ ID No.2所示。

本发明另一目的是提供USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白的新用途。

本发明提供USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白在如下a)-f)至少一种中的应用：

a)制备抑制肿瘤转移产品；

b)制备抑制肿瘤细胞迁移产品；

c)制备抑制肿瘤细胞侵袭能力产品；

d)制备抑制于肿瘤转移相关的基因表达的产品；

e)制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；

f)制备抑制肿瘤转移的模型。

本发明再一目的是提供一种包含USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白的产品。

本发明提供包含USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白的产品为如下A-F中的任一种：

A.抑制肿瘤转移产品；

B.抑制肿瘤细胞迁移产品；

C.抑制肿瘤细胞侵袭能力产品；

D.抑制于肿瘤转移相关的基因表达的产品；

E.用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；

F.抑制肿瘤转移的模型。

上述应用或产品中，所述肿瘤可包括但不限于：肝癌、肺癌、鳞癌、乳腺癌、子宫颈癌、腺癌，优选肺癌。

上述应用或产品中，所述肿瘤细胞可包括但不限于：肝癌细胞、肺癌细胞、鳞癌细胞、乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、腺癌细胞，优选肝癌细胞Hep3B。

上述应用或产品中，所述肿瘤转移相关的基因为SNAI1、VIM等与EMT过程相关的基因。

上述应用或产品中，所述产品选自：药物、保健品、试剂盒、医疗设备、或它们的组合。可选的还包含：药学上、免疫性上或保健品学上可接受的载体、辅料、容器、包装物、给予装置，指示给予所含USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白以预防和/或治疗对象中肿瘤转移的指示物(如说明书或使用手册等)。

上述应用或产品中，所述模型为动物模型，所述动物具体为小鼠。

上述应用或产品中，本发明的USP2a的D357A或S207/225A突变体蛋白或其产品，可与本领域中已知用于预防和/或治疗对象中肿瘤转移的产品或疗法联用。所述联用包括：同时、依序、分开或单独给予本发明的物质或产品以及其他已知产品或疗法。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

本发明发现过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体可以抑制TGFβ信号通路的转录因子SMAD2的磷酸化以及TGFβ介导的上皮间质转化(EMT)过程的下游基因的表达，包括SNAI1和VIM等基因，从而有效地抑制肿瘤细胞的迁移，减少肿瘤细胞在小鼠体内迁移到肺部形成的克隆数目。将该两个突变体分别转染恶性肿瘤细胞(Hep3B)，再将该转染后的细胞，尾静脉注射裸鼠，可制备肿瘤转移的小鼠模型。该模型可应用于筛选预防和/或治疗肿瘤转移的药物，以及用于研究原位肿瘤发展为转移肿瘤机制的工具。

附图说明

图1为构建表达USP2a或其突变体的质粒所用的phage-puro-6tag载体的图谱。

图2为USP2a的D357A或S207/225A突变体调控TGFβ信号通路的实验结果图。其中，A：过表达USP2a的D357A突变体抑制SMAD2/3/4荧光素酶报告基因的转录；B：过表达USP2a的D357A突变体抑制TGFβ信号通路下游基因p15、p21的转录；C：在HeLa(左)或缺失USP2a的HCT116(USP2a-/-HCT116)细胞(右)中过表达USP2a的D357A突变体能够抑制SMAD2的磷酸化；D：过表达USP2a的S207/225A突变体抑制SMAD2/3/4荧光素酶报告基因的转录；E：过表达USP2a的S207/225A突变体抑制TGFβ信号通路下游基因p15、p21的转录；F：在HeLa(左)或缺失USP2a的HCT116(USP2a-/-HCT116)细胞(右)中过表达USP2a的S207/225A突变体能够抑制SMAD2的磷酸化。

图3为过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体调控EMT过程的实验结果图。其中，A：过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体能够抑制TGFβ介导的EMT信号通路的下游基因SNAI1、VIM的转录；B：过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体能够抑制TGFβ介导的EMT信号通路的下游基因SNAI1、VIM的蛋白表达水平。

图4为敲除USP2a对裸鼠肺部成瘤和存活率影响的结果图。其中，A：敲除USP2a能减少肿瘤在肺部的转移；B：敲除USP2a不影响肿瘤在肺部的形成大小；C：敲除USP2a可以显著提高裸鼠的存活率。

图5为敲除USP2a后再回复USP2a的D357A或S207/225A突变体对裸鼠肺部成瘤和生存率影响的结果图。其中，A：在USP2a缺失的Hep3B细胞系中回复表达USP2a的D357A或S207/225A突变体能显著减少肿瘤在肺部的转移；B：在USP2a缺失的Hep3B细胞系中回复表达USP2a的D357A或S207/225A突变体不影响肿瘤在肺部的形成大小；C：在USP2a缺失的Hep3B细胞系中回复表达USP2a的D357A或S207/225A突变体可以显著提高裸鼠的存活率。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明发现了USP2a的D357A或S207/225A突变体在肿瘤转移方面的功能机制，该机制是基于USP2a的D357A或S207/225A突变体与TGFβ信号转导通路的相互作用的新发现所做出的。具体地，本发明研究表明过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体可以负调控TGFβ信号通路的底物分子SMAD2的磷酸化以及TGFβ介导的上皮间质转化(EMT)过程，从而抑制肿瘤细胞的迁移。

进一步地，本发明研究了在敲除USP2a的Hep3B细胞系里回复表达USP2a的D357A或S207/225A突变体的情况下肿瘤细胞的迁移能力。本发明通过裸鼠成瘤实验，证明了在敲除了USP2a的Hep3B细胞系里回复表达USP2a的D357A或S207/225A突变体可以显著减少裸鼠肺部肿瘤的形成个数，并且显著提高了裸鼠的存活率。

下述实施例中所用实验方法具体如下：

1)表达USP2a或其突变体的质粒的构建

以phage-puro-6tag载体作为骨架载体构建表达USP2a或其突变体的质粒，phage-puro-6tag载体由pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen载体(BioVector)改造得到，其图谱见图1。表达USP2a的质粒phage-6tag-USP2a根据《分子克隆实验指南》提供的克隆方法构建；表达USP2a突变体的质粒(phage-6tag-USP2a(D357A)、phage-6tag-USP2a(S207A)、phage-6tag-USP2a(S225A)、phage-6tag-USP2a(S207/225A))通过定点突变方法构建；基因片段插入phage-puro-6tag载体的位点为NotI/XhoI。

其它载体pSPAX2、pMD2.G、pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)、SBE2-luc(smad2/3/4荧光素酶报告基因)、pGL2-Empty control-SV40-Luc购自addgene。

2)荧光素酶报告基因检测

将0.1μg空载体phage-puro-6tag(Vec)、phage-puro-6tag-USP2a、phage-puro-6tag-USP2a(D357A)、phage-puro-6tag-USP2a(S207A)、phage-puro-6tag-USP2a(S225A)或phage-puro-6tag-USP2a(S207/225A)与0.1μg SBE2-luc和0.01μg pGL2-Empty control-SV40-Luc利用磷酸钙转染方法共转染到HEK293细胞(5×10⁴个中，转染24小时后，不处理或TGFβ(15ng/mL)处理8小时，裂解细胞，利用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega)检测smad2/3/4荧光素酶活性。

3)慢病毒感染构建稳定细胞系

在HEK293细胞中使用磷酸钙转染方法共转染phage-puro-6tag(Vec)、phage-puro-6tag-USP2a、phage-puro-6tag-USP2a(D357A)或phage-puro-6tag-USP2a(S207/225A)和慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2G，转染8小时后，更换培养基；48小时后，收集含有病毒液的上清，用0.22μm的滤头过滤后，感染HeLa、Hep3B或缺失USP2a的HCT116(USP2a^-/-HCT116)(Li Y et al.,2012)细胞，24小时后加入嘌呤霉素(Puromycin，Sigma)进行筛选，从而构建稳定表达USP2a或其突变体的细胞系。

4)CRISPR-Cas9细胞基因敲除

A、构建CRISPR载体

(1)在E-CRISP网站上设计特异性靶向USP2a的guide-RNA序列，

USP2a KO#2正向引物：5’-CACCGCCGATTCTGTGTAGCGCTTCAGG-3’，

USP2a KO#2反向引物：5’-AAACCCTGAAGCGCTACACAGAATCGGC-3’；

USP2a KO#3正向引物：5’-CACCGCGATTCTGTGTAGCGCTTCAGGG-3’，

USP2a KO#3反向引物：5’-AAACCCCTGAAGCGCTACACAGAATCGC-3’；

(2)将合成引物用无菌水稀释到终浓度为3μg/μL，然后各取正向和反向引物1μL加到48μL退火缓冲液中，退火成双链；

(3)将pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)载体，用BbsI限制性内切酶线性化载体，回收线性化的载体；

(4)将退火成双链的引物连接到PX459载体上；

(5)测序，挑选正确载体扩增质粒备用。

B、转染Hep3B细胞

(1)第一天，利用lipofectamine 2000(Thermo Fisher Scientific)将PX459载体转染Hep3B细胞，转染24小时后，加入Puromycin进行筛选；

(2)第三天，将细胞消化制备成单细胞悬液，计数，取200个细胞加入到80mL含Puromycin的培养基中，吹打混匀后，分到4个96孔细胞培养板，置于37度二氧化碳培养箱；

(3)第十四天后，观察到明显单克隆后，挑取单克隆；

(4)检测USP2a蛋白水平，确定USP2a敲除细胞。

5)实时荧光定量PCR

收集细胞加入Trizol后，提取细胞总RNA，通过2×RT-PCR mix(Biotool)将RNA反转成cDNA，将cDNA作为模板，使用2×SYBR Super mix(Biotool)进行实时荧光定量PCR。所用到的qPCR引物如下表：

基因名称	正向引物	反向引物
			β-Actin	CACCATTGGCAATGAGCGGTTC	AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT
p15	ACGGAGTCAACCGTTTCGGGAG	GGTCGGGTGAGAGTGGCAGG
			p21	AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG	TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG
SNAI2	TGCCCTCAAGATGCACATCCGA	GGGACAGGAGAAGGGCTTCTC
			VIM	AGGCAAAGCAGGAGTCCACTGA	ATCTGGCGTTCCAGGGACTCAT

6)免疫印迹

(1)收集细胞，加入NP-40裂解液(150mM NaCl，1mM EDTA，1％NP-40)，置于冰上裂解5-10分钟；

(2)12000rpm、4度离心5分钟；

(3)取上清加入上样缓冲液，95度干浴锅煮10分钟；

(4)12000rpm离心5分钟，即可将样本用于SDS-PAGE；

(5)用相应的抗体依次进行一抗二抗即可，抗体稀释液为含3-5％(wt/vol)的脱脂奶粉或者1％的BSA的TBS缓冲液。

【实施例1】USP2a的D357A或S207/225A突变体对TGFβ信号通路的调节作用

(1)确定USP2a的D357A或S207/225A突变体调控TGFβ信号通路

本实验通过荧光素酶检测(Luciferase assay)实验确定USP2a的D357A或S207/225A突变体是否调控TGFβ信号通路，即激活SMAD2/3/4荧光素酶报告基因的转录。具体实施方式为：将表达USP2a的D357A或S207/225A突变体的质粒分别与SMAD2/3/4荧光素酶报告质粒、pGL2-Empty control-SV40-Luc通过磷酸钙共同转染HEK293细胞，转染24h后，加入TGFβ(15ng/mL)刺激8h，再进行检测。

实验结果如图2所示，从图2A可看出，与USP2a野生型相比，USP2a(D357A)突变体显著抑制了SMAD2/3/4荧光素酶报告基因的转录；从图2D也可看出，与USP2a野生型相比，USP2a(S207/225A)突变体显著抑制了SMAD2/3/4荧光素酶报告基因的转录；实验证明，USP2a的D357A或S207/225A突变体可以负调控TGFβ信号通路。

本实验通过构建USP2a的D357A或S207/225A突变体的质粒，通过慢病毒载体包装慢病毒感染HeLa或缺失USP2a的HCT116(USP2a^-/-HCT116)细胞，加TGFβ刺激，在刺激后的不同时间点收集细胞，提取RNA以便进行荧光实时定量PCR实验，或提取蛋白质以便进行免疫印迹实验。

通过荧光实时定量PCR检测在加入TGFβ(15ng/mL)刺激后不同时间点，TGFβ信号通路下游的基因p15、p21的转录情况，结果如图2B和2E所示，在HeLa细胞中，加入TGFβ刺激后，过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体随着时间延长下游基因在转录水平都被抑制，证明过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体能够抑制TGFβ信号通路下游基因p15、p21的转录。

另一方面，通过免疫印迹实验对SMAD2/3及其磷酸化形式pSMAD2的表达量进行检测，实验结果如图2C和2F所示，在过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体的HeLa或缺失USP2a的HCT116(USP2a^-/-HCT116)细胞中，加入TGFβ后，pSMAD2均随着时间延长而增加，但是过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体质粒相比于过表达USP2a野生型质粒pSMAD2减少，证明USP2a的D357A或S207/225A突变体能够抑制SMAD2的磷酸化。

(2)过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体对TGFβ介导的EMT过程的调控

本实验通过构建USP2a的D357A或S207/225A突变体的质粒，通过慢病毒载体包装慢病毒感染HeLa细胞，加TGFβ(15ng/mL)刺激，在刺激后的不同时间点收集细胞，提取RNA以便进行荧光实时定量PCR实验，或提取蛋白质进行免疫印迹实验。

实验结果如图3，从图3A可看出，过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体后，TGFβ介导的EMT信号通路的下游基因SNAI1、VIM的转录受到抑制；从图3B可看出，过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体后，TGFβ介导的EMT信号通路的下游基因SNAI1、VIM的蛋白表达水平受到抑制，证明过表达USP2a的D357A或S207/225A突变体能抑制TGFβ介导的EMT过程。

【实施例2】USP2a的D357A或S207/225A突变体调控肿瘤转移

(1)敲除USP2a对裸鼠肺部成瘤和存活率的影响

为了证明USP2a在肿瘤形成中的作用，使用CRISPR/Cas9介导的基因编辑在Hep3B细胞系里构建了两个靶向USP2a不同序列的敲除细胞系，分别为USP2aKO#2和USP2aKO#3，用该USP2a敲除细胞系进行裸鼠肿瘤形成实验，分为USP2a WT、USP2aKO#2和USP2aKO#3三个组。

将上述三组Hep3B细胞进行裸鼠肿瘤形成实验：将30只4周龄雄性裸鼠随机分成两组，每组10只，分别尾静脉注射USP2a WT、USP2aKO#2和USP2aKO#3的Hep3B细胞系，每只裸鼠注射的细胞量为5×10⁶个，制备成PBS单细胞悬液，每只注射200微升。

在第18天，每组取出5只裸鼠拉颈处死后取出肺，经观察发现肺部形成了肉眼可见的肿瘤，而后经过H&E染色，对肺部肿瘤个数、大小进行分析。结果如图4A所示，USP2aKO#2和USP2aKO#3实验组在肺部形成的肿瘤数目均显著低于USP2a WT对照组，但是如图4B所示，实验组和对照组肿瘤的大小并没有显著差异。证明敲除USP2a能减少肿瘤在肺部的转移，但并不改变肿瘤的大小。

剩余的每组5只裸鼠继续统计其生存情况并计算出存活率，实验结果如图4C所示，USP2aKO#2和USP2aKO#3实验组裸鼠的存活时间显著长于USP2a WT对照组。证明敲除USP2a可以显著提高裸鼠的存活率。

(2)敲除USP2a以后再回复USP2a的D357A或S207/225A突变体对裸鼠肺部成瘤和生存率的影响

为了证明USP2a的D357A或S207/225A突变体在肿瘤形成中的作用，利用慢病毒载体包装技术将phage-puro-6tag(Vec)、phage-puro-6tag-USP2a(WT)、phage-puro-6tag-USP2a(D357A)或phage-puro-6tag-USP2a(S207/225A)回复表达到USP2aKO#3的Hep3B细胞系中，再进行裸鼠肿瘤形成实验，分别对应为Vec、WT、DA和SA四个组。

将上述四组Hep3B细胞进行裸鼠肿瘤形成实验：将40只4周龄雄性裸鼠随机分成两组，每组10只，分别尾静脉注射回复表达Vec、WT、DA和SA的USP2aKO#3的Hep3B细胞系，每只裸鼠注射的细胞量为5×10⁶个，制备成PBS单细胞悬液，每只注射200微升。

在第18天，每组取出5只裸鼠拉颈处死后取出肺，经观察发现肺部形成了肉眼可见的肿瘤，而后经过H&E染色，对肺部肿瘤个数、大小进行分析，结果如图5A和5B所示，回复表达WT的实验组在肺部形成的肿瘤数目显著高于Vec对照组，但是回复表达DA或SA实验组在肺部形成的肿瘤数目却显著低于WT上实验组，并且各个实验组和对照组之间肿瘤的大小并没有显著差异。证明在USP2aKO#3的Hep3B细胞系中回复表达USP2a(D357A)或USP2a(S207/225A)能显著减少肿瘤在肺部的转移，但并不改变肿瘤的大小。

剩余的每组5只裸鼠继续统计其生存情况并计算出存活率，实验结果如图5C所示，回复表达WT的实验组的裸鼠存活时间显著少于Vec对照组，而回复表达DA或SA实验组的裸鼠存活时间却显著长于WT实验组。证明在USP2aKO#3的Hep3B细胞系中回复表达USP2a的D357A或S207/225A突变体可以显著提高裸鼠的存活率。

最后要说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 武汉大学

<120> USP2a的D357A或S207/225A突变体在抑制肿瘤转移中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 605

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Ser Gln Leu Ser Ser Thr Leu Lys Arg Tyr Thr Glu Ser Ala Arg

1 5 10 15

Tyr Thr Asp Ala His Tyr Ala Lys Ser Gly Tyr Gly Ala Tyr Thr Pro

20 25 30

Ser Ser Tyr Gly Ala Asn Leu Ala Ala Ser Leu Leu Glu Lys Glu Lys

35 40 45

Leu Gly Phe Lys Pro Val Pro Thr Ser Ser Phe Leu Thr Arg Pro Arg

50 55 60

Thr Tyr Gly Pro Ser Ser Leu Leu Asp Tyr Asp Arg Gly Arg Pro Leu

65 70 75 80

Leu Arg Pro Asp Ile Thr Gly Gly Gly Lys Arg Ala Glu Ser Gln Thr

85 90 95

Arg Gly Thr Glu Arg Pro Leu Gly Ser Gly Leu Ser Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Phe Pro Tyr Gly Val Thr Asn Asn Cys Leu Ser Tyr Leu Pro Ile Asn

115 120 125

Ala Tyr Asp Gln Gly Val Thr Leu Thr Gln Lys Leu Asp Ser Gln Ser

130 135 140

Asp Leu Ala Arg Asp Phe Ser Ser Leu Arg Thr Ser Asp Ser Tyr Arg

145 150 155 160

Ile Asp Pro Arg Asn Leu Gly Arg Ser Pro Met Leu Ala Arg Thr Arg

165 170 175

Lys Glu Leu Cys Thr Leu Gln Gly Leu Tyr Gln Thr Ala Ser Cys Pro

180 185 190

Glu Tyr Leu Val Asp Tyr Leu Glu Asn Tyr Gly Arg Lys Gly Ser Ala

195 200 205

Ser Gln Val Pro Ser Gln Ala Pro Pro Ser Arg Val Pro Glu Ile Ile

210 215 220

Ser Pro Thr Tyr Arg Pro Ile Gly Arg Tyr Thr Leu Trp Glu Thr Gly

225 230 235 240

Lys Gly Gln Ala Pro Gly Pro Ser Arg Ser Ser Ser Pro Gly Arg Asp

245 250 255

Gly Met Asn Ser Lys Ser Ala Gln Gly Leu Ala Gly Leu Arg Asn Leu

260 265 270

Gly Asn Thr Cys Phe Met Asn Ser Ile Leu Gln Cys Leu Ser Asn Thr

275 280 285

Arg Glu Leu Arg Asp Tyr Cys Leu Gln Arg Leu Tyr Met Arg Asp Leu

290 295 300

His His Gly Ser Asn Ala His Thr Ala Leu Val Glu Glu Phe Ala Lys

305 310 315 320

Leu Ile Gln Thr Ile Trp Thr Ser Ser Pro Asn Asp Val Val Ser Pro

325 330 335

Ser Glu Phe Lys Thr Gln Ile Gln Arg Tyr Ala Pro Arg Phe Val Gly

340 345 350

Tyr Asn Gln Gln Asp Ala Gln Glu Phe Leu Arg Phe Leu Leu Asp Gly

355 360 365

Leu His Asn Glu Val Asn Arg Val Thr Leu Arg Pro Lys Ser Asn Pro

370 375 380

Glu Asn Leu Asp His Leu Pro Asp Asp Glu Lys Gly Arg Gln Met Trp

385 390 395 400

Arg Lys Tyr Leu Glu Arg Glu Asp Ser Arg Ile Gly Asp Leu Phe Val

405 410 415

Gly Gln Leu Lys Ser Ser Leu Thr Cys Thr Asp Cys Gly Tyr Cys Ser

420 425 430

Thr Val Phe Asp Pro Phe Trp Asp Leu Ser Leu Pro Ile Ala Lys Arg

435 440 445

Gly Tyr Pro Glu Val Thr Leu Met Asp Cys Met Arg Leu Phe Thr Lys

450 455 460

Glu Asp Val Leu Asp Gly Asp Glu Lys Pro Thr Cys Cys Arg Cys Arg

465 470 475 480

Gly Arg Lys Arg Cys Ile Lys Lys Phe Ser Ile Gln Arg Phe Pro Lys

485 490 495

Ile Leu Val Leu His Leu Lys Arg Phe Ser Glu Ser Arg Ile Arg Thr

500 505 510

Ser Lys Leu Thr Thr Phe Val Asn Phe Pro Leu Arg Asp Leu Asp Leu

515 520 525

Arg Glu Phe Ala Ser Glu Asn Thr Asn His Ala Val Tyr Asn Leu Tyr

530 535 540

Ala Val Ser Asn His Ser Gly Thr Thr Met Gly Gly His Tyr Thr Ala

545 550 555 560

Tyr Cys Arg Ser Pro Gly Thr Gly Glu Trp His Thr Phe Asn Asp Ser

565 570 575

Ser Val Thr Pro Met Ser Ser Ser Gln Val Arg Thr Ser Asp Ala Tyr

580 585 590

Leu Leu Phe Tyr Glu Leu Ala Ser Pro Pro Ser Arg Met

595 600 605

<210> 2

<211> 1818

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

atgtcccagc tctcctccac cctgaagcgc tacacagaat cggcccgcta cacagatgcc 60

cactatgcca agtcgggcta tggtgcctac accccgtcct cctatggggc caatctggct 120

gcctccttac tggagaagga gaaacttggt ttcaagccgg tccccaccag cagcttcctc 180

acccgtcccc gtacctatgg cccctcctcc ctcctggact atgaccgggg ccgccccctg 240

ctgagacccg acatcactgg gggtggtaag cgggcagaga gccagacccg gggtactgag 300

cggcctttag gcagtggcct cagcgggggc agcggattcc cttatggagt gaccaacaac 360

tgcctcagct acctgcccat caatgcctat gaccaggggg tgaccctaac ccagaagctg 420

gacagccaat cagacctggc ccgggatttc tccagcctcc ggacctcaga tagctaccgg 480

atagacccca ggaacctggg ccgcagcccc atgctggccc ggacgcgcaa ggagctctgc 540

accctgcagg ggctctacca gacagccagc tgccctgaat acctggtcga ctacctggag 600

aactatggtc gcaagggcag tgcatctcag gtgccctccc aggcccctcc ctcacgagtc 660

cctgaaatca tcagcccaac ctaccgaccc attggccgct acacgctgtg ggagacggga 720

aagggtcagg cccctgggcc cagccgctcc agctccccgg gaagagacgg catgaattct 780

aagagtgccc agggtctggc tggtcttcga aaccttggga acacgtgctt catgaactca 840

attctgcagt gcctgagcaa cactcgggag ttgagagatt actgcctcca gaggctctac 900

atgcgggacc tgcaccacgg cagcaatgca cacacagccc tcgtggaaga gtttgcaaaa 960

ctaattcaga ccatatggac ttcatccccc aatgatgtgg tgagcccatc tgagttcaag 1020

acccagatcc agagatacgc accgcgcttt gttggctata atcagcagga tgctcaggag 1080

ttccttcgct ttcttctgga tgggctccat aacgaggtga accgagtgac actgagacct 1140

aagtccaacc ctgagaacct cgatcatctt cctgatgacg agaaaggccg acagatgtgg 1200

agaaaatatc tagaacggga agacagtagg atcggggatc tctttgttgg gcagctaaag 1260

agctcgctga cgtgtacaga ttgtggttac tgttctacgg tcttcgaccc cttctgggac 1320

ctctcactgc ccattgctaa gcgaggttat cctgaggtga cattaatgga ctgcatgagg 1380

ctcttcacca aagaggatgt gcttgatgga gatgaaaagc caacatgctg tcgctgccga 1440

ggcagaaaac ggtgtataaa gaagttctcc atccagaggt tcccaaagat cttggtgctc 1500

catctgaagc ggttctcaga atccaggatc cgaaccagca agctcacaac atttgtgaac 1560

ttccccctaa gagacctgga cttaagagaa tttgcctcag aaaacaccaa ccatgctgtt 1620

tacaacctgt acgctgtgtc caatcactcc ggaaccacca tgggtggcca ctatacagcc 1680

tactgtcgca gtccagggac aggagaatgg cacactttca acgactccag cgtcactccc 1740

atgtcctcca gccaagtgcg caccagcgac gcctacctgc tcttctacga actggccagc 1800

ccgccctccc gaatgtag 1818

Claims

1.一种USP2a的突变体蛋白，其特征在于：所述突变体蛋白为如下1)或2)：

1)氨基酸序列为将USP2a蛋白的氨基酸序列第357位天冬氨酸或者第207位和第225位丝氨酸突变为丙氨酸得到的序列；所述USP2a蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；

2.权利要求1所述的USP2a的突变体蛋白的应用，其特征在于：所述应用为如下a)-f)至少一种中的应用：

a)制备抑制肿瘤转移产品；

b)制备抑制肿瘤细胞迁移产品；

c)制备抑制肿瘤细胞侵袭能力产品；

d)制备抑制于肿瘤转移相关的基因表达的产品；

e)制备用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；

f)制备抑制肿瘤转移的模型。

3.一种包含权利要求1所述的USP2a的突变体蛋白的产品，其特征在于：所述产品为如下A-F中的任一种：

A.抑制肿瘤转移产品；

B.抑制肿瘤细胞迁移产品；

C.抑制肿瘤细胞侵袭能力产品；

D.抑制于肿瘤转移相关的基因表达的产品；

E.用于筛选治疗肿瘤转移药物的模型；

F.抑制肿瘤转移的模型。

4.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述肿瘤包括但不限于：肝癌、肺癌、鳞癌、乳腺癌、子宫颈癌、腺癌。

5.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述肿瘤细胞包括但不限于：肝癌细胞、肺癌细胞、鳞癌细胞、乳腺癌细胞、子宫颈癌细胞、腺癌细胞。

6.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述肿瘤转移相关的基因为与EMT过程相关的基因。

7.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述产品选自：药物、保健品、试剂盒、医疗设备、或它们的组合。

8.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述产品包含：药学上、免疫性上或保健品学上可接受的载体、辅料、容器、包装物、给予装置，指示给予所含USP2a突变体蛋白以预防和/或治疗对象中肿瘤转移的指示物。

9.根据权利要求2所述的应用或权利要求3所述的产品，其特征在于：所述模型为动物模型，所述动物为小鼠。