CN108376210B - 基因组信息辅助育种方法ⅱ-一种基于全基因组snp有利单倍型挖掘的育种亲本选择方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用HT变异信息和SNP聚类分组信息进行育种亲本选择的基因组信息辅助育种方法。本发明的实质是通过基因组学和生物信息学的方法，获得候选育种亲本的大量基因组测序信息，一方面通过序列比对分析获得高质量SNP数据集，在此基础上计算候选育种亲本的遗传距离矩阵，构建SNP聚类树，依据亲缘关系远近进行候选亲本的分组；另一方面，根据育种计划所设定的目标性状，选择重要的相关基因位点，获取候选亲本间的HT变异信息，比较携带不同类型HT变异的亲本在目标性状上的差异。通过整合HT变异信息和基于SNP聚类亲本分组信息，从大量候选育种亲本中筛选获得用于目标性状重复表型鉴定的候选亲本。该方法属于水稻分子育种领域，利用数据库信息挖掘，能够从大量候选育种亲本中比较有效的缩小亲本材料范围，减少表型重复鉴定的工作量，提高育种工作效率。

Description

基因组信息辅助育种方法Ⅱ-一种基于全基因组SNP有利单倍 型挖掘的育种亲本选择方法

技术领域

本发明涉及一种利用基于全基因组SNP的单倍型信息进行有利等位基因挖掘和育种亲本选择的分子育种方法。该方法属于作物分子育种领域，适用于在水稻等作物中高效的进行育种亲本的选择。

背景技术

基因组技术与信息技术的结合，使得科研人员可以方便的获取所需要的海量的基因数据并深入的挖掘相关的遗传信息；数据库平台使得育种家能够对海量数据进行存储和深入的挖掘并实现信息共享。亲本选择是作物育种中至关重要的一个步骤，直接决定一个育种周期(至少3-5年)全部工作的成败。随着基因组时代的到来，分子育种已经向基于全基因组信息的方向演进；育种亲本的选择也不仅仅根据表型数据，更要包括目标性状关键基因的重要基因组信息数据。基因组信息的强大支持，也将使得育种工作的可重复性大大增强，育种工作的效率大大提高。

SNP信息是基因组中多态性最好的分子标记，其在基因组中广泛存在，既可以出现在基因内区域，也可以出现在基因间区域；利用足够量的SNP信息进行育种亲本材料的单倍型分析无疑是十分准确的。染色体上的SNP位点存在或大或小的连锁关系，一些紧密连锁的SNP 位点其所代表的染色体片段往往在自然选择(即进化)和人工选择(即育种)过程被整体转移，用其中少量代表SNP位点的基因型即可以有效的表示整个染色体片段的基因型，由于染色体片段的传递是通过配子进行的，配子是单倍体(haploid)，其基因型(genotype)就称为单倍型(haplotype，HT)。HT变异往往对于作物表型的影响要更加直接，而且针对HT进行标记辅助选择更加简洁有效。

通过大规模全基因组测序和生物信息学分析，一方面我们可以获取海量的HT变异信息；另一方面，对于个别重要的HT变异，我们可以进一步将其开发成单个的基于PCR(聚合酶链式反应)的育种用分子标记，应用于标记辅助选择育种。在大豆的全基因组选择方面已经有人提出了利用HT取样替代SNP取样的方法(邱丽娟等，2016)，但是对于利用HT进行育种亲本选择的研究尚未报道。

随着基因组测序技术飞速发展，伴随着测序成本的急剧下降和大量基因组数据的便于获取，如何将基因组数据与育种实践有效结合，成为摆在分子育种工作者面前的一个重要命题。在作物育种过程中，仅仅通过表型，即便是易于观察的抽穗期等表型，来筛选所需亲本也是一个繁重且周期较长的任务。到目前为止，全球测序的水稻品种已经不下5000份；其中由中国农业科学院作物科学研究所牵头，通过与华大基因及国际水稻研究所合作，共同完成了全球3000余份水稻种质资源的测序工作。如何从海量的数据中获取与育种相关的重要选择指标，有效的缩小表型鉴定的范围是一个重要的研究课题。如果能够将基因组信息与表型鉴定相结合，借助基因组手段缩小用于表型鉴定材料范围，无疑能够极大的提高育种工作表型鉴定的效率。以我国北方粳稻特别是东北粳稻的亲本选择为例，由于育种目标是选育感温性强而感光性弱甚至于无感光性的品种，因此可以选用的亲本在与感光性相关的基因位点上是否具有合适的单倍型，是一个非常重要的选择指标。

发明内容

(一)技术问题

本发明针对上述研究背景，利用基因组测序技术，通过对候选育种亲本进行基因组SNP 和HT变异数据的采集和分析。一方面基于SNP信息对亲本材料构建聚类树，依据基因组相似性进行分组；另一方面获取控制目标性状基因位点的HT变异信息，建立候选育种亲本的基于SNP聚类的分组信息和HT变异信息数据库，利用该数据库对育种亲本有效的进行基于基因组数据的辅助选择，主要应用于水稻等作物的育种。

(二)技术方案

1.一种利用HT变异信息和SNP聚类信息进行育种亲本选择的基因组信息辅助育种方法，按照如下步骤进行：

1)通过基因组重测序获得候选育种亲本的大量基因组reads信息；

2)通过常规的序列比对方法与参考基因组进行比对，获取reads的物理位置信息，提取 SNP信息数据集；通过设置参数，过滤SNP信息数据集，获得缺失数据最少的高质量SNP数据亚集；

3)在高质量SNP数据亚集的基础上，通过常规的方法计算获得候选育种亲本的遗传距离矩阵，利用常规方法构建SNP聚类树，根据候选育种亲本的SNP聚类信息，判断候选育种亲本之间的亲缘关系远近，依据基因组相似性进行亲本分组；

4)根据育种计划所设定的目标性状，选择重要的相关基因位点，根据该基因的物理位置区间，提取候选亲本在目标性状控制基因所对应的物理区间内的SNP信息，进一步设置非同义突变等筛选，根据候选亲本间的SNP多态性，利用自主编写的软件代码，将每个候选亲本中目标基因区段中的SNP信息整合成单倍型HT变异信息；

5)调取HT变异的不同类型所对应的目标性状表型，结合候选亲本的分组信息，从大量候选亲本中筛选获得用于表型鉴定的亲本子集；

6)结合亲本子集的表型重复鉴定结果最终确定育种计划所需的入选亲本。

该方法可以在水稻及其它作物的基因组信息辅助育种中应用。

(三)有益效果

本发明与现有技术相比具有以下优点及效果：

1.通过将HT变异信息与表现型筛选以及基于全基因组SNP聚类的分组信息相结合，能够比较准确有效的获得针对某个目标性状的育种计划所需的入选亲本。

2.利用数据库信息挖掘，能够从大量候选育种亲本中比较有效的缩小亲本材料范围，减少表型重复鉴定的工作量，提高育种工作效率；

3.本发明获得的育种亲本SNP聚类信息和DTH8基因位点为代表的HT变异信息可用于早熟粳稻育种亲本的基因型选择，有效地鉴别弱感光性且与粳稻亲缘关系较远的候选育种亲本，便于及时的杂交转育，加快育种进程。

附图说明

图1.通过基因ID检索DTH8基因，可以选择分析编码区还是启动子区以及等位基因频率等筛选条件；用户还可以自行添加分析测序样本的清单；默认选项为编码区和全部测序样本。

图2.分析获得的DTH8基因的功能和分类等基本信息示例。

图3.分析获得的DTH8基因的HT基本信息示例，包括关键SNP变异的染色体、物理位置和等位基因等信息。

图4.分析获得的不同单倍型所对应的测序样本和分组信息。

图5.下载后的测序样本清单。

具体实施方式

下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明。其中所用方法如无特别说明均为常规方法。以下示例不以任何形式限定本发明。

(一)亲本材料的基因组信息获取

1.供试材料

育种家的任意候选育种亲本材料。

2.DNA提取及全基因组高通量测序

参考Temnykh等(2000年)的DNA提取方法，对各单株分别提取基因组DNA。

考虑成本，基因组测序可以采用基于shot-gun测序技术，建库和测序方法都同常规。获得质量较好的数据覆盖度建议在10X以上。为了保证测序数据的质量，原始数据中如果某个 Read超过50％的碱基quality值小于5的或者有接头污染，则予以过滤淘汰。

(二)SNP信息提取及育种亲本聚类分析

考虑到育种亲本在目标性状适宜的情况下，有必要尽可能的保持其多样性，因此，我们对于候选育种亲本的亲缘关系要有一个基本的了解。

我们在基因组DNA测序数据的基础上，将每个样本获得的reads与参考基因组(例如 Os-Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0，IRGSP-1.0)利用免费分析工具如BWA等进行比对分析，将比对的结果生成BAM格式文件。在BAM文件的基础上，利用免费分析工具如GenomeAnalysis Toolkit(GATK)等提取SNP信息。为了提高SNP信息提取的可靠性，质量控制参数设置为：每个位点的mapping质量值大于20、变异质量值大于50，而且每个碱基至少有来自2个以上reads数据的支持，MAF值＞0.001。从提取的SNP数据集中随机挑选缺失数据最少的高质量SNP数据亚集，总数不超过200K，用于下一步的育种亲本聚类分析。

在上述高质量SNP数据亚集的基础上，计算育种亲本的遗传距离矩阵，免费工具如Tree BeST构建聚类树，展示候选育种亲本之间的亲缘关系，boot straps参数设置为1000。

(三)HT信息的提取和数据库的构建

利用自行设计的代码，基于IRGSP提供的日本晴基因组的GFF3注释文件(此文件包含基因在染色体上的物理位置，以及基因结构的信息)，提取基因区间(可视情况选择编码区、启动子区或非翻译区)的SNP，通过设置MAF值过滤掉多态性较低的位点，将所有样本的基因型进行组合，获得每种HT的SNP序列、包含的品种列表以及品种的表型统计值。为了方便应用，可构建数据库模块完成上述分析，基于Apache搭建网络服务器，将表型数据和基因注释信息导入MySQL数据库，利用PHP和JavaScript实现网站界面，该模块支持IRGSP-1.0基因ID、MSU-7.0基因ID以及染色体区间三种输入格式，可选择不同基因区间，设置MAF 过滤，提交候选亲本列表完成分析。结果展示界面列出了基因的功能注释，SNP位点统计信息以及HT信息，其中HT信息提供只保留选择项的功能方便对不同HT进行比较。

(四)目标性状相关关键基因位点(仅以感光性为例)的HT变异分析

以下分析可以通过依据上述步骤创建的类似http：//www.rmbreeding.cn/ Genotype/haplotype的数据库模块来完成。

已经知道DTH8是控制感光性的关键基因位点；我们选择该基因位点(RAP-DB的登录 ID号：Os08g0174500)作为HT变异的目标基因。首先在检索中输入目标基因ID号，可以设置相应的筛选参数(图1)，分析获得：1)目标基因的功能和分类信息(图2)；2)目标基因的HT基本信息，包括关键SNP变异的染色体、物理位置和等位基因等信息(图3)。

(五)确定育种计划入选亲本

下一步筛选抽穗期合适的候选亲本，需要依据不同单倍型所对应的目标性状表型数据进行比较筛选。

首选依据抽穗期(Days to heading)表型，选择合适的单倍型，然后考虑携带该类型单倍型的样本分组。以粳稻育种选择亲本为例，比如我们从表型水平选中了两个单倍型haplo#14 和haplo#27(图4)，它们对表型的效应分别为112和114天，比较接近。那么接下来我们就尽可能的选择与粳稻有一定遗传距离，但又不到籼粳亚种的差异水平的分组，比如热带粳稻 (Trop Jap)，因此选择haplo#14，点击最后一列的下载链接，即可获取携带该单倍型的亲本资源列表(图5)。这些入选亲本就可以通过进一步的表型重复鉴定，进入配组环节。

借助单倍型的数据库分析，可以有效减少表型重复鉴定的亲本数量，提高亲本选择的育种工作效率。

Claims (2)

1.一种利用HT变异信息和SNP聚类信息进行育种亲本选择的基因组信息辅助育种方法，按照如下步骤进行：

1)通过基因组重测序获得候选育种亲本的大量基因组reads信息；

2)通过常规的序列比对方法将1）中所述reads与参考基因组进行比对，获取reads的物理位置信息，提取SNP信息数据集；通过设置参数，过滤SNP信息数据集，获得缺失数据最少的高质量SNP数据亚集；

3)在高质量SNP数据亚集的基础上，通过常规的方法计算获得候选育种亲本的遗传距离矩阵，利用常规方法构建SNP聚类树，根据候选育种亲本的SNP聚类信息，判断候选育种亲本之间的亲缘关系远近，依据基因组相似性进行亲本分组；

4)根据育种计划所设定的目标性状，选择重要的相关基因位点，根据该基因的物理位置区间，提取候选亲本在目标性状控制基因所对应的物理区间内的SNP信息，进一步设置非同义突变筛选，根据候选亲本间的SNP多态性，利用自主编写的软件代码，将每个候选亲本中目标基因区段中的SNP信息整合成单倍型HT变异信息；

5)调取HT变异的不同类型所对应的目标性状表型，结合候选亲本的分组信息，从大量候选亲本中筛选获得用于表型鉴定的亲本子集；

6)结合亲本子集的表型重复鉴定结果最终确定育种计划所需的入选亲本。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法在水稻基因组信息辅助育种中的应用。

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