CN108388853A - 针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法 - Google Patents

针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法 Download PDF

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CN108388853A CN201810136917.2A CN201810136917A CN108388853A CN 108388853 A CN108388853 A CN 108388853A CN 201810136917 A CN201810136917 A CN 201810136917A CN 108388853 A CN108388853 A CN 108388853A
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Abstract

本发明涉及一种针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，属于数字全息成像技术的医学应用领域。该方法首先对同时含有白细胞与血小板的全息图进行初步的卷积重建，通过小波分解系数提取出白细胞对应区域，并使用形态学手段提高区域捕获准确度并计数，再对该区域重建信息进行反衍射还原出对应的衍射环，与原始全息图中衍射环抵消后进行二次重建，进而得到血小板的清晰成像，最终通过灰度膨胀与对数正态分布拟合所得灰度阈值能够对血小板加以良好识别和准确计数。此外该方法不仅适用于白细胞与血小板，同样可适用于其他共存有体积差异显著的物体的全息图重建，具有更为广普的意义。

Description

针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法
技术领域
本发明属于数字全息成像技术的医学应用领域，涉及针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法。
背景技术
血液是人体不可或缺的重要组成部分，血液中各类细胞、内容物含量的正常与否直接关系到人自身身体的健康状况。血液常规检测是医疗中一种常见化验项目。随着目前检测技术的进步，能够用于血常规的检测的方法手段越发丰富：
①显微计数法：
原理：采用人工镜检(多使用细胞计数板，又称牛鲍板)，借助染色剂、造影剂或荧光染料，直接由医检人员对各类血细胞观察标记、分类计数。
优点：该方法是血常规检测的经典方法，也是目前血液检测的精标准。
缺点：人工检测成本高、效率低下，无法满足医疗需求；受限于显微镜的狭窄视野，无法对大样本血样同时观察计数；需借助染料染色，对细胞造成不可逆伤害。
②库尔特计数法：
原理：利用血细胞通过充满电解液的小孔管时，由于排开了相同体积的电解液而导致小孔管内外两电极间电阻变化而产生电位脉冲，通过处理直流阻抗-射频阻抗等信息来检测血细胞直径、表面形貌等信息，进而对通过的血细胞进行分类计数。
优点：应用广泛，检测迅速。
缺点：设备体积庞大，价格昂贵，不能便携，内部结构复杂不易小型化；对于细胞回流、孔间徘徊、粘连等情况的分辨处理能力不佳。
③流式细胞术
原理：利用光散射理论，通过检测细胞的前向散射特征、侧向散射特征以及荧光特征等，对处于快速直线运动中的细胞进行逐个、多参数的快速定性、定量分析及分选。
优点：检测速度快，测量指标多，数据采集量大，分析全面，方法多样等。
缺点：价格昂贵，设备维护成本高，仪器内血样流路繁复、光路复杂。
④图像分析法
原理：将显微镜和图像处理技术相结合，利用图像处理技术进行自动检测。
优点：算法灵活多样，适用于多种问题的分析处理；目前显微镜设备常带有图像处理模块，省却诸多人工操作。
缺点：对样品和图像质量要求较高，往往需要对样品进行繁琐的预处理；受限于显微镜捕获图像时的视野，包含样品量较低，引入的偶然误差较大。
作为一种新兴的成像手段，数字全息成像技术完美继承了图像处理方法灵活的处理方法的同时，还基于自身特点规避了上述方法中诸多缺陷。数字全息是一种精度可达微米级别的成像方法，可由CCD等光学元器件直接记录获取样本图像，光路极其精简，易于集成和小型化。同时其具有全视场、非接触、无损伤、实时性、定量化的优点。加之无需对样本染色即可清晰成像，故特别适合于活体生物样品的定量三维重建和快速跟踪，得以在生物医学应用领域尤其是细胞培养观测中发展迅速。此外由于全息图视野直接对应于光学元器件的尺寸，所以全息图具有得天独厚的大视野成像的优点。在同时能够对微米级别物体准确成像的基础上，全息图视野下所记录的物体信息远丰富于常规光学显微镜。因此一次成像可涵盖较大体积的血样样液，计数样本的增大降低了偶然性误差，具有较高的计数准确度。
目前借助数字全息图重建方法对细胞等微观生物体分类、计数、跟踪观察的应用近年来多有见报，但其目标物体种类往往单一，同时物体尺寸往往大至十余甚至数十、上百微米(如大草履虫、血吸虫、变形虫等)，不契合血常规检测中血细胞的分布特征。
以男性正常成年人血样为例，其红细胞、白细胞与血小板浓度与主要尺寸参考值为：
红细胞(7-10um) 4.3-5.8×1012/L
白细胞(10-20um) 3.5-9.5×109/L
血小板(2-4um) 100-300×109/L
红细胞分布密度最大，高出血小板密度1个数量级、白细胞密度3个数量级，故可通过将血样稀释至一个合适的计数浓度(实验验证3000-10000倍稀释为佳)对红细胞单独计数。此时白细胞与血小板的干扰因素相对很弱，并可根据面积、圆形度等特征加以识别剔除。
至于白细胞与血小板的计数，可使用红细胞裂解液(主要成分：NH4CL、KHCO3、Na2EDTA)将红细胞裂解后再进行，操作简单易行、实用性好。但问题在于白细胞与血小板的分离很难通过简单的生化反应和操作实现。而对于两者共存的样液，在进行全息图获取的过程中，由于白细胞相对于血小板体积明显偏大，其对光的干涉、衍射作用更为强烈，所形成的衍射环也更为明显，携带的信息强度更大。因此当使用常规重建手段对全息图进行重建后，其中白细胞的形貌信息得到了良好保留，而血小板信息由于过于微弱而被掩盖，直接重建后血小板成像结果难以或者根本无法提取，也就无法帮助实验、检验人员获取到有用的信息。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法。首先使用常规的全息重建方法(卷积重建法)对全息图进行初步分块重建，使用小波分解所得小波系数结合形态学运算将各重建图块中的白细胞区域加以提取并进行白细胞计数。再将重建所得复数矩阵中对应白细胞区域的数值进行保留，将其他非白细胞区域的元素实部、虚部分别统一赋值为矩阵实部、虚部的均值，按照卷积重建法步骤反向执行，反衍射出白细胞区域对应衍射环。然后调整幅值系数，将所得衍射环与原始全息图中对应衍射环加以抵消，再次重建即可得到明显的血小板颗粒。之后将所得血小板重建图进行均值滤波去噪并加以灰度膨胀，即可得到能用于血小板计数的血小板分布图。最后对血小板分布图进行灰度统计，使用对数正态分布对灰度统计直方图进行抽样拟合，设置灰度阈值并将图像二值化，借助形态学手段完成血小板计数。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，包括以下步骤：
S1：读入待重建全息图，进行预处理；
S2：设置分块尺寸，将全息图进行分块处理；
S3：对于某一分割后全息图像块H在记录距离、重建波长下进行卷积重建，得到能够反应白细胞清晰形态的重建复矩阵U：
U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
其中R与O分别为复矩阵的实部矩阵与虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布；
S4：对重建所得复数矩阵取模，进行1层Haar小波分解，得小波分解系数矩阵，含低频及横、纵、对角方向高频共四个矩阵，单个矩阵的行列均为原图二分之一；
其中：
低频系数cj反应重建图像概貌；
高频系数dj,1构造重建图像垂直边缘，反应图像水平方向灰度变化；
高频系数dj,2构造重建图像水平边缘，反应图像垂直方向灰度变化；
高频系数dj,3构造重建图像对角边缘，反应图像斜角方向灰度变化；
S5：对三个高频系数矩阵元素取绝对值，并选取对应位置绝对值最大值整合为一个矩阵D；
此时矩阵D尺寸仅为重建图像块行列的二分之一；
S6：设定合适的取舍阈值，将矩阵D二值化，取出白细胞的种子区域M，再使用形态学处理手段获取到准确的血细胞对应区域；
S7：对于初步重建得到的复数矩阵对应血细胞区域的数据加以保留而将其他位置处的数据实部、虚部分别替换为矩阵实部、虚部的均值；
S8：按照卷积重建步骤反向执行，反衍射出复数矩阵WL×L对应衍射环矩阵holoL×L；
S9：从原始全息图中将所得衍射环抵消，此时全息图中不包含有白细胞衍射信息；再对抵消后全息图重建，得到较为清晰的血小板重建图；
S10：均值滤波去除血小板重建图中噪声，灰度膨胀对血小板区域进行视觉增强；
S11：统计PLT图像灰度分布直方图，记录在一维数组Datagray，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；
S12：根据计算得到灰度阈值将PLT图像二值化，得逻辑矩阵PLTBW；并使用形态学手段对血小板区域进行识别，以及8连通的连通域计数；
S13：对Num1和Num2中数据进行离群值分析。
进一步，所述步骤S1具体为：将全息图从RGB彩色空间映射为灰度图像，对应像素映射关系：
Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为红、绿、蓝三原色的通道信息。
进一步，所述步骤S2具体为：
S21：设图像块分块边长为L，整幅图像行列值为M和N，单位为像素pixel，对应整除取其行、列所能排布图像块的个数Row和Col：
Row＝M|L
Col＝N|L
S22：取整幅图像中间Row×L行与Col×L列区域为有效重建区域，完成图像裁剪；
S23：将全息图有效区域分割为Row×Col个边长为L的图像块，由于对每一图像块的处理步骤相同，以H代指某一全息图像块；
S24：构建两个等大空矩阵Num1和Num2，具有Row行、Col列元素，分别用以记录对应图像块中统计得到的白细胞数量与血小板数量；
所述步骤S4具体为：
S41：将S3中重建得到的复数矩阵U取模，得实数矩阵I；
S42：使用Haar小波基对实数图像矩阵进行分解，以获取在水平、垂直、对角方向的高频小波系数，采用二维小波分解的Mallet算法形式加以表示：
S5：对三个高频系数矩阵元素取绝对值，并选取对应位置绝对值最大值整合为一个矩阵D，
此时矩阵D尺寸仅为重建图像块行列的二分之一。
进一步，所述步骤S6具体为：
S61：设置THR1作为矩阵D的二值化阈值，经实验验证，当THR1取18-24时能够获取较为优良的白细胞种子区域，THR1＝20，
S62：M由高频矩阵对应坐标最大值构建，反映的是白细胞的边缘信息，但存在边缘未闭合的情况，设置结构Se，对M进行形态学膨胀，
对处理后的二值图M进行孔洞填充；
S63：S5指出，此时M尺寸仅为重建图像块行列各二分之一，对M进行尺寸变换，也即通过插值将M还原为重建图尺寸；由于M为二值图像，采用邻近插值的方式实现；
S64：对于图像中仍有可能存在的未闭合边缘白细胞区域，使用正、反两次遍历图像块的方法进行区域生长，具体的：
若在遍历时某一像素点灰度值低于整图灰度级的二分之一；
且该像素点对应M矩阵坐标处逻辑值为假；
且其八邻域范围内对应M矩阵坐标中逻辑值有真者；
则将该像素对应M矩阵坐标处逻辑值赋值为真；
S65：对于图像中因形态学膨胀或插值造成的白细胞区域过度选取的问题进行区域消除，具体的对于M矩阵为真值的区域进行考察，若其坐标对应I矩阵处数值不低于整图灰度级的五分之四；
S67：形态学滤波，认为对M矩阵进行8连通的连通域识别后，单一连通域面积少于10个像素点的区域不足以构成白细胞区域，不予以计算，并将该连通域内所有元素逻辑值还原为假；
S68：对M矩阵中使用8连通的连通域计数，计数值保存在Num1对应于当前全息图块的元素中。
进一步，所述步骤S7具体为：
S71：计算重建所得复矩阵U的实部R与虚部系数O的均值，分别记为real和imag，
S72：根据M矩阵逻辑值分布，构建针对白细胞区域的复数矩阵W
进一步，所述步骤S9具体为：
S91：计算衍射环矩阵holoL×L元素均值holoavr，
S92：从全息图像块H中抵消掉衍射环矩阵holo所含信息，得到仅含有血小板信息的全息图像块HPLT，
HPLT(x,y)＝H(x,y)-2[holo(x,y)-holoavr]
S93：对矩阵HPLT进行卷积重建，得血小板重建复矩阵UP；与S41相同的，得到UP对应的实数矩阵I；并对其进行归一化和取整处理，得数值为整数且拉伸至整个图像灰度级分布区间[0，level]的实整数矩阵IP；
其中max和min分别代表矩阵I中的最大、最小元素数值，level表示图像设备用于显示的灰度级数目，取255。
进一步，所述步骤S10具体为：
S101：对IP进行模板尺寸为3×3的均值滤波，去除重建后图像中含有的噪声，仍记为IP，覆盖滤波处理前图像；
S102：对滤波后图像进行灰度膨胀处理，得血小板视觉增强图像PLT
其中Se取半径为3的圆盘disk结构。
进一步，所述步骤S11具体为：
S111：由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，选取对数正太分布对灰度分布数据做非线性回归拟合；其概率密度分布函数如下：
得拟合函数F(x)，x＝1,2,…,levely；其中μ为对数正态分布期望，σ为方差，两者均需经过非线性拟合后确定；levely表示拟合后灰度级数目，与level保持一致；
S112：计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标作为灰度阈值THR2，
一阶导数：
dy(x)＝F(x+1)-F(x)
二阶导数：
d2y(x)＝dy(x+1)-dy(x)
曲率：
进一步，所述步骤S12具体为：
S121：基于灰度阈值将PLT图像二值化，得到逻辑矩阵PLTBW，
S122：形态学滤波，考虑到灰度膨胀所导致的血小板区域的面积增大，认为不超过45个像素点、不少于18个像素点的单个连通域为有效计数区域，是表征血小板位置的区域；
S123：对符合形态学特征的区域进行8连通连通域计数，计数值保存在Num2对应于当前全息图块的元素中。
进一步，所述步骤S13具体为：
S131：离群值判断规则采用目前国际上比较通用的标准：以低于箱形图Boxplot下箱体的1.5倍个四分位间距(Inter-quartile Range，IQR)，或是高于箱形图上箱体的1.5倍个四分位间距作为离群值界限；
S132：求取非离群值均值，使用该均值替换掉矩阵中离群元素；
S133：对矩阵Num1和Num2中元素数值分别进行累加，所得和值即是此全息图中所含有白细胞及血小板的计数结果；
S134：结合样液稀释倍数，以及腔室样液体积换算出对应全血中白细胞和血小板浓度；样液稀释倍数在100-300倍之间计数效果最佳；
S0：特别的，对于S3、S8、S9中的全息图重建(逆)方法，采用卷积重建法加以实现，具体计算流程如下：
卷积重建法是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布；由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
其中，
ima在此表示虚数单位，λ为重建光波长；
H(x,y)为图像传感器所记录的全息图光强分布，也即是所采集记录得到的全息图；
C(x,y)是重建光波在传感器平面上的分布，取为R(x,y)的共轭：
R(x,y)＝exp[-imak(xsinα+ysinβ)]
式中α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角；
而根据线性系统理论，再现像复振幅表示为如下卷积形式：
其中，k＝2π/λ，k为波数，g为自由空间脉冲响应；
再由卷积理论，使用傅里叶变换计算得到再现像，即重建图：
U＝FT-1[FT(H·C)·FT(g)]。
本发明的有益效果在于：本发明的白细胞的形貌信息和血小板信息得到了良好保留，便于提取，有助于实验、检验人员获取到有用的信息。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明流程图；
图2为分块所得灰度全息图块；
图3为卷积法初步重建白细胞图像；
图4为Haar小波分解重建图块各方向高频系数；(a)为横向高频系数；(b)为纵向高频系数；(c)为对角方向高频系数；(d)为对应点最大绝对值分布；
图5为白细胞分布粗略区域与准确位置；(a)为白细胞分布粗略区域；(b)为白细胞分布准确位置；
图6为反衍白细胞区域所得衍射环；
图7为用于血小板重建的全息图及重建结果；(a)为白细胞衍射环抵消后仅包含血小板衍射信息的全息图；(b)卷积重建所得血小板图像；(c)滤波去噪后的血小板图像；
图8为灰度膨胀后血小板增强图像。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
如图1所示，为本发明流程图。
如图2所示，S1：读入待重建全息图，进行预处理。
具体包括：
将全息图从RGB彩色空间映射为灰度图像，对应像素映射关系：
Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为三原色(红、绿、蓝)通道信息。
S2：设置分块尺寸，将全息图进行分块处理。
具体包括：
S21：设图像块分块边长为L，整幅图像行列值为M和N，单位为像素(pixel)。对应整除取其行、列所能排布图像块的个数Row和Col：
Row＝M|L
Col＝N|L
S22：取整幅图像中间Row×L行与Col×L列区域为有效重建区域，完成图像裁剪。
S23：将全息图有效区域分割为Row×Col个边长为L的图像块，由于对每一图像块的处理步骤相同，故在以下叙述中，以H代指某一全息图像块。
S24：构建两个等大空矩阵Num1和Num2，具有Row行、Col列元素，分别用以记录对应图像块中统计得到的白细胞数量与血小板数量。
如图3所示，S3：对于某一分割后全息图像块H在记录距离、重建波长下进行卷积重建，得到能够反应白细胞清晰形态的重建复矩阵U。
U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
其中R与O分别为复矩阵的实部矩阵与虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布。
如图4所示，图4为Haar小波分解重建图块各方向高频系数；(a)为横向高频系数；(b)为纵向高频系数；(c)为对角方向高频系数；(d)为对应点最大绝对值分布；
S4：对重建所得复数矩阵取模，进行1层Haar小波分解，得小波分解系数矩阵(含低频及横、纵、对角方向高频共四个矩阵，单个矩阵的行列均为原图二分之一)。
其中：
cj(低频系数)：反应重建图像概貌；
dj,1(高频系数)：构造重建图像垂直边缘，反应图像水平方向灰度变化；
dj,2(高频系数)：构造重建图像水平边缘，反应图像垂直方向灰度变化；
dj,3(高频系数)：构造重建图像对角边缘，反应图像斜角方向灰度变化。
具体包括：
S41：将S3中重建得到的复数矩阵U取模，得实数矩阵I。
S42：使用Haar小波基对实数图像矩阵进行分解，以获取在水平、垂直、对角方向的高频小波系数，采用二维小波分解的Mallet算法形式加以表示：
如图5所示，为白细胞分布粗略区域与准确位置；(a)为白细胞分布粗略区域；(b)为白细胞分布准确位置；
S5：对三个高频系数矩阵元素取绝对值，并选取对应位置绝对值最大值整合为一个矩阵D。
此时矩阵D尺寸仅为重建图像块行列的二分之一。
S6：设定合适的取舍阈值，将矩阵D二值化，取出白细胞的种子区域M。再使用形态学处理手段获取到准确的血细胞对应区域。
具体包括：
S61：设置THR1作为矩阵D的二值化阈值，经实验验证，当THR1取18-24时能够获取较为优良的白细胞种子区域。本发明推荐使用THR1＝20。
S62：M由高频矩阵对应坐标最大值构建，反映的是白细胞的边缘信息，但有可能存在边缘未闭合的情况。设置结构Se，对M进行形态学膨胀。
对处理后的二值图M进行孔洞填充。
S63：S5指出，此时M尺寸仅为重建图像块行列各二分之一，对M进行尺寸变换，也即通过插值将M还原为重建图尺寸。由于M为二值图像，故采用邻近插值的方式实现。
S64：对于图像中仍有可能存在的未闭合边缘白细胞区域，使用正、反两次遍历图像块的方法进行区域生长，具体的：
●若在遍历时某一像素点灰度值低于整图灰度级的二分之一(如灰度级为256的灰度图像，该阈值取128)；
●且该像素点对应M矩阵坐标处逻辑值为假；
●且其八邻域范围内对应M矩阵坐标中逻辑值有真者。
则将该像素对应M矩阵坐标处逻辑值赋值为真。
S65：对于图像中因形态学膨胀或插值造成的白细胞区域过度选取的问题进行区域消除，具体的对于M矩阵为真值的区域进行考察，若其坐标对应I矩阵处数值不低于整图灰度级的五分之四(如灰度级为256的灰度图像，该阈值取201)，则将该坐标位置处M矩阵元素值还原为假。
S67：形态学滤波，认为对M矩阵进行8连通的连通域识别后，单一连通域面积少于10个像素点的区域不足以构成白细胞区域，不予以计算，并将该连通域内所有元素逻辑值还原为假。
S68：对M矩阵中使用8连通的连通域计数，计数值保存在Num1对应于当前全息图块的元素中
如图6所示，S7：对于初步重建得到的复数矩阵对应血细胞区域的数据加以保留而将其他位置处的数据实部、虚部分别替换为矩阵实部、虚部的均值。
具体包括：
S71：计算重建所得复矩阵U的实部R与虚部系数O的均值，分别记为real和imag。
S72：根据M矩阵逻辑值分布，构建针对白细胞区域的复数矩阵W
S8：按照卷积重建步骤反向执行，反衍射出复数矩阵WL×L对应衍射环矩阵holoL×L；
如图7所示，为用于血小板重建的全息图及重建结果；(a)为白细胞衍射环抵消后仅包含血小板衍射信息的全息图；(b)卷积重建所得血小板图像；(c)滤波去噪后的血小板图像；
S9：从原始全息图中将所得衍射环抵消，此时全息图中不包含有白细胞衍射信息。再对抵消后全息图重建，得到较为清晰的血小板重建图；
具体包括：
S91：计算衍射环矩阵holoL×L元素均值holoavr。
S92：从全息图像块H中抵消掉衍射环矩阵holo所含信息，得到仅含有血小板信息的全息图像块HPLT。
HPLT(x,y)＝H(x,y)-2[holo(x,y)-holoavr]
S93：对矩阵HPLT进行卷积重建，得血小板重建复矩阵UP。与S41相同的，得到UP对应的实数矩阵I。并对其进行归一化和取整处理，得数值为整数且拉伸至整个图像灰度级分布区间([0，level])的实整数矩阵IP。
其中max和min分别代表矩阵I中的最大、最小元素数值。表示图像设备用于显示的灰度级数目，level通常为255。
如图8所示，S10：均值滤波去除血小板重建图中噪声，灰度膨胀对血小板区域进行视觉增强。
具体包括：
S101：对IP进行模板尺寸为3×3的均值滤波，去除重建后图像中含有的噪声，仍记为IP，覆盖滤波处理前图像。
S102：对滤波后图像进行灰度膨胀处理，得血小板视觉增强图像PLT
其中Se取半径为3的圆盘(disk)结构。
S11：统计PLT图像灰度分布直方图，记录在一维数组Datagray，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线。
具体包括：
S111：由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，故选取对数正太分布对灰度分布数据做非线性回归拟合。其概率密度分布函数如下：
得拟合函数F(x)，x＝1,2,…,levely；其中μ为对数正态分布期望，σ为方差，两者均需经过非线性拟合后确定；levely表示拟合后灰度级数目，与level保持一致。
S112：计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标(灰度)作为灰度阈值THR2。
一阶导数：
dy(x)＝F(x+1)-F(x)
二阶导数：
d2y(x)＝dy(x+1)-dy(x)
曲率：
S12：根据S112中计算得到灰度阈值将PLT图像二值化，得逻辑矩阵PLTBW。并使用形态学手段对血小板区域进行识别，以及8连通的连通域计数。
具体包括：
S121：基于灰度阈值将PLT图像二值化，得到逻辑矩阵PLTBW。
S122：形态学滤波，考虑到灰度膨胀所导致的血小板区域的面积增大，认为不超过45个像素点、不少于18个像素点的单个连通域为有效计数区域，是表征血小板位置的区域。
S123：对符合形态学特征的区域进行8连通连通域计数，计数值保存在Num2对应于当前全息图块的元素中。
S13：对Num1和Num2中数据进行离群值分析(以下步骤中S131、S132同时适用于矩阵Num1和Num2)。
具体包括：
S131：离群值判断规则采用目前国际上比较通用的标准：以低于箱形图(Boxplot)下箱体的1.5倍个四分位间距(Inter-quartile Range，IQR)，或是高于箱形图上箱体的1.5倍个四分位间距作为离群值界限。
S132：求取非离群值均值，使用该均值替换掉矩阵中离群元素。
S133：对矩阵Num1和Num2中元素数值分别进行累加，所得和值即是此全息图中所含有白细胞及血小板的计数结果。
S134：结合样液稀释倍数(实验证明稀释倍数在100-300倍之间计数效果最佳)以及腔室样液体积可以换算出对应全血中白细胞和血小板浓度。
S0：特别的，对于S3、S8、S9中的全息图重建(逆)方法，采用卷积重建法加以实现，具体计算流程如下：
卷积重建法是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布。由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
其中，
ima在此表示虚数单位，λ为重建光波长。
H(x,y)为图像传感器所记录的全息图光强分布，也即是所采集记录得到的全息图。
C(x,y)是重建光波在传感器平面上的分布，取为R(x,y)的共轭：
R(x,y)＝exp[-imak(xsinα+ysinβ)]
式中α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角。
而根据线性系统理论，再现像复振幅可以表示为如下卷积形式：
其中，k＝2π/λ，g为自由空间脉冲响应。
再由卷积理论，可使用傅里叶变换计算得到再现像，也即是本发明所使用的重建图：
U＝FT-1[FT(H·C)·FT(g)]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
S1：读入待重建全息图，进行预处理；
S2：设置分块尺寸，将全息图进行分块处理；
S3：对于某一分割后全息图像块H在记录距离、重建波长下进行卷积重建，得到能够反应白细胞清晰形态的重建复矩阵U：
U(xi,yi)＝R(xi,yi)+O(xi,yi)×ima
其中R与O分别为复矩阵的实部矩阵与虚部矩阵系数，ima在此表示虚数单位，(xi,yi)为重建图在再现像平面上的位置分布；
S4：对重建所得复数矩阵取模，进行1层Haar小波分解，得小波分解系数矩阵，含低频及横、纵、对角方向高频共四个矩阵，单个矩阵的行列均为原图二分之一；
其中：
低频系数cj反应重建图像概貌；
高频系数dj,1构造重建图像垂直边缘，反应图像水平方向灰度变化；
高频系数dj,2构造重建图像水平边缘，反应图像垂直方向灰度变化；
高频系数dj,3构造重建图像对角边缘，反应图像斜角方向灰度变化；
S5：对三个高频系数矩阵元素取绝对值，并选取对应位置绝对值最大值整合为一个矩阵D；
此时矩阵D尺寸仅为重建图像块行列的二分之一；
S6：设定合适的取舍阈值，将矩阵D二值化，取出白细胞的种子区域M，再使用形态学处理手段获取到准确的血细胞对应区域；
S7：对于初步重建得到的复数矩阵对应血细胞区域的数据加以保留而将其他位置处的数据实部、虚部分别替换为矩阵实部、虚部的均值；
S8：按照卷积重建步骤反向执行，反衍射出复数矩阵WL×L对应衍射环矩阵holoL×L；
S9：从原始全息图中将所得衍射环抵消，此时全息图中不包含有白细胞衍射信息；再对抵消后全息图重建，得到较为清晰的血小板重建图；
S10：均值滤波去除血小板重建图中噪声，灰度膨胀对血小板区域进行视觉增强；
S11：统计PLT图像灰度分布直方图，记录在一维数组Datagray，并采用对数正态分布对该直方图数据做非线性回归，进而拟合出一条单峰近似曲线；
S12：根据计算得到灰度阈值将PLT图像二值化，得逻辑矩阵PLTBW；并使用形态学手段对血小板区域进行识别，以及8连通的连通域计数；
S13：对Num1和Num2中数据进行离群值分析。
2.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S1具体为：将全息图从RGB彩色空间映射为灰度图像，对应像素映射关系：
Gray(i,j)＝0.229×R(i,j)+0.587×G(i,j)+0.114×B(i,j)
其中i、j为行列坐标，R、G、B分别为红、绿、蓝三原色的通道信息。
3.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S2具体为：
S21：设图像块分块边长为L，整幅图像行列值为M和N，单位为像素pixel，对应整除取其行、列所能排布图像块的个数Row和Col：
Row＝M|L
Col＝N|L
S22：取整幅图像中间Row×L行与Col×L列区域为有效重建区域，完成图像裁剪；
S23：将全息图有效区域分割为Row×Col个边长为L的图像块，由于对每一图像块的处理步骤相同，以H代指某一全息图像块；
S24：构建两个等大空矩阵Num1和Num2，具有Row行、Col列元素，分别用以记录对应图像块中统计得到的白细胞数量与血小板数量；
所述步骤S4具体为：
S41：将S3中重建得到的复数矩阵U取模，得实数矩阵I；
S42：使用Haar小波基对实数图像矩阵进行分解，以获取在水平、垂直、对角方向的高频小波系数，采用二维小波分解的Mallet算法形式加以表示：
S5：对三个高频系数矩阵元素取绝对值，并选取对应位置绝对值最大值整合为一个矩阵D，
此时矩阵D尺寸仅为重建图像块行列的二分之一。
4.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S6具体为：
S61：设置THR1作为矩阵D的二值化阈值，经实验验证，当THR1取18-24时能够获取较为优良的白细胞种子区域，THR1＝20，
S62：M由高频矩阵对应坐标最大值构建，反映的是白细胞的边缘信息，但存在边缘未闭合的情况，设置结构Se，对M进行形态学膨胀，
对处理后的二值图M进行孔洞填充；
S63：S5指出，此时M尺寸仅为重建图像块行列各二分之一，对M进行尺寸变换，也即通过插值将M还原为重建图尺寸；由于M为二值图像，采用邻近插值的方式实现；
S64：对于图像中仍有可能存在的未闭合边缘白细胞区域，使用正、反两次遍历图像块的方法进行区域生长，具体的：
若在遍历时某一像素点灰度值低于整图灰度级的二分之一；
且该像素点对应M矩阵坐标处逻辑值为假；
且其八邻域范围内对应M矩阵坐标中逻辑值有真者；
则将该像素对应M矩阵坐标处逻辑值赋值为真；
S65：对于图像中因形态学膨胀或插值造成的白细胞区域过度选取的问题进行区域消除，具体的对于M矩阵为真值的区域进行考察，若其坐标对应I矩阵处数值不低于整图灰度级的五分之四；
S67：形态学滤波，认为对M矩阵进行8连通的连通域识别后，单一连通域面积少于10个像素点的区域不足以构成白细胞区域，不予以计算，并将该连通域内所有元素逻辑值还原为假；
S68：对M矩阵中使用8连通的连通域计数，计数值保存在Num1对应于当前全息图块的元素中。
5.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S7具体为：
S71：计算重建所得复矩阵U的实部R与虚部系数O的均值，分别记为real和imag，
S72：根据M矩阵逻辑值分布，构建针对白细胞区域的复数矩阵W
6.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S9具体为：
S91：计算衍射环矩阵holoL×L元素均值holoavr，
S92：从全息图像块H中抵消掉衍射环矩阵holo所含信息，得到仅含有血小板信息的全息图像块HPLT，
HPLT(x,y)＝H(x,y)-2[holo(x,y)-holoavr]
S93：对矩阵HPLT进行卷积重建，得血小板重建复矩阵UP；与S41相同的，得到UP对应的实数矩阵I；并对其进行归一化和取整处理，得数值为整数且拉伸至整个图像灰度级分布区间[0，level]的实整数矩阵IP；
其中max和min分别代表矩阵I中的最大、最小元素数值，level表示图像设备用于显示的灰度级数目，取255。
7.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S10具体为：
S101：对IP进行模板尺寸为3×3的均值滤波，去除重建后图像中含有的噪声，仍记为IP，覆盖滤波处理前图像；
S102：对滤波后图像进行灰度膨胀处理，得血小板视觉增强图像PLT
其中Se取半径为3的圆盘disk结构。
8.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S11具体为：
S111：由于对数正态分布具有良好的单峰性和非对称性，选取对数正太分布对灰度分布数据做非线性回归拟合；其概率密度分布函数如下：
得拟合函数F(x)，x＝1,2,…,levely；其中μ为对数正态分布期望，σ为方差，两者均需经过非线性拟合后确定；levely表示拟合后灰度级数目，与level保持一致；
S112：计算拟合函数各点对应曲率，取第一个曲率极大值处对应下标作为灰度阈值THR2，
一阶导数：
dy(x)＝F(x+1)-F(x)
二阶导数：
d2y(x)＝dy(x+1)-dy(x)
曲率：
9.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S12具体为：
S121：基于灰度阈值将PLT图像二值化，得到逻辑矩阵PLTBW，
S122：形态学滤波，考虑到灰度膨胀所导致的血小板区域的面积增大，认为不超过45个像素点、不少于18个像素点的单个连通域为有效计数区域，是表征血小板位置的区域；
S123：对符合形态学特征的区域进行8连通连通域计数，计数值保存在Num2对应于当前全息图块的元素中。
10.根据权利要求1所述的针对白细胞与血小板共存全息图的分步重建与计数方法，其特征在于：所述步骤S13具体为：
S131：离群值判断规则采用目前国际上比较通用的标准：以低于箱形图Boxplot下箱体的1.5倍个四分位间距(Inter-quartile Range，IQR)，或是高于箱形图上箱体的1.5倍个四分位间距作为离群值界限；
S132：求取非离群值均值，使用该均值替换掉矩阵中离群元素；
S133：对矩阵Num1和Num2中元素数值分别进行累加，所得和值即是此全息图中所含有白细胞及血小板的计数结果；
S134：结合样液稀释倍数，以及腔室样液体积换算出对应全血中白细胞和血小板浓度；样液稀释倍数在100-300倍之间计数效果最佳；
S0：特别的，对于S3、S8、S9中的全息图重建(逆)方法，采用卷积重建法加以实现，具体计算流程如下：
卷积重建法是基于线性系统理论和瑞利-索默菲积分公式而构建的，能够准确反映光的空间衍射分布；由瑞利-索默菲衍射积分公式，全息图中衍射信息再现后对应光波：
其中，
ima在此表示虚数单位，λ为重建光波长；
H(x,y)为图像传感器所记录的全息图光强分布，也即是所采集记录得到的全息图；
C(x,y)是重建光波在传感器平面上的分布，取为R(x,y)的共轭：
R(x,y)＝exp[-imak(xsin α+ysin β)]
式中α、β分别为平面参考光波与空间yoz平面和xoz平面的夹角；
而根据线性系统理论，再现像复振幅表示为如下卷积形式：
其中，k＝2π/λ，k为波数，g为自由空间脉冲响应；
再由卷积理论，使用傅里叶变换计算得到再现像，即重建图：
U＝FT-1[FT(H·C)·FT(g)]。
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