CN108359735B - 与母猪肢蹄骨密度相关的vtcn1基因的snp遗传标记 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物遗传标记筛选领域，具体涉及与母猪肢蹄骨密度相关的VTCN1基因的SNP遗传标记。该标记克隆自Ensemble数据库登录号为ALGA0027556的序列，其位于VTCN1基因的外显子区域。利用基因芯片技术对VTCN1基因进行分型，筛选得到一种与母猪肢蹄骨密度相关的标记，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，该序列的第101位的碱基处存在一个A/G的等位基因突变，导致多态性，当SEQ ID NO：1上的第101位的核苷酸为A时，判定母猪的肢蹄具有更高的骨密度。公开了筛选与母猪肢蹄骨密度相关遗传标记的方法及关联分析，为猪肢蹄结实度性状尤其是骨密度的标记辅助选择提供了新的SNP标记。

Description

与母猪肢蹄骨密度相关的VTCN1基因的SNP遗传标记

技术领域

本发明涉及猪遗传标记制备技术领域，具体涉及与母猪肢蹄骨密度相关SNP的遗传标记。本发明的遗传标记克隆自VTCN1基因，所述的遗传标记可用于猪肢蹄骨密度性状的预测。

背景技术

目前，为了提高猪的瘦肉率和生长效率，我国大量从国外引进瘦肉型猪种，瘦肉型猪生产速度快，骨发育跟不上，肢蹄结实度下降(柳小春等，1991)。肢蹄结实度，是指肢蹄健康程度和四肢运动协调程度的综合反应，具有低到中等遗传力(Jorgensen和Andersen，2000)，可以通过遗传手段进行遗传改良。总的来说，肢蹄结实度可以从肢蹄结构评分、骨矿物含量和骨密度等多个方面衡量(候利娟，2013)，肢蹄结构评分等评分结果受主观因素影响较大，而骨密度是通过仪器测量所得，将其作为衡量猪肢蹄结实度的指标具有一定的科学性、客观性。再者骨密度能反映骨骼的硬度和骨折风险(Rüegsegger，1991)，是人类骨质疏松的判断指标(杨小明等，2004)，可以作为肢蹄结实度的主要评估依据。在种猪选育过程中，如果能将骨密度作为一个育种指标，选育高产而又肢蹄结实的猪群，对提高肢蹄结实度、增加种猪使用年限、减少药物使用具有重要意义，是提高猪群的肢蹄健康程度、降低生产成本的有效途径。

骨密度，是指单位体积骨矿物质的含量，单位为g/cm³，常见的骨密度测定方法有电子计算机断层扫描技术(CT)、X-双能射线(DXA)、超声波技术等，它们客观性强、精准度高、可以进行无损测定(Scholz et al，2015)。但CT扫描仪、X-双能射线(DXA)仪器较为昂贵，一般只在人上使用，在家畜上的使用鲜有报道，相比之下超声波仪价格虽然不低，但后期测量成本较低，且准确性较高，在种猪选育过程中测量骨密度具有一定的可行性，可以作为种猪选育过程中对肢蹄结实度的判断标准。

VTCN1是免疫调节的重要基因，在免疫调节中起关键作用，与多种疾病相关，其中的幼年特发性关节炎(JIA)是一种慢性风湿性疾病，由于骨密度低导致，研究表明VTCN1与幼年特发性关节炎相关(Daha et al，2012)，可将其作为幼年特发性关节炎的预测信号(Albers et al，2014)。此外，风湿性关节炎患者的多处骨密度均低于正常组(徐胜前等，2004)，说明将其作为肢蹄结实度性状候选基因具有一定的科学性和严谨性。

本发明中发现的SNP与猪肢蹄骨密度性状的相关性达到了显著水平，可作为骨密度的遗传标记，为家猪肢蹄结实度性状的研究提供了新的遗传资源。

发明内容

本发明的目的在于客服现有技术的缺陷，提供一种与母猪肢蹄骨密度相关的VTCN1基因的SNP遗传标记，以完善家猪抗病育种的遗传标记。本发明利用美国GeneSeekPorcine 50K SNP芯片对SNP进行分型，并使用全基因组关联分析(Genome-WideAssociation Study，简称GWAS)筛选与母猪肢蹄相关的SNP，为猪的抗病育种提供了新的遗传标记资源和应用。

本发明的技术方案如下所述：

申请人通过基因分型技术并参阅Ensembl数据库，得到包含VTCN1基因(登录号ALGA0027556)上下游的100bp的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO:1所示。具体为： CCAGCTCAGAGAGCTTACGATGTGAGGCTCCCCGATGGTTTCCCCAGCCTACGGTGGTC TGGGCATCCCAGGTTGACCAGGGAGCCAACTTCTCAGAAGTR(A/G)TCCAACACCAGCT TTGAGCTGAACCCTGAGAATGTCACCATGAAGGTTGTGTCCGTGCTCTACAACGTCACA ATCAACACCACATACTCCTGTATGATTG，

上述序列的101位碱基处的R是A或G，导致上述序列多态性。

申请人通过基因芯片技术并参阅Ensemble，得到VTCN1基因第4外显子的核苷酸序列，上述序列的第101位碱基处的R为一个101A-101G的等基因突变，该突变使SEQ ID NO：1序列产生了多态性。经过关联分析表明，本发明的遗传标记可以作为检测与骨密度相关的遗传标记，且当SEQ ID NO：1所示序列上的第101位的核苷酸为A时，表明母猪的肢蹄具有更高的骨密度性状指标。

上述基因片段可以作为检测与猪骨密度性状相关的遗传标记。

申请人提供了一种筛选猪骨密度性状相关SNP遗传标记的方法，包括如下步骤：

①按照常规方法提取猪耳朵组织的基因组DNA，并对DNA进行质量检测。

②利用基因芯片技术对VTCN1基因进行分型(具体步骤见说明书文末的说明)。

③采用基于单标记关联回归模型的方法，以个体性别作为固定效应，在利用R统计环境下的enABEL软件包进行GWAS分析。

回归模型如下：Y＝Xb+Sα+Zu+e，其中Y代表“表型值向量”(the vector ofhenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“SNP的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布，u～N(0,Gσα2)，G表示基因组相似度矩阵(基于SNP标记)，G表示多基因加性方差(通过此进行遗传力的估计)；X、S、Z分别为b、α、u的关联矩阵(incidence matrix)；e代表“残差向量”(a vector of residual errors)，服从正态分布，e～N (0,Iσe2)，表示残差方差。

本发明筛选的遗传标记可用于非诊断目的的对猪肢蹄骨密度相关基因的基因型或与猪肢蹄性状中的骨密度之间的关联分析中，为猪骨密度性状的遗传标记辅助选择提供了一个新的遗传标记资源。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果：

本发明可通过在体外采用基因芯片技术检测猪的基因型，作为非诊断目的的评价猪的肢蹄结实度，与目前的PCR-RFLP等方法相比，本发明具有简单、快捷、灵敏度高和特异性好等突出优点。

更详细的技术方案请参见说明书的《附图说明》及《具体实施方式》中的实施例。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆包括登录号为ALGA0027556VTCN1基因的上下游100bp在内的核苷酸序列，序列长度为201bp，在该序列的101位碱基处的R存在一个A/G等位基因突变。

图1：是本发明的技术路线图。

图2：是本发明涉及ALGA0027556VTCN1基因上下游100bp核苷酸序列和本发明遗传标记的核苷酸序列。附图标记说明：在图2显示核苷酸序列的第101位碱基处存在一个A/G等位基因突变(101bp处的英文字母“R”为突变位点)。

图3：是本发明的曼哈顿图。附图标记说明：黑色圆圈及箭头指向标记的为本发明筛选的遗传标记，该标记位于猪第4号染色体上。

具体实施方式

实施例1：基因分型检测

(1)利用试剂盒法提取猪骨密度相关群体的耳朵组织基因组DNA

本实施例的试剂盒采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取离心柱型试剂盒，由天根生化科技(北京)有限公司生产。具体步骤为：

1)将骨密度相关群体(品种为丹系大白猪和长白猪，由广西扬翔股份有限公司提供，实施本发明不现定于所述的品种)的耳样组织，用眼科剪剪碎至糊状，加入200ulGA(试剂盒自带)，并震荡混匀，然后放入56℃水浴锅中消化过夜。

2)将消化后的组织样品加入200ul缓冲液GB(试剂盒自带)，充分颠倒混匀，并70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管壁上的水珠。

3)加入200ul无水乙醇，充分震荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管壁上的水珠。

4)将上一步所得溶液及絮状沉淀一并加入吸附柱CB3中，并将吸附柱放入收集管中， 12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放回收集管中。

5)向吸附柱CB3中加入500ul缓冲液GD(试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中。

6)向吸附柱CB3中加入600ul漂洗液PW(试剂盒自带)，12000rpm离心30s，倒掉废液，并将吸附柱放入收集管中，并重复该步骤。

7)将吸附柱CB3置于室温下放置数分钟，以彻底晾干吸附柱材料中剩余的漂洗液。

8)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，并向吸附柱膜中间部位悬空滴加50-200ul的洗脱液TE(试剂盒自带)，室温下放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

(2)SNP基因型的判定及质量控制

使用美国GeneSeek Porcine 50K基因芯片进行分型，并对基因型数据进行质检，最终有896 个个体和48909个SNP用于GWAS研究。

实施例2：本发明的遗传标记在基因分型和在猪肢蹄骨密度性状关联分析中的应用

(1)ALGA0027556遗传标记分型结果与肢蹄骨密度性状关联分析

用于猪的基因分型与猪肢蹄骨密度性状关联检测分析所试验猪群来自广西扬翔股份有限公司培育的纯种母猪群体，包括大白猪、长白猪(为常规品种)。基因分型所用的DNA由纯种大白猪、长白猪(说明书正文和表中所称的“纯种大白猪、长白猪”简称“猪”)耳样提取。采用基于单标记关联回归模型的方法，采用个体的性别作为固定效应，在利用R统计环境下的GenABEL软件包进行GWAS分析。

回归分析模型如下：Y＝Xb+Sα+Zu+e

其中：Y代表“表型值向量”(the vector of phenotypes)；b代表“固定效应(包括性别)的估计值及表型值均值μ”；α代表“SNP的替换效应”；u代表“随机加性遗传效应”；服从多维正态分布， u～N(0,Gσα²)，G表示基因组相似度矩阵(基于SNP标记)，G表示多基因加性方差(通过此方差进行遗传力的估计)；X、S、Z分别为b、σ、u的关联矩阵(incidencematrix)；e代表“残差向量”(a vector of residual errors)，服从正态分布，e～N(0,Iσe²)，表示残差方差。

关联分析结果见表1。

表1 ALGA0027556基因片段多态性不同基因型对母猪骨密度的影响

表1说明：P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。

由表1可知，基因型为AA型的猪的个体肢蹄骨密度显著高于AG型和GG个体，所以A是有利于骨密度增加的等位基因。

附录：关于基因芯片技术的说明：

本发明使用Illumina公司研制PorcineSNP50BeadChip全基因组芯片，该芯片包含超过 50000个SNP位点，覆盖猪的基因组。该芯片整合了多种猪的基因差异，其中包括常见的杜洛克猪，长白猪，皮特兰猪和大白猪，能提供足够的SNP密度，可应用于全基因组关联分析中。

主要参考文献

[1]柳小春等，大约克夏猪和长白猪肢蹄结实度的遗传分析[J].，中国农业科学,1991, 24(5):7-14；

[2]Rüegsegger P.[The use of bone density measurements in thediagnosis and therapy of osteoporosis][J]，Therapeutische Umschau Revue Thérapeutique,1991,48(2):113；

[3]杨小明等，双能X线骨密度仪与定量CT测量骨密度的比较[J]，中国组织工程研究，2004， 8(12):2328-2329；

[4]Jorgensen B,Andersen S.Genetic parameters for osteochondrosis inDanish Landrace and Yorkshire boars and correlations with leg weakness andproduction traits.Animal Science.，2000,71: 427-434；

[5]候利娟等，猪肢蹄结实度的遗传解析进展，猪业科学2013:94-7；

[6]Scholz AM,Bünger L,Kongsro J,et al.Non-invasive methods for thedetermination of body and carcass composition in livestock:dual-energy X-rayabsorptiometry,computed tomography, magnetic resonance imaging andultrasound:invited review[J].Animal,2015,9(7):1250-1264；

[7]阙广良，种猪肢蹄病的病因及治疗，兽医导刊，2017，7:36-37；

[8]Daha N A,Lie B A,Trouw L A,et al.Novel genetic association of theVTCN1region with rheumatoid arthritis[J].Annals of the Rheumatic Diseases,2012,71(4):567；

[9]Albers H M,Reinards T H,Brinkman D M,et al.Genetic variation inVTCN1(B7-H4)is associated with course of disease in juvenile idiopathicarthritis[J].Annals of the Rheumatic Diseases,2014,73(6):1198；

[10]徐胜前等，类风湿性关节炎患者骨密度变化的临床研究[J]，临床内科杂，2004， 21(11):763-765。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 与母猪肢蹄骨密度相关的VTCN1基因的SNP遗传标记

<141> 2018-05-02

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 201

<212> DNA

<213> 猪(Sus scrofa)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(201)

<220>

<221> mutation

<222> (101)..(101)

<400> 1

ccagctcaga gagcttacga tgtgaggctc cccgatggtt tccccagcct acggtggtct 60

gggcatccca ggttgaccag ggagccaact tctcagaagt gtccaacacc agctttgagc 120

tgaaccctga gaatgtcacc atgaaggttg tgtccgtgct ctacaacgtc acaatcaaca 180

ccacatactc ctgtatgatt g 201

Claims (1)

1.一种遗传标记在母猪肢蹄骨密度性状标记辅助选择中的应用，所述母猪品种为丹系大白猪和长白猪，所述肢蹄骨密度性状为肢蹄结实度，所述遗传标记的核苷酸序列如下所示：

CCAGCTCAGAGAGCTTACGATGTGAGGCTCCCCGATGGTTTCCCCAGCCTACGGTGGTCTGGGCATCCCAGGTTGACCAGGGAGCCAACTTCTCAGAAGTRTCCAACACCAGCTTTGAGCTGAACCCTGAGAATGTCACCATGAAGGTTGTGTCCGTGCTCTACAACGTCACAATCAACACCACATACTCCTGTATGATTG，

上述序列的101位碱基处的R是A或G， 基因型为AA型的猪的个体肢蹄骨密度显著高于AG型和GG个体，A是有利于骨密度增加的等位基因。

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