CN108350436A - 噬菌体展示载体和使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及适用于在噬菌体M13表面上将蛋白展示为与表面蛋白P.III的融合构建体的载体，在噬菌体外壳表面上包含突变的P.III蛋白的噬菌体M13颗粒，以及用于产生噬菌体M13颗粒的方法以及用于转染或感染包含本发明的载体和噬菌体的宿主细胞的方法。

Description

噬菌体展示载体和使用方法
本发明处于噬菌体展示技术领域中。更具体地，本发明涉及适用于在噬菌体M13颗粒表面上展示包含表面蛋白P.III的融合蛋白的载体，以及使用方法和包含其的组合物。
目前的噬菌体展示技术允许在噬菌体颗粒表面上生成和展示异源肽文库。噬菌体展示的原理基于作为与噬菌体表面外壳蛋白的融合蛋白的一部分的目标肽的呈递。简而言之，编码目标肽的核苷酸序列与编码噬菌体表面外壳蛋白的基因符合读框地克隆以生成融合产物，其在噬菌体装配后作为外壳表面的一部分表达或“展示”。然后可以针对靶标或抗原筛选表达的肽文库以鉴定潜在的肽配体用于进一步优化或亲和力成熟。
噬菌体M13是用于经由噬菌体展示表达异源肽和抗体片段的常用噬菌体的实例。丝状M13噬菌体装配发生在细菌内膜中。使用细菌蛋白合成机器在细胞质中合成噬菌体外壳蛋白，然后通过不同的信号肽将其导向至周质。功能性M13噬菌体颗粒包含称为P.III、P.VI、P.VII、P.VIII和P.IX的五种类型的表面外壳蛋白。尽管所有这五种蛋白都已用于在M13颗粒表面上展示外源肽，但次要外壳蛋白P.III最常用于将目标肽锚定至噬菌体外壳表面。(Methods in Molecular Biology, Vol. 178, Antibody Phage Display: Methods and Protocols, 由O’Brien和Aitken编辑) P.III以五个拷贝存在于M13噬菌体的近端并在噬菌体感染性、装配和稳定性中发挥重要作用。P.III表达为406个氨基酸的多肽并且由三个不同区域构成：N1、N2和C端(CT)结构域(Russel等人, Introduction to Phage Biology and Display, Phage Display: A Laboratory Manual; Cold Spring HarborLab. Press.) N1结构域在感染期间参与病毒DNA向细菌(大肠杆菌)宿主的易位，而N2结构域通过附着于细菌F菌毛而赋予宿主细胞识别。CT结构域在装配期间参与将P.III蛋白锚定至噬菌体外壳。(Omidfar等人, Advances in Phage Display Technology for Drug Discovery, Expert Opin. Drug Discov, (2015))。
噬菌体展示系统可以根据用于细菌宿主细胞感染的载体的类型进行分类。对于P.III融合产物的展示，通常使用3型和33型载体。(Omidfar等人 (2015))。3型载体包含一个拷贝的编码P.III蛋白的基因(g.III基因)，编码目标外源肽的基因可以与其符合读框地克隆。作为结果，每种肽以5个拷贝展示在噬菌体上，每种都与表达的P.III蛋白融合。尽管使用3型载体是展示短肽(例如12个氨基酸或更少)的有效方式，但较长肽的展示基本上降低了噬菌体感染性并因此降低了其扩增(滴度)，因此阻止构建高度多样化的肽文库。33型载体包含两个拷贝的g.III基因 - 野生型拷贝和重组拷贝。野生型和重组g.III基因编码具有相同氨基酸序列的P.III蛋白，然而它们在核苷酸序列上不同并且使用不同的信号肽序列表达。例如，由野生型g.III编码的P.III蛋白可以与内源18-氨基酸信号序列一起表达，而由重组g.III编码的P.III可以与周质信号序列一起表达。
使用33型系统，编码外源蛋白或肽的基因可以与一个拷贝的g.III基因(即野生型或重组基因)符合读框地克隆，允许在噬菌体外壳表面上展示具有降低的空间位阻的目标肽。因此，33型载体耐受较大外源肽的展示，尽管拷贝数较低。然而，较低的拷贝数对靶标特异性肽的成功分离产生了限制，因为在亲和力成熟之前，肽对它们的靶标具有较低的亲和力。较低的亲和力和较低的展示水平的组合阻碍了从肽变体的大合并物中检测靶标特异性肽。
根据本发明，已经鉴定了一种改进的33型噬菌体载体系统和使用方法，使得肽，例如长度最长达35个氨基酸的肽可以成功地以多拷贝展示在M13噬菌体表面上。在该系统中，通过在野生型g.III基因中引入限定的突变来实现目标肽的改进的展示。这些突变降低由突变的野生型g.III基因编码的多肽在噬菌体表面上的并入。作为结果，在噬菌体上展示更高拷贝的由重组g.III基因编码的P.III蛋白。当与重组g.III基因产物融合或符合读框地克隆至重组g.III基因产物时，这导致外源目标肽的更高展示水平。此外，本发明的载体和方法允许生成这样的噬菌体M13颗粒，当在噬菌体外壳表面上展示长度最长达35个氨基酸的肽时，所述噬菌体M13颗粒维持水平与野生型噬菌体M13相当的噬菌体感染性。
因此，本发明提供了33型噬菌体M13载体，其包含编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的第一多核苷酸序列和编码如由SEQ ID NO:2给出的多肽序列的第二多核苷酸序列。作为上面提及的噬菌体M13载体的一个具体实施方案，所述第一多核苷酸序列由SEQ IDNO:3给出，且所述第二多核苷酸序列由SEQ ID NO:4给出。作为上面提及的载体的另一个具体实施方案，所述载体进一步包含编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列，其与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。作为上面提及的载体的一个进一步具体实施方案，所述载体包含如由SEQ ID NO:15给出的多核苷酸序列。作为任何上面提及的载体的一个甚至进一步具体实施方案，所述载体是双链多核苷酸分子。
作为另一个实施方案，本发明提供了如上所述的任何33型噬菌体M13载体，其进一步包含编码外源多肽(且具体地长度最长达35个氨基酸的外源多肽)的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆，或与编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。更具体地，将编码外源肽的多核苷酸序列与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列或与编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列经由在编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列或编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列上游的编码肽接头的多核苷酸序列符合读框地克隆。更具体地，所述外源多肽长度为7至35个氨基酸。
在又另一个实施方案中，本发明提供了用于产生噬菌体M13颗粒的方法，其包括：(a)用双链33型噬菌体M13载体转染细菌宿主细胞，所述双链33型噬菌体M13载体包含编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的第一多核苷酸序列和编码如由SEQ ID NO:2给出的多肽序列的第二多核苷酸序列，(b)在适合于表达所述第一和第二多核苷酸序列并且在所述细菌宿主细胞中装配噬菌体M13颗粒的条件下孵育所述细菌宿主细胞，和(c)从所述细菌宿主细胞回收噬菌体M13颗粒，所述噬菌体M13颗粒包含独立地展示在噬菌体M13外壳表面上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列给出的多肽序列。对于该实施方案更具体地，所述第一多核苷酸序列由SEQ ID NO:3给出，且所述第二多核苷酸序列由SEQ ID NO:4给出。作为另一个具体实施方案，本发明提供了任何上面提及的方法，其中所述双链噬菌体M13载体进一步包含编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列，其与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。作为又另一个具体实施方案，所述双链噬菌体M13载体包含如由SEQ ID NO:15给出的多核苷酸序列。甚至更具体地，本发明提供了任何上面提及的方法，其中所述双链M13载体进一步包含编码外源多肽(且具体地长度最长达35个氨基酸的外源多肽)的多核苷酸序列，其与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆，或与编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。作为另一个具体实施方案，将编码外源多肽的多核苷酸序列与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列或与编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列经由在编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列或编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列上游的编码肽接头的多核苷酸序列符合读框地克隆。更具体地，所述外源多肽长度为7至35个氨基酸。作为上面提及的方法的另一个具体实施方案，所述细菌宿主细胞是F+细菌菌株，诸如XL-1 Blue大肠杆菌细胞或XLO大肠杆菌细胞。
在又另一个实施方案中，本发明提供了噬菌体M13颗粒，其中所述颗粒包含独立地展示在噬菌体颗粒外壳表面上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列给出的多肽序列。更具体地，本发明提供了上面提及的噬菌体M13颗粒，其中所述颗粒进一步包含与由SEQ ID NO:1的氨基酸序列给出的多肽序列的N端融合的合适的检测标签序列。再更具体地，本发明提供了任何上面提及的噬菌体M13颗粒，其中所述颗粒进一步包含与由SEQ IDNO:1的氨基酸序列给出的多肽序列的N端或与合适的检测标签序列的N端融合的外源多肽，且具体地长度最长达35个氨基酸的外源多肽。在另一个具体实施方案中，将所述外源多肽与由SEQ ID NO:1的氨基酸序列给出的多肽序列或与合适的检测标签序列经由与由SEQ IDNO:1给出的多肽序列的N端或与合适的检测标签序列的N端和外源多肽的C端融合的肽接头进行融合。更具体地，与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列或与检测标签序列融合的外源多肽长度为7至35个氨基酸。
在又另一个实施方案中，本发明提供了用于感染细菌宿主细胞的方法，其包括使所述细菌宿主细胞与噬菌体M13颗粒接触，所述噬菌体M13颗粒包含独立地展示在噬菌体M13颗粒外壳表面上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列给出的多肽序列。更具体地，本发明提供了上面提及的方法，其中所述噬菌体M13颗粒进一步包含与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的N端融合的合适的检测标签序列。再更具体地，本发明提供了任何上面提及的方法，其中所述噬菌体M13颗粒进一步包含与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的N端或与合适的检测标签序列的N端融合的外源多肽，且具体地长度最长达35个氨基酸的外源多肽。更具体地，将所述外源多肽与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列或与合适的检测标签序列经由与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的N端或与合适的检测标签序列的N端和外源多肽的C端融合的肽接头进行融合。更具体地，与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列或与检测标签序列融合的外源多肽长度为7至35个氨基酸。作为上面提及的方法的另一个具体实施方案，所述细菌宿主细胞是F+细菌菌株，诸如XL-1 Blue大肠杆菌细胞或XLO大肠杆菌细胞。
当使用33型噬菌体M13载体用于表达和展示P.III蛋白融合产物时，由野生型和重组g.III基因编码的P.III蛋白竞争装配成噬菌体颗粒。本领域的先前工作表明，Sec信号序列的c-区域中的切割位点和h-区域中的一些残基的修饰可以导致使用3 + 3载体系统的噬菌体颗粒上展示的抗体片段的表达增强。(Lee等人, Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 411 (2011); 348-353)与现有技术相比，本发明的目标是影响周质中表达的由野生型和重组g.III基因编码的基因产物有利于由重组g.III基因编码的P.III蛋白的比率。作为本发明的结果，实现了由重组g.III基因编码的P.III蛋白的相对表达和展示的增加，其进而导致当编码外源肽的核苷酸序列与重组g.III基因符合读框地克隆时此类外源肽的增加展示。
定义
如本文所用，“载体”是指能够将其已经连接的另一核酸序列(或多个核酸序列)转运至宿主细胞或基因组中的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接额外的DNA区段的环状DNA环，通常为双链。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接至病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体)。此外，某些载体能够指导基因(例如编码目标外源肽或蛋白的基因)的表达，它们当与适当的控制序列诸如启动子和操纵子序列以及复制起始位点组合时可操作连接至所述基因。此类载体通常被称为“表达载体”，并且还可以包括用于插入编码目标蛋白的基因的多克隆位点。或者，编码目标肽或蛋白的基因可以通过定点诱变技术诸如Kunkel诱变来引入。(Handa等人, Rapid and Reliable Site-Directed Mutagenesis Using Kunkel’s Approach, Methods in Molecular Biology, vol 182: In VitroMutagenesis Protocols, 第2版)。
如本文所用，“33型噬菌体M13载体”是指能够将噬菌体M13基因组的核酸序列转运至宿主细胞或基因组中的“载体”，并且除了由噬菌体M13基因组编码的每种剩余蛋白(P.I、P.II、P.IV – P.XI)的编码区域之外，包含两个拷贝的P.III表面蛋白(即，野生型和重组g.III基因)的编码区域。本发明的33型噬菌体M13载体在g.III基因的野生型拷贝中含有突变，其编码具有不同于由(未突变的)野生型g.III和重组g.III基因编码的P.III表面蛋白的氨基酸序列的多肽。
“外源”或“外来”肽、多肽或蛋白是指由通常不存在于待表达核酸的宿主细胞或基因组中的核酸序列编码的肽、多肽或蛋白。
如本文所用，“合适的检测标签”或“合适的检测标签序列”是指可以通过重组技术移植或融合至另一种目标蛋白或肽的肽序列。将标签序列移植至目标蛋白允许检测蛋白，例如通过使用针对标签肽序列的抗体检测蛋白。合适的检测标签序列的确定完全在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明中的典型检测标签序列包括c-myc标签、HA-标签、His-标签、Flag-标签和S-标签。
如本文所用，“符合读框地克隆”是指将核酸序列(例如编码特定目标多肽的核酸序列)插入参考核酸或基因(例如，编码目标多肽待与之融合的单独蛋白的基因)的相同开放阅读框中。如本领域技术人员将理解，插入核酸可以与参考基因连续插入，或者其可以通过使用也符合读框地克隆的编码接头的序列在空间分离的位点处插入。此外，插入核酸可以在参考核酸序列的上游或下游插入。如本文所用，“上游”是指目标核酸序列相对于参考核酸或基因的放置或位置，使得目标序列在翻译期间在参考核酸或基因之前翻译。同样，如本文所用，“下游”是指目标核酸序列相对于参考核酸或基因的放置或位置，使得目标序列在翻译期间在参考核酸或基因之后翻译。
如本文所用的“肽接头”是指将第一肽或蛋白融合或连接至第二肽或蛋白的多肽序列。接头多肽序列的N端通过酰胺键共价连接至第一肽或蛋白的C端，而接头多肽序列的C端也通过酰胺键共价连接至第二肽或蛋白的N端。适用于本发明中的典型肽接头包括含丝氨酸的肽，诸如-(G3SG)n-和-(G4S)n-肽序列和α-螺旋接头诸如-AEAAAKEAAAKEAAAKA- (SEQID NO:34)、-AEAAAKEAAAKEAAAKAGGGGS- (SEQ ID NO:35)和-AEAAAKEAAAKEAAAKAGPPGP-(SEQ ID NO:36)。
当从左至右读取时，如本文公开的多肽链通过它们从N端至C端的氨基酸序列来描绘，其中每个氨基酸由其单字母或三字母氨基酸缩写代表。氨基酸或多肽链的“N端”(或氨基端)是指氨基酸上的游离氨基或多肽链的第一个氨基酸残基上的游离氨基。同样，氨基酸或多肽链的“C端”(或羧基端)是指氨基酸上的游离羧基或多肽链的最后一个氨基酸残基上的游离羧基。
载体工程改造
使用Kunkel诱变(Handa等人, Rapid and Reliable Site-Directed Mutagenesi Using Kunkel’s Approach, Methods in Molecular Biology, vol 182:In VitroMutagenesis Protocols, 第2版)，将由野生型g.III基因编码的P.III蛋白的N1区域的前67个氨基酸随机化为不同的氨基酸，同时监测与由重组g.III基因编码编码的P.III蛋白融合的检测标签序列、例如c-myc蛋白(EQKLISEEKL:SEQ ID NO:7)的展示水平。将编码检测标签序列的核苷酸序列，例如编码c-myc的序列(gagcaaaagctcattagtgaagaggatctt:SEQ IDNO:8)，与重组g.III基因符合读框地克隆。使用缺乏功能性dUTPase和尿嘧啶糖基化酶的大肠杆菌菌株RZ1032 (ATCC 39737)来制备亲本33型噬菌体M13载体(SEQ ID NO:6)的含有尿嘧啶的单链DNA。67个诱变引物被分成四个不同的Kunkel反应，其中三个反应覆盖十七个突变，且一个反应覆盖十六个突变。反应组中的每个引物含有对应于待完全随机化的氨基酸的NNK密码子，并被设计为与亲本载体共享相同的侧接序列以确保所有引物将以相当的效率与模板退火。
在突变亲本载体后，将修饰的载体用作模板以制备双链DNA，然后通过电穿孔将其转染入细菌宿主细胞(例如大肠杆菌XL1-Blue细胞)中用于表达噬菌体M13颗粒。在筛选M13噬菌体文库前，将来自每个文库的随机噬菌体进行测序以确保每个位置被完全随机化为全部20个氨基酸，而对于特定氨基酸没有任何偏向。
噬菌体收获和滴度测定
在过夜扩增之后，可以如下收获噬菌体：将感染的细菌宿主细胞(例如XL-1 Blue细胞)以3,000 rpm离心约20分钟。然后将40 ml上清液转移至新鲜烧瓶中，并通过添加10mL PEG溶液(20％PEG，包括3.5 M NH4OAc)并在4℃下孵育约90分钟来沉淀噬菌体。然后将混合物以13,000 rpm离心约45分钟。然后将沉淀重悬浮于1 ml PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)中，并以13,000 rpm离心5分钟以除去残余的细胞碎片。然后将上清液转移至新鲜试管中，添加200μl PEG溶液，并将混合物在冰上孵育约30分钟。然后将混合物在4℃下以13,000 rpm离心约45分钟。将所得沉淀重悬于200-500μl PBS中，并以13,000 rpm离心约5分钟，以除去残余的细胞碎片。然后将上清液转移至新鲜试管中并重复离心过程，直至不存在细菌细胞残余物。
然后可以如下将上清液转移至新鲜管中用于测定滴度：制备含有噬菌体的上清液的系列稀释液，且然后将100μl各稀释液添加至新管中，随后添加300μl已经允许过夜生长的细菌细胞(例如，XL1-Blue细胞)。将混合物在室温下孵育约15分钟，然后向每个管中添加3 ml软琼脂。(可以如下制备软琼脂：用50 ml LB培养液(lysogeny broth, LB)填充250 ml瓶，添加2.08 Bacto琼脂粉(Fisher DF0140-01-1)，然后旋转以混合。将适量(Q.S.)混合物与额外LB至250 ml，高压灭菌45分钟并储存在55℃下)。将混合物短暂涡旋，然后添加至LB板并在37℃下孵育过夜。然后将所得噬菌斑计数并测定滴度为噬菌斑形成单位(pfu)。
噬菌体感染和扩增
为了扩增特定噬菌体克隆，可以采用以下程序：在37℃同时摇动下，在50 ml补充有四环素的2YT培养基中培养细菌宿主细胞(例如XL1-Blue细胞(Stratagene))的单一菌落至0.4-0.6 OD600的密度。将近似108 pfu (噬菌斑形成单位)的噬菌体添加至细菌培养物中，且然后将混合物在37℃下孵育约30分钟，同时静置以允许噬菌体感染。然后将感染的细胞培养物在37℃下孵育12-15小时，同时摇动以允许噬菌体扩增。
噬菌体M13筛选
捕获滤器升高测定法：
为了鉴定导致与由重组g.III基因编码的P.III蛋白融合的c-myc的更高展示的突变，可以使用捕获滤器升高测定法(Wu, Simultaneous Humanization and Affinity Optimization of Monoclonal Antibodies, Methods in Molecular biology, Vol.2017. Recombinant Antibodies for Cancer Therapy: Methods and Protocols, 由Weischof和Krauss编辑)。简而言之，将硝酸纤维素滤器用2μg/ml的抗噬菌体M13抗体(GEBiosciences 27-9420-01)包被，且然后在噬菌斑升高之前用酪蛋白封闭。通过抗c-myc抗体-碱性磷酸酶缀合物(SIGMA A5963)检测c-myc展示水平，其中噬菌斑展示出呈现较深颜色的c-myc蛋白的较高展示水平。然后分离具有更高展示水平的c-myc标签的噬菌斑用于测序。可以扩增携带导致更强的c-myc信号的突变的测序的M13噬菌体，用于进一步筛选，包括单点和噬菌体滴度依赖性ELSIA，如下面进一步描述。
单点和噬菌体滴度依赖性ELISA：
对于单点ELISA，使用2-ml XL1-blue细菌培养物过夜扩增具有增强的c-myc展示水平的单个噬菌体M13噬菌体(例如通过滤器升高测定法鉴定)。在扩增后，将培养物离心并将上清液(含有噬菌体)用于测定中。简而言之，将ELISA板用抗噬菌体M13抗体(GE Biosciences27-9420-01)包被过夜并用酪蛋白封闭。添加含M13噬菌体的上清液，并通过与碱性磷酸酶缀合的抗c-myc抗体(SIGMA A5963)检测c-myc展示。使用适当的底物，通过测量适当波长处的OD，通过分光光度法测定C-myc展示水平。表现出较高c-myc肽展示水平的噬菌体可以在滴度依赖性噬菌体ELISA中进一步证实，其中单个克隆的c-myc展示水平在一定滴度范围内测定，并与通过用亲本载体(即，含有野生型g.III基因(没有突变)和与重组g.III基因符合读框地克隆的c-myc蛋白的载体)转染获得的克隆的c-myc展示水平进行比较。
实施例1
在噬菌体M13表面上展示c-myc标签-P.III融合体
使用包含在lacZ启动子的控制下的野生型g.III基因(SEQ ID NO:5)和重组g.III基因(SEQ ID NO:3)的33型噬菌体M13亲本载体(每种基因编码P.III表面蛋白的拷贝)且使用分别编码内源P.III和pelB信号肽的核苷酸序列(SEQ ID NO:17和19)，基本上如上所述将野生型g.III的N1区域中的单个氨基酸随机化。构建包含在成熟野生型g.III基因产物中编码L8P或S11P取代的突变的修饰的载体并将其转染至大肠杆菌XL1-Blue细胞中以表达与重组g.III基因符合读框且在其上游克隆的编码c-myc标签的序列(SEQ ID NO:8)。将所得P.III-c-myc融合蛋白展示在收获的M13颗粒的表面上，并且通过噬菌体 - 滴度依赖性ELISA检测c-myc展示水平，基本上如上所述。
下表1提供了亲本和突变的野生型g.III基因、重组g.III基因、编码c-myc标签的序列、编码信号肽的序列的核酸序列和由此编码的所得氨基酸序列。表2提供了噬菌体-滴度依赖性ELISA的结果。
表1
。
表2
噬菌体滴度(pfu/孔) 亲本，野生型g.III基因(OD560) 突变的，编码L8P取代的野生型g.III基因(OD560) 突变的，编码S11P取代的野生型g.III基因(OD560)
0 0.1364 0.1057 0.137
7.80E+06 0.1473 0.126 0.1434
1.60E+07 0.1449 0.1356 0.1357
3.10E+07 0.1451 0.1381 0.1423
6.30E+07 0.1663 0.1422 0.159
1.30E+08 0.1505 0.1488 0.1711
2.50E+08 0.142 0.1629 0.1887
5.00E+08 0.1777 0.1949 0.2283
1.00E+09 0.1753 0.2347 0.2805
2.00E+09 0.2047 0.4117 0.4519
4.00E+09 0.3157 0.8489 0.9137
表2提供了通常如上所述的来自使用PMP/AMP底物的滴度依赖性ELISA的OD560值，并且表明当使用含有编码成熟、野生型g.III基因产物中的L8P或S11P取代的突变的33型M13噬菌体载体时，获得与由重组g.III基因编码的P.III表面蛋白融合的c-myc蛋白的增加表达。
实施例2
在噬菌体M13表面上展示测试肽-PIII融合体(在WT g.III基因中具有组合的8P + 11P突变)
构建了包含编码成熟野生型g.III基因产物(SEQ ID NO:2)中的L8P和S11P取代的突变的进一步修饰的33型噬菌体M13载体。编码所述基因产物的示例性核酸序列由SEQ ID NO:4给出。在相同的载体中，编码测试肽的核酸序列(如下文SEQ ID NO:10、12和14给出)分别经由编码接头肽的序列符合读框地克隆至编码c-myc标签的序列(SEQ ID NO:8)，其进而在载体中与重组g.III基因序列(SEQ ID NO:3)符合读框且在其上游克隆。还将相同的编码测试肽的核酸序列各自分别(以与上述相同的方式和格式)克隆至亲本33型噬菌体M13载体中，所述载体不包含野生型g.III基因中的编码L8P或S11P的核酸突变(SEQ ID NO:5提供了没有编码L8P或S11P的突变的亲本野生型g.III基因的核酸序列)。
表3提供了制备的示例性载体克隆的突变和亲本野生型g.III基因、重组g.III基因、编码c-myc标签的序列、编码接头肽的序列和编码测试肽的序列的核酸序列。
所得载体用于在从XL-1 blue细菌细胞收获的M13噬菌体颗粒的表面上展示测试肽-PIII融合蛋白。所用的测试肽与人IL-6靶蛋白结合，如下文进一步描述。表4提供了收获的M13噬菌体颗粒上展示的融合蛋白产物的组分的相应氨基酸序列。
表3
a 用含有编码L8P和S11P取代的突变的突变的野生型g.III基因(即SEQ ID NO:4)或亲本野生型g.III基因(即SEQ ID NO:5)制备载体克隆。
表4
a展示的融合蛋白包含含有L8P和S11P取代的突变的野生型g.III基因产物(即，SEQ IDNO:2)或亲本野生型g.III基因产物。
将收获的展示测试肽-P.III融合蛋白的噬菌体扩增并进行滴度测定，通常如上文所述。然后通过噬菌体-滴度依赖性ELISA测定测试肽展示水平，基本上如下所述：
将ELISA板(Greiner-bio-one，目录号：650061)在PBS中以2μg/ml用50μl/孔的NeutrAvidin (Thermo Scientific，目录号：31050)包被，并使其在4℃下放置过夜。通过在室温下添加100μl/孔的酪蛋白(Thermo Scientific，目录号：37528) 1小时来封闭过量位点。然后将50μl/孔的PBS中的生物素化的人IL6 (R&D Systems，目录号206-IL-010/CF)添加至各孔中，并将板在摇动的同时在室温下孵育30分钟。然后添加50μl/孔的不同滴度的噬菌体，并将噬菌体稀释于PBS中最终浓度为1％的BSA中。然后将板在室温下摇动的同时孵育60分钟。然后添加50μl/孔的在0.1% tween/PBS中1:5,000稀释的抗M13-HRP (G.E.，目录号：27-9421-01)，随后将板在室温下孵育60分钟。然后添加50μl/孔的Ultra四甲基联苯胺底物(Ultra TMB底物，Thermo Scientific，目录号：34029)，并测定650nm处的OD。
下表5提供了在一定噬菌体滴度范围的噬菌体克隆18-24、18-22和18-4获得的OD650值，所述噬菌体克隆18-24、18-22和18-4各自分别用编码野生型g.III基因中的编码L8P和S11P的突变的33型噬菌体M13载体和亲本33型噬菌体M13载体(在野生型g.III基因中没有编码L8P和S11P的突变)制备。
表5
a 用含有野生型g.III基因(不编码L8P和S11P取代)的33型噬菌体M13载体制备的噬菌体克隆。
b 用含有突变的野生型g.III基因(编码L8P和S11P取代)的33型噬菌体M13载体制备的噬菌体克隆。
表5中的OD650值表明，当使用含有编码成熟的野生型g.III基因产物中的L8P和S11P取代的突变的33型噬菌体M13载体时，获得与由重组g.III基因编码的P.III表面蛋白融合(经由肽接头)的每种测试肽的增加表达。
实施例3
在噬菌体M13表面上展示Fab-P.III融合体
将分别编码如由SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26给出的Fab重链(HC)和轻链(LC)序列的核酸序列克隆至包含编码成熟野生型g.III基因产物中的L8P和S11P取代的33型噬菌体M13载体中。使用编码PhoA1信号肽的序列(SEQ ID NO:30)将编码Fab HC的核酸序列(SEQ IDNO:27)经由编码间隔区的序列符合读框且在其上游克隆至编码HA-标签的序列(SEQ IDNO:32)和编码c-myc标签的序列(SEQ ID NO:8)，其进而在载体中与重组g.III基因序列(SEQ ID NO:3)符合读框且在其上游克隆。使用编码pelB信号肽的序列(SEQ ID NO:19)将编码Fab LC的核酸序列(SEQ ID NO:28)分别克隆至载体中。编码HC和LC Fab的组分的转录在lacZ启动子的控制下。
制备包含如上所述的Fab HC和LC序列的双链载体并用于转染大肠杆菌XL1-Blue细胞，基本上如前所述。LC序列(SEQ ID NO:26)分泌至细菌周质空间中，在所述细菌周质空间中，其与经由HA-标签(SEQ ID NO:31)和c- myc标签(SEQ ID NO:7)融合至重组P.III蛋白的HC序列(SEQ ID NO:25)形成Fab二聚体。
将收获的展示Fab-P.III融合蛋白的噬菌体扩增并进行滴度测定，通常如上文所述。然后通过使用生物素化的TNFα作为靶配体的噬菌体-滴度依赖性ELISA来测定Fab展示水平，通常如Nakayama等人, Improving the Copy Number of Antibody Fragment Expressed on the Major Coat Protein of Bacteriophage M13, Immunotechnology,Vol. 12 (1996):197-207中所述。
下表6提供了在一定噬菌体滴度范围的展示Fab构建体的噬菌体克隆获得的OD650值，所述展示Fab构建体的噬菌体克隆分别用编码野生型g.III基因中的编码L8P和S11P的突变的33型噬菌体M13载体和亲本33型噬菌体M13载体(在野生型g.III基因中没有编码L8P和S11P的突变)制备。
表6
噬菌体滴度(pfu/孔) 亲本a (OD650) 噬菌体滴度(pfu/孔) 突变的b (OD650)
0 0.0699 0 0.0548
1.69E+06 0.0791 1.69E+05 0.0846
5.08E+06 0.0857 5.08E+05 0.1067
1.52E+07 0.0913 1.52E+06 0.1791
4.57E+07 0.1092 4.57E+06 0.3578
1.37E+08 0.1712 1.37E+07 0.7649
4.12E+08 0.3803 4.12E+07 1.4751
1.23E+09 0.8396 1.23E+08 1.9562
3.70E+09 1.6574 3.70E+08 2.2079
1.11E+10 2.2358 1.11E+09 2.202
3.33E+10 2.4446 3.33E+09 2.0309
1.00E+11 2.5538 1.00E+10 1.3518
a 用含有野生型g.III基因(不编码L8P和S11P取代)的33型噬菌体M13载体制备的噬菌体克隆。
b 用含有突变的野生型g.III基因(编码L8P和S11P取代)的33型噬菌体M13载体制备的噬菌体克隆。
表6中的OD650值表明，当使用含有编码成熟的野生型g.III基因产物中的L8P和S11P取代的突变的33型噬菌体M13载体时，获得与由重组g.III基因编码的P.III表面蛋白融合(经由肽间隔区)的Fab的增加表达。
序列表
SEQ ID NO:1 (由重组和WT g.III基因编码的成熟的噬菌体M13表面蛋白P.III (无信号肽))
SEQ ID NO:2 (由突变的野生型g.III编码的成熟、突变的噬菌体M13表面蛋白P.III(L8P + S11P氨基酸取代)(无信号肽))
SEQ ID NO:3 (重组g.III基因的核苷酸序列(没有编码信号肽的序列))
SEQ ID NO:4 (突变的、野生型g.III基因(编码L8P + S11P氨基酸取代)的核苷酸序列(没有编码信号肽的序列))
SEQ ID NO:5 (野生型g.III基因的核苷酸序列(没有编码信号肽的序列))
SEQ ID NO:6 (具有重组和WT g.III基因(没有编码L8P和S11P的突变)的亲本33型质粒的核苷酸序列(包括编码信号肽的序列)
SEQ ID NO:7 (c-myc检测标签氨基酸序列)
SEQ ID NO:8 (编码c-myc检测标签的核苷酸序列)
SEQ ID NO:9 (克隆18-24 IL-6结合测试肽序列)
SEQ ID NO:10 (编码克隆18-24 IL-6结合测试肽的核苷酸序列)
SEQ ID NO:11 (克隆18-22 IL-6结合测试肽序列)
SEQ ID NO:12 (编码克隆18-22 IL-6结合测试肽的核苷酸序列)
SEQ ID NO:13 (克隆18-4 IL-6结合测试肽序列)
SEQ ID NO:14 (编码克隆18-4 IL-6结合测试肽的核苷酸序列)
SEQ ID NO:15 (具有重组g.III和突变的WT g.III基因(具有编码L8P和S11P的突变)的33型质粒的核苷酸序列(包括编码信号肽的序列)
SEQ ID NO:16 (编码克隆18-24、18-22和18-4肽接头的核苷酸序列)
SEQ ID NO:17 (编码内源噬菌体M13 P.III信号肽的核苷酸序列)
SEQ ID NO:18 (内源噬菌体M13 P.III信号肽的氨基酸)
SEQ ID NO:19 (编码pelB信号肽的核苷酸序列)
SEQ ID NO:20 (pelB信号肽)
SEQ ID NO:21 (包含L8P取代的成熟WT g.III基因产物的氨基酸序列)(没有信号肽))
SEQ ID NO:22 (包含S11P取代的成熟WT g.III基因产物的氨基酸序列)(没有信号肽))
SEQ ID NO:23 (编码包含L8P取代的成熟、WT g.III基因产物(没有信号肽)的核苷酸序列)
SEQ ID NO:24 (编码包含S11P取代的成熟、WT g.III基因产物(没有信号肽)的核苷酸序列)
SEQ ID NO:25 (Fab_HC氨基酸序列)
SEQ ID NO:26 (Fab_LC氨基酸序列)
SEQ ID NO:27 (编码Fab_HC的核苷酸序列)
SEQ ID NO:28 (编码Fab_LC的核苷酸序列)
SEQ ID NO:29 (Pho A信号肽)
SEQ ID NO:30 (编码Pho A信号肽的核苷酸序列)
SEQ ID NO:31 (HA标签肽)
SEQ ID NO:32 (编码HA标签肽的核苷酸序列)
SEQ ID NO:33 (克隆18-24、18-22和18-4肽接头氨基酸序列)
SEQ ID NO:34 (接头肽)
SEQ ID NO:35 (接头肽)
SEQ ID NO:36 (接头肽)
序列表
<110> Eli Lilly and Company
Afshar, Sepideh
<120> 噬菌体展示载体和使用方法
<130> X20314
<140> PCT/US2016/062806
<141> 2016-11-18
<150> 62/259801
<151> 2015-11-25
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 1
Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Ser His Thr Glu Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn
20 25 30
Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly
35 40 45
Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile
50 55 60
Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro
85 90 95
Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro
100 105 110
Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser
115 120 125
Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg
130 135 140
Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp
145 150 155 160
Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met
165 170 175
Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser
180 185 190
Gly Phe Asn Glu Asp Leu Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser
195 200 205
Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr
260 265 270
Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu
275 280 285
Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly
290 295 300
Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala
305 310 315 320
Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro
325 330 335
Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val
340 345 350
Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser
355 360 365
Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu
370 375 380
Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile
385 390 395 400
Leu Arg Asn Lys Glu Ser
405
<210> 2
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 2
Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Pro Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn
20 25 30
Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly
35 40 45
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50 55 60
Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro
85 90 95
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100 105 110
Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser
115 120 125
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Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp
145 150 155 160
Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met
165 170 175
Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser
180 185 190
Gly Phe Asn Glu Asp Leu Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser
195 200 205
Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu
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Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
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Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr
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Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu
275 280 285
Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly
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Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro
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Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile
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<210> 3
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 3
gccgagacag tggagagctg cctggccaag tcgcacaccg agaacagctt caccaatgtt 60
tggaaggatg ataagaccct ggaccgctat gccaattacg aaggttgctt atggaacgca 120
accggtgtgg ttgtgtgcac aggcgatgag acccaatgct atggcacctg ggtgccgatc 180
ggtctggcaa ttccggagaa cgaaggcgga ggtagcgaag gaggtggaag tgaaggcgga 240
ggatcggaag ggggtggcac aaagccacca gaatatggag acaccccgat tccaggttac 300
acctacatta atccgctgga tggtacatac cctccaggca ccgaacagaa tccggcaaac 360
ccgaacccga gcctggaaga aagccaaccg ctgaacacat ttatgttcca aaacaaccgt 420
tttcgtaacc gtcaaggagc cctgaccgta tacaccggta cagtgaccca gggtacagat 480
ccggtgaaga cctactatca atatacaccg gttagcagca aggcaatgta cgatgcatat 540
tggaatggca agtttcgtga ttgtgcattt catagcggtt tcaacgaaga cctgtttgtg 600
tgcgaatacc agggtcagag cagcgattta ccgcagccac cggttaacgc aggtggtgga 660
agcggagggg gaagtggcgg tgggtcagaa ggcggaggat cggaaggagg tgggagtgaa 720
ggagggggaa gcgaaggagg gggatcagga ggtggtagcg gaagtggcga cttcgactac 780
gagaagatgg ccaatgcaaa caaaggcgca atgacagaga acgcagacga gaatgcactg 840
caaagtgatg caaagggtaa gctggacagc gttgcaaccg actatggagc agcaattgac 900
ggctttatcg gagatgtcag cggtctggcg aacggcaacg gagcaacagg cgacttcgca 960
ggtagcaaca gccagatggc acaggttgga gatggcgaca acagtccgct gatgaacaac 1020
tttcgccagt acctgccgag tctgccacaa agcgtcgagt gccgtccgtt tgttttcggt 1080
gcaggcaagc cgtacgagtt cagcatcgac tgcgataaga ttaatctttt tcgcggagtt 1140
ttcgcattcc tgctgtacgt ggcaacgttc atgtacgttt tcagcacctt cgccaatatc 1200
ttacgcaaca aagaaagc 1218
<210> 4
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 合成构建体
<400> 4
gccgaaactg ttgaaagttg tccggcaaaa ccccatacag aaaattcatt tactaacgtc 60
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acaggcgttg tagtttgtac tggtgacgaa actcagtgtt acggtacatg ggttcctatt 180
gggcttgcta tccctgaaaa tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 240
ggttctgagg gtggcggtac taaacctcct gagtacggtg atacacctat tccgggctat 300
acttatatca accctctcga cggcacttat ccgcctggta ctgagcaaaa ccccgctaat 360
cctaatcctt ctcttgagga gtctcagcct cttaatactt tcatgtttca gaataatagg 420
ttccgaaata ggcagggggc attaactgtt tatacgggca ctgttactca aggcactgac 480
cccgttaaaa cttattacca gtacactcct gtatcatcaa aagccatgta tgacgcttac 540
tggaacggta aattcagaga ctgcgctttc cattctggct ttaatgagga tttatttgtt 600
tgtgaatatc aaggccaatc gtctgacctg cctcaacctc ctgtcaatgc tggcggcggc 660
tctggtggtg gttctggtgg cggctctgag ggtggtggct ctgagggtgg cggttctgag 720
ggtggcggct ctgagggagg cggttccggt ggtggctctg gttccggtga ttttgattat 780
gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct atgaccgaaa atgccgatga aaacgcgcta 840
cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct gtcgctactg attacggtgc tgctatcgat 900
ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct aatggtaatg gtgctactgg tgattttgct 960
ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt gacggtgata attcaccttt aatgaataat 1020
ttccgtcaat atttaccttc cctccctcaa tcggttgaat gtcgcccttt tgtctttggc 1080
gctggtaaac catatgaatt ttctattgat tgtgacaaaa taaacttatt ccgtggtgtc 1140
tttgcgtttc ttttatatgt tgccaccttt atgtatgtat tttctacgtt tgctaacata 1200
ctgcgtaata aggagtct 1218
<210> 5
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 5
gccgaaactg ttgaaagttg tttagcaaaa tcccatacag aaaattcatt tactaacgtc 60
tggaaagacg acaaaacttt agatcgttac gctaactatg agggctgtct gtggaatgct 120
acaggcgttg tagtttgtac tggtgacgaa actcagtgtt acggtacatg ggttcctatt 180
gggcttgcta tccctgaaaa tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 240
ggttctgagg gtggcggtac taaacctcct gagtacggtg atacacctat tccgggctat 300
acttatatca accctctcga cggcacttat ccgcctggta ctgagcaaaa ccccgctaat 360
cctaatcctt ctcttgagga gtctcagcct cttaatactt tcatgtttca gaataatagg 420
ttccgaaata ggcagggggc attaactgtt tatacgggca ctgttactca aggcactgac 480
cccgttaaaa cttattacca gtacactcct gtatcatcaa aagccatgta tgacgcttac 540
tggaacggta aattcagaga ctgcgctttc cattctggct ttaatgagga tttatttgtt 600
tgtgaatatc aaggccaatc gtctgacctg cctcaacctc ctgtcaatgc tggcggcggc 660
tctggtggtg gttctggtgg cggctctgag ggtggtggct ctgagggtgg cggttctgag 720
ggtggcggct ctgagggagg cggttccggt ggtggctctg gttccggtga ttttgattat 780
gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct atgaccgaaa atgccgatga aaacgcgcta 840
cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct gtcgctactg attacggtgc tgctatcgat 900
ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct aatggtaatg gtgctactgg tgattttgct 960
ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt gacggtgata attcaccttt aatgaataat 1020
ttccgtcaat atttaccttc cctccctcaa tcggttgaat gtcgcccttt tgtctttggc 1080
gctggtaaac catatgaatt ttctattgat tgtgacaaaa taaacttatt ccgtggtgtc 1140
tttgcgtttc ttttatatgt tgccaccttt atgtatgtat tttctacgtt tgctaacata 1200
ctgcgtaata aggagtct 1218
<210> 6
<211> 8422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 6
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60
atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120
cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180
gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240
tctgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300
ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360
tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420
cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480
tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540
aaacatttta ctgttacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600
ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660
aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720
atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780
tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840
caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900
ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960
aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020
tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080
gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140
caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200
caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260
gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320
caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380
cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440
tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500
attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560
ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtt gttcctttct 1620
attctcactc cgccgaaact gttgaaagtt gtttagcaaa atcccataca gaaaattcat 1680
ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740
tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800
gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860
ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920
ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980
accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040
agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100
aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160
atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220
atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280
ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340
gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400
attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460
aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520
ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 2580
gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 2640
taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 2700
ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 2760
tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 2820
ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgg gtattccgtt 2880
attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgc ttacttttct 2940
taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctc ttattattgg 3000
gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattac cctctgactt 3060
tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgttttt atgttattct 3120
ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgttt cttatttgga 3180
ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctct ggaaagacgc 3240
tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaata gcaactaatc 3300
ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacg cctcgcgttc 3360
ttagaatacc ggataagcct tctatatctg atttgcttgc tattgggcgc ggtaatgatt 3420
cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtact tggtttaata 3480
cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttcta catgctcgta 3540
aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgat aaacaggcgc 3600
gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaatt actttacctt 3660
ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcct aaattacatg 3720
ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgt tggctttata 3780
ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagt aattatgatt 3840
ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttc aaaccattaa 3900
atttaggtca gaagatgaag cttactaaaa tatatttgaa aaagttttca cgcgttcttt 3960
gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaa cctaagccgg 4020
aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactatt gactcttctc 4080
agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaa ttaattaata 4140
gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgt actgtttcca 4200
ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgtttt cttgatgttt 4260
gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctct gcgcgatttt 4320
gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccga tgtaaaaggt 4380
actgttactg tatattcatc tgacgttaaa cctgaaaatc tacgcaattt ctttatttct 4440
gttttacgtg caaatgattt tgatatggta ggttctaacc cttccattat tcagaagtat 4500
aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatca ggaatatgat 4560
gataattccg ctccttctgg tggtttcttt gttccgcaaa atgataatgt tactcaaact 4620
tttaaaatta ataacgttcg ggcaaaggat ttaatacgag ttgtcgaatt gtttgtaaag 4680
tctaatactt ctaaatcctc aaatgtatta tctattgacg gctctaatct attagttgtt 4740
agtgctccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttcaactgt tgatttgcca 4800
actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtga tgctttagat 4860
ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaa tactgaccgc 4920
ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatgg cgatgtttta 4980
gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtc tgtgccacgt 5040
attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgt cccttttatt 5100
actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagac gattgagcgt 5160
caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcgg taatattgtt 5220
ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaag tgatgttatt 5280
actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagac tcttttactc 5340
ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caggattctg gcgtaccgtt cctgtctaaa 5400
atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ctaacgagga aagcacgtta 5460
tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5520
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5580
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5640
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5700
tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5760
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5820
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaca 5880
caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 5940
caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcgctgg tgaaaagaaa aaccaccctg 6000
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6060
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 6120
cactcattag gcaccccagg cttgacactt tatgcttccg gctcgtataa tgtgtggaat 6180
tgtgagcgga taacaatttc acacgccaag gagacagtca taatgaaata cctattgcct 6240
acggcagccg ctggattgtt attactcgct gcccaaccag ccatggccgg cggaggatct 6300
ggcgagcaaa agctcattag tgaagaggat cttgccgaga cagtggagag ctgcctggcc 6360
aagtcgcaca ccgagaacag cttcaccaat gtttggaagg atgataagac cctggaccgc 6420
tatgccaatt acgaaggttg cttatggaac gcaaccggtg tggttgtgtg cacaggcgat 6480
gagacccaat gctatggcac ctgggtgccg atcggtctgg caattccgga gaacgaaggc 6540
ggaggtagcg aaggaggtgg aagtgaaggc ggaggatcgg aagggggtgg cacaaagcca 6600
ccagaatatg gagacacccc gattccaggt tacacctaca ttaatccgct ggatggtaca 6660
taccctccag gcaccgaaca gaatccggca aacccgaacc cgagcctgga agaaagccaa 6720
ccgctgaaca catttatgtt ccaaaacaac cgttttcgta accgtcaagg agccctgacc 6780
gtatacaccg gtacagtgac ccagggtaca gatccggtga agacctacta tcaatataca 6840
ccggttagca gcaaggcaat gtacgatgca tattggaatg gcaagtttcg tgattgtgca 6900
tttcatagcg gtttcaacga agacctgttt gtgtgcgaat accagggtca gagcagcgat 6960
ttaccgcagc caccggttaa cgcaggtggt ggaagcggag ggggaagtgg cggtgggtca 7020
gaaggcggag gatcggaagg aggtgggagt gaaggagggg gaagcgaagg agggggatca 7080
ggaggtggta gcggaagtgg cgacttcgac tacgagaaga tggccaatgc aaacaaaggc 7140
gcaatgacag agaacgcaga cgagaatgca ctgcaaagtg atgcaaaggg taagctggac 7200
agcgttgcaa ccgactatgg agcagcaatt gacggcttta tcggagatgt cagcggtctg 7260
gcgaacggca acggagcaac aggcgacttc gcaggtagca acagccagat ggcacaggtt 7320
ggagatggcg acaacagtcc gctgatgaac aactttcgcc agtacctgcc gagtctgcca 7380
caaagcgtcg agtgccgtcc gtttgttttc ggtgcaggca agccgtacga gttcagcatc 7440
gactgcgata agattaatct ttttcgcgga gttttcgcat tcctgctgta cgtggcaacg 7500
ttcatgtacg ttttcagcac cttcgccaat atcttacgca acaaagaaag ctaagcaata 7560
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 7620
gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc 7680
ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca 7740
tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc 7800
cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga 7860
cgcgaattat ttttgatggc gttcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 7920
taatgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 7980
cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 8040
acgattaccg ttcatcgatt ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc 8100
ctttgtagat ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatt aatttatcag ctagaacggt 8160
tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt tctcaccctt ttgaatcttt 8220
acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag ggttctaaaa atttttatcc 8280
ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag ggtcataatg tttttggtac 8340
aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg 8400
cctgtatgat ttattggacg tt 8422
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 7
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 8
gagcaaaagc tcattagtga agaggatctt 30
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 9
Arg Thr Phe Cys Lys Glu Phe Gly Arg Tyr Val Ala Asp Glu Thr Tyr
1 5 10 15
Cys Ala Ala Leu
20
<210> 10
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 10
aggacttttt gtaaggagtt tgggcggtat gttgcggatg agacgtattg tgctgcgctt 60
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 11
Ile Ser Leu Cys Asp Gln Pro Tyr Val Lys Ser Leu Asn Leu Pro Leu
1 5 10 15
Cys Pro Leu Ala
20
<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 12
atttctttgt gtgatcagcc gtatgttaag agtcttaatc ttccgttgtg tccgcttgct 60
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Pro Pro Leu Cys Ser Trp Pro Ala Tyr Gln Lys Phe Gly Gly Pro Leu
1 5 10 15
Cys Thr Leu Gly
20
<210> 14
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 14
cctccgctgt gttcttggcc tgcttatcag aagtttggtg gtccgctgtg tacgcttggt 60
<210> 15
<211> 8422
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 15
aatgctacta ctattagtag aattgatgcc accttttcag ctcgcgcccc aaatgaaaat 60
atagctaaac aggttattga ccatttgcga aatgtatcta atggtcaaac taaatctact 120
cgttcgcaga attgggaatc aactgttata tggaatgaaa cttccagaca ccgtacttta 180
gttgcatatt taaaacatgt tgagctacag cattatattc agcaattaag ctctaagcca 240
tctgcaaaaa tgacctctta tcaaaaggag caattaaagg tactctctaa tcctgacctg 300
ttggagtttg cttccggtct ggttcgcttt gaagctcgaa ttaaaacgcg atatttgaag 360
tctttcgggc ttcctcttaa tctttttgat gcaatccgct ttgcttctga ctataatagt 420
cagggtaaag acctgatttt tgatttatgg tcattctcgt tttctgaact gtttaaagca 480
tttgaggggg attcaatgaa tatttatgac gattccgcag tattggacgc tatccagtct 540
aaacatttta ctgttacccc ctctggcaaa acttcttttg caaaagcctc tcgctatttt 600
ggtttttatc gtcgtctggt aaacgagggt tatgatagtg ttgctcttac tatgcctcgt 660
aattcctttt ggcgttatgt atctgcatta gttgaatgtg gtattcctaa atctcaactg 720
atgaatcttt ctacctgtaa taatgttgtt ccgttagttc gttttattaa cgtagatttt 780
tcttcccaac gtcctgactg gtataatgag ccagttctta aaatcgcata aggtaattca 840
caatgattaa agttgaaatt aaaccatctc aagcccaatt tactactcgt tctggtgttt 900
ctcgtcaggg caagccttat tcactgaatg agcagctttg ttacgttgat ttgggtaatg 960
aatatccggt tcttgtcaag attactcttg atgaaggtca gccagcctat gcgcctggtc 1020
tgtacaccgt tcatctgtcc tctttcaaag ttggtcagtt cggttccctt atgattgacc 1080
gtctgcgcct cgttccggct aagtaacatg gagcaggtcg cggatttcga cacaatttat 1140
caggcgatga tacaaatctc cgttgtactt tgtttcgcgc ttggtataat cgctgggggt 1200
caaagatgag tgttttagtg tattcttttg cctctttcgt tttaggttgg tgccttcgta 1260
gtggcattac gtattttacc cgtttaatgg aaacttcctc atgaaaaagt ctttagtcct 1320
caaagcctct gtagccgttg ctaccctcgt tccgatgctg tctttcgctg ctgagggtga 1380
cgatcccgca aaagcggcct ttaactccct gcaagcctca gcgaccgaat atatcggtta 1440
tgcgtgggcg atggttgttg tcattgtcgg cgcaactatc ggtatcaagc tgtttaagaa 1500
attcacctcg aaagcaagct gataaaccga tacaattaaa ggctcctttt ggagcctttt 1560
ttttggagat tttcaacgtg aaaaaattat tattcgcaat tcctttagtt gttcctttct 1620
attctcactc cgccgaaact gttgaaagtt gtccggcaaa accccataca gaaaattcat 1680
ttactaacgt ctggaaagac gacaaaactt tagatcgtta cgctaactat gagggctgtc 1740
tgtggaatgc tacaggcgtt gtagtttgta ctggtgacga aactcagtgt tacggtacat 1800
gggttcctat tgggcttgct atccctgaaa atgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt 1860
ctgagggtgg cggttctgag ggtggcggta ctaaacctcc tgagtacggt gatacaccta 1920
ttccgggcta tacttatatc aaccctctcg acggcactta tccgcctggt actgagcaaa 1980
accccgctaa tcctaatcct tctcttgagg agtctcagcc tcttaatact ttcatgtttc 2040
agaataatag gttccgaaat aggcaggggg cattaactgt ttatacgggc actgttactc 2100
aaggcactga ccccgttaaa acttattacc agtacactcc tgtatcatca aaagccatgt 2160
atgacgctta ctggaacggt aaattcagag actgcgcttt ccattctggc tttaatgagg 2220
atttatttgt ttgtgaatat caaggccaat cgtctgacct gcctcaacct cctgtcaatg 2280
ctggcggcgg ctctggtggt ggttctggtg gcggctctga gggtggtggc tctgagggtg 2340
gcggttctga gggtggcggc tctgagggag gcggttccgg tggtggctct ggttccggtg 2400
attttgatta tgaaaagatg gcaaacgcta ataagggggc tatgaccgaa aatgccgatg 2460
aaaacgcgct acagtctgac gctaaaggca aacttgattc tgtcgctact gattacggtg 2520
ctgctatcga tggtttcatt ggtgacgttt ccggccttgc taatggtaat ggtgctactg 2580
gtgattttgc tggctctaat tcccaaatgg ctcaagtcgg tgacggtgat aattcacctt 2640
taatgaataa tttccgtcaa tatttacctt ccctccctca atcggttgaa tgtcgccctt 2700
ttgtctttgg cgctggtaaa ccatatgaat tttctattga ttgtgacaaa ataaacttat 2760
tccgtggtgt ctttgcgttt cttttatatg ttgccacctt tatgtatgta ttttctacgt 2820
ttgctaacat actgcgtaat aaggagtctt aatcatgcca gttcttttgg gtattccgtt 2880
attattgcgt ttcctcggtt tccttctggt aactttgttc ggctatctgc ttacttttct 2940
taaaaagggc ttcggtaaga tagctattgc tatttcattg tttcttgctc ttattattgg 3000
gcttaactca attcttgtgg gttatctctc tgatattagc gctcaattac cctctgactt 3060
tgttcagggt gttcagttaa ttctcccgtc taatgcgctt ccctgttttt atgttattct 3120
ctctgtaaag gctgctattt tcatttttga cgttaaacaa aaaatcgttt cttatttgga 3180
ttgggataaa taatatggct gtttattttg taactggcaa attaggctct ggaaagacgc 3240
tcgttagcgt tggtaagatt caggataaaa ttgtagctgg gtgcaaaata gcaactaatc 3300
ttgatttaag gcttcaaaac ctcccgcaag tcgggaggtt cgctaaaacg cctcgcgttc 3360
ttagaatacc ggataagcct tctatatctg atttgcttgc tattgggcgc ggtaatgatt 3420
cctacgatga aaataaaaac ggcttgcttg ttctcgatga gtgcggtact tggtttaata 3480
cccgttcttg gaatgataag gaaagacagc cgattattga ttggtttcta catgctcgta 3540
aattaggatg ggatattatt tttcttgttc aggacttatc tattgttgat aaacaggcgc 3600
gttctgcatt agctgaacat gttgtttatt gtcgtcgtct ggacagaatt actttacctt 3660
ttgtcggtac tttatattct cttattactg gctcgaaaat gcctctgcct aaattacatg 3720
ttggcgttgt taaatatggc gattctcaat taagccctac tgttgagcgt tggctttata 3780
ctggtaagaa tttgtataac gcatatgata ctaaacaggc tttttctagt aattatgatt 3840
ccggtgttta ttcttattta acgccttatt tatcacacgg tcggtatttc aaaccattaa 3900
atttaggtca gaagatgaag cttactaaaa tatatttgaa aaagttttca cgcgttcttt 3960
gtcttgcgat tggatttgca tcagcattta catatagtta tataacccaa cctaagccgg 4020
aggttaaaaa ggtagtctct cagacctatg attttgataa attcactatt gactcttctc 4080
agcgtcttaa tctaagctat cgctatgttt tcaaggattc taagggaaaa ttaattaata 4140
gcgacgattt acagaagcaa ggttattcac tcacatatat tgatttatgt actgtttcca 4200
ttaaaaaagg taattcaaat gaaattgtta aatgtaatta attttgtttt cttgatgttt 4260
gtttcatcat cttcttttgc tcaggtaatt gaaatgaata attcgcctct gcgcgatttt 4320
gtaacttggt attcaaagca atcaggcgaa tccgttattg tttctcccga tgtaaaaggt 4380
actgttactg tatattcatc tgacgttaaa cctgaaaatc tacgcaattt ctttatttct 4440
gttttacgtg caaatgattt tgatatggta ggttctaacc cttccattat tcagaagtat 4500
aatccaaaca atcaggatta tattgatgaa ttgccatcat ctgataatca ggaatatgat 4560
gataattccg ctccttctgg tggtttcttt gttccgcaaa atgataatgt tactcaaact 4620
tttaaaatta ataacgttcg ggcaaaggat ttaatacgag ttgtcgaatt gtttgtaaag 4680
tctaatactt ctaaatcctc aaatgtatta tctattgacg gctctaatct attagttgtt 4740
agtgctccta aagatatttt agataacctt cctcaattcc tttcaactgt tgatttgcca 4800
actgaccaga tattgattga gggtttgata tttgaggttc agcaaggtga tgctttagat 4860
ttttcatttg ctgctggctc tcagcgtggc actgttgcag gcggtgttaa tactgaccgc 4920
ctcacctctg ttttatcttc tgctggtggt tcgttcggta tttttaatgg cgatgtttta 4980
gggctatcag ttcgcgcatt aaagactaat agccattcaa aaatattgtc tgtgccacgt 5040
attcttacgc tttcaggtca gaagggttct atctctgttg gccagaatgt cccttttatt 5100
actggtcgtg tgactggtga atctgccaat gtaaataatc catttcagac gattgagcgt 5160
caaaatgtag gtatttccat gagcgttttt cctgttgcaa tggctggcgg taatattgtt 5220
ctggatatta ccagcaaggc cgatagtttg agttcttcta ctcaggcaag tgatgttatt 5280
actaatcaaa gaagtattgc tacaacggtt aatttgcgtg atggacagac tcttttactc 5340
ggtggcctca ctgattataa aaacacttct caggattctg gcgtaccgtt cctgtctaaa 5400
atccctttaa tcggcctcct gtttagctcc cgctctgatt ctaacgagga aagcacgtta 5460
tacgtgctcg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg 5520
tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt 5580
cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 5640
ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga 5700
tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac 5760
gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 5820
tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggaac caccatcaca 5880
caggattttc gcctgctggg gcaaaccagc gtggaccgct tgctgcaact ctctcagggc 5940
caggcggtga agggcaatca gctgttgccc gtctcgctgg tgaaaagaaa aaccaccctg 6000
gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 6060
cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 6120
cactcattag gcaccccagg cttgacactt tatgcttccg gctcgtataa tgtgtggaat 6180
tgtgagcgga taacaatttc acacgccaag gagacagtca taatgaaata cctattgcct 6240
acggcagccg ctggattgtt attactcgct gcccaaccag ccatggccgg cggaggatct 6300
ggcgagcaaa agctcattag tgaagaggat cttgccgaga cagtggagag ctgcctggcc 6360
aagtcgcaca ccgagaacag cttcaccaat gtttggaagg atgataagac cctggaccgc 6420
tatgccaatt acgaaggttg cttatggaac gcaaccggtg tggttgtgtg cacaggcgat 6480
gagacccaat gctatggcac ctgggtgccg atcggtctgg caattccgga gaacgaaggc 6540
ggaggtagcg aaggaggtgg aagtgaaggc ggaggatcgg aagggggtgg cacaaagcca 6600
ccagaatatg gagacacccc gattccaggt tacacctaca ttaatccgct ggatggtaca 6660
taccctccag gcaccgaaca gaatccggca aacccgaacc cgagcctgga agaaagccaa 6720
ccgctgaaca catttatgtt ccaaaacaac cgttttcgta accgtcaagg agccctgacc 6780
gtatacaccg gtacagtgac ccagggtaca gatccggtga agacctacta tcaatataca 6840
ccggttagca gcaaggcaat gtacgatgca tattggaatg gcaagtttcg tgattgtgca 6900
tttcatagcg gtttcaacga agacctgttt gtgtgcgaat accagggtca gagcagcgat 6960
ttaccgcagc caccggttaa cgcaggtggt ggaagcggag ggggaagtgg cggtgggtca 7020
gaaggcggag gatcggaagg aggtgggagt gaaggagggg gaagcgaagg agggggatca 7080
ggaggtggta gcggaagtgg cgacttcgac tacgagaaga tggccaatgc aaacaaaggc 7140
gcaatgacag agaacgcaga cgagaatgca ctgcaaagtg atgcaaaggg taagctggac 7200
agcgttgcaa ccgactatgg agcagcaatt gacggcttta tcggagatgt cagcggtctg 7260
gcgaacggca acggagcaac aggcgacttc gcaggtagca acagccagat ggcacaggtt 7320
ggagatggcg acaacagtcc gctgatgaac aactttcgcc agtacctgcc gagtctgcca 7380
caaagcgtcg agtgccgtcc gtttgttttc ggtgcaggca agccgtacga gttcagcatc 7440
gactgcgata agattaatct ttttcgcgga gttttcgcat tcctgctgta cgtggcaacg 7500
ttcatgtacg ttttcagcac cttcgccaat atcttacgca acaaagaaag ctaagcaata 7560
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 7620
gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc 7680
ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca 7740
tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc 7800
cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga 7860
cgcgaattat ttttgatggc gttcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 7920
taatgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttaa atatttgctt atacaatctt 7980
cctgtttttg gggcttttct gattatcaac cggggtacat atgattgaca tgctagtttt 8040
acgattaccg ttcatcgatt ctcttgtttg ctccagactc tcaggcaatg acctgatagc 8100
ctttgtagat ctctcaaaaa tagctaccct ctccggcatt aatttatcag ctagaacggt 8160
tgaatatcat attgatggtg atttgactgt ctccggcctt tctcaccctt ttgaatcttt 8220
acctacacat tactcaggca ttgcatttaa aatatatgag ggttctaaaa atttttatcc 8280
ttgcgttgaa ataaaggctt ctcccgcaaa agtattacag ggtcataatg tttttggtac 8340
aaccgattta gctttatgct ctgaggcttt attgcttaat tttgctaatt ctttgccttg 8400
cctgtatgat ttattggacg tt 8422
<210> 16
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 16
ggcggaggat ctggc 15
<210> 17
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 17
gtgaaaaaat tattattcgc aattccttta gttgttcctt tctattctca ctcc 54
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 18
Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser
1 5 10 15
His Ser
<210> 19
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgctgc ccaaccagcc 60
atggcc 66
<210> 20
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 20
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala
20
<210> 21
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 21
Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Pro Ala Lys Ser His Thr Glu Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn
20 25 30
Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly
35 40 45
Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile
50 55 60
Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro
85 90 95
Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro
100 105 110
Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser
115 120 125
Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg
130 135 140
Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp
145 150 155 160
Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met
165 170 175
Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser
180 185 190
Gly Phe Asn Glu Asp Leu Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser
195 200 205
Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr
260 265 270
Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu
275 280 285
Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly
290 295 300
Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala
305 310 315 320
Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro
325 330 335
Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val
340 345 350
Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser
355 360 365
Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu
370 375 380
Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile
385 390 395 400
Leu Arg Asn Lys Glu Ser
405
<210> 22
<211> 406
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 22
Ala Glu Thr Val Glu Ser Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser
1 5 10 15
Phe Thr Asn Val Trp Lys Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn
20 25 30
Tyr Glu Gly Cys Leu Trp Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly
35 40 45
Asp Glu Thr Gln Cys Tyr Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile
50 55 60
Pro Glu Asn Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly
65 70 75 80
Gly Ser Glu Gly Gly Gly Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro
85 90 95
Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro
100 105 110
Gly Thr Glu Gln Asn Pro Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser
115 120 125
Gln Pro Leu Asn Thr Phe Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg
130 135 140
Gln Gly Ala Leu Thr Val Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp
145 150 155 160
Pro Val Lys Thr Tyr Tyr Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met
165 170 175
Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser
180 185 190
Gly Phe Asn Glu Asp Leu Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser
195 200 205
Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
210 215 220
Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly
245 250 255
Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr
260 265 270
Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu
275 280 285
Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly
290 295 300
Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala
305 310 315 320
Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro
325 330 335
Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val
340 345 350
Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser
355 360 365
Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu
370 375 380
Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile
385 390 395 400
Leu Arg Asn Lys Glu Ser
405
<210> 23
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 23
gccgaaactg ttgaaagttg tccggcaaaa tcccatacag aaaattcatt tactaacgtc 60
tggaaagacg acaaaacttt agatcgttac gctaactatg agggctgtct gtggaatgct 120
acaggcgttg tagtttgtac tggtgacgaa actcagtgtt acggtacatg ggttcctatt 180
gggcttgcta tccctgaaaa tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 240
ggttctgagg gtggcggtac taaacctcct gagtacggtg atacacctat tccgggctat 300
acttatatca accctctcga cggcacttat ccgcctggta ctgagcaaaa ccccgctaat 360
cctaatcctt ctcttgagga gtctcagcct cttaatactt tcatgtttca gaataatagg 420
ttccgaaata ggcagggggc attaactgtt tatacgggca ctgttactca aggcactgac 480
cccgttaaaa cttattacca gtacactcct gtatcatcaa aagccatgta tgacgcttac 540
tggaacggta aattcagaga ctgcgctttc cattctggct ttaatgagga tttatttgtt 600
tgtgaatatc aaggccaatc gtctgacctg cctcaacctc ctgtcaatgc tggcggcggc 660
tctggtggtg gttctggtgg cggctctgag ggtggtggct ctgagggtgg cggttctgag 720
ggtggcggct ctgagggagg cggttccggt ggtggctctg gttccggtga ttttgattat 780
gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct atgaccgaaa atgccgatga aaacgcgcta 840
cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct gtcgctactg attacggtgc tgctatcgat 900
ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct aatggtaatg gtgctactgg tgattttgct 960
ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt gacggtgata attcaccttt aatgaataat 1020
ttccgtcaat atttaccttc cctccctcaa tcggttgaat gtcgcccttt tgtctttggc 1080
gctggtaaac catatgaatt ttctattgat tgtgacaaaa taaacttatt ccgtggtgtc 1140
tttgcgtttc ttttatatgt tgccaccttt atgtatgtat tttctacgtt tgctaacata 1200
ctgcgtaata aggagtct 1218
<210> 24
<211> 1218
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 24
gccgaaactg ttgaaagttg tttagcaaaa ccccatacag aaaattcatt tactaacgtc 60
tggaaagacg acaaaacttt agatcgttac gctaactatg agggctgtct gtggaatgct 120
acaggcgttg tagtttgtac tggtgacgaa actcagtgtt acggtacatg ggttcctatt 180
gggcttgcta tccctgaaaa tgagggtggt ggctctgagg gtggcggttc tgagggtggc 240
ggttctgagg gtggcggtac taaacctcct gagtacggtg atacacctat tccgggctat 300
acttatatca accctctcga cggcacttat ccgcctggta ctgagcaaaa ccccgctaat 360
cctaatcctt ctcttgagga gtctcagcct cttaatactt tcatgtttca gaataatagg 420
ttccgaaata ggcagggggc attaactgtt tatacgggca ctgttactca aggcactgac 480
cccgttaaaa cttattacca gtacactcct gtatcatcaa aagccatgta tgacgcttac 540
tggaacggta aattcagaga ctgcgctttc cattctggct ttaatgagga tttatttgtt 600
tgtgaatatc aaggccaatc gtctgacctg cctcaacctc ctgtcaatgc tggcggcggc 660
tctggtggtg gttctggtgg cggctctgag ggtggtggct ctgagggtgg cggttctgag 720
ggtggcggct ctgagggagg cggttccggt ggtggctctg gttccggtga ttttgattat 780
gaaaagatgg caaacgctaa taagggggct atgaccgaaa atgccgatga aaacgcgcta 840
cagtctgacg ctaaaggcaa acttgattct gtcgctactg attacggtgc tgctatcgat 900
ggtttcattg gtgacgtttc cggccttgct aatggtaatg gtgctactgg tgattttgct 960
ggctctaatt cccaaatggc tcaagtcggt gacggtgata attcaccttt aatgaataat 1020
ttccgtcaat atttaccttc cctccctcaa tcggttgaat gtcgcccttt tgtctttggc 1080
gctggtaaac catatgaatt ttctattgat tgtgacaaaa taaacttatt ccgtggtgtc 1140
tttgcgtttc ttttatatgt tgccaccttt atgtatgtat tttctacgtt tgctaacata 1200
ctgcgtaata aggagtct 1218
<210> 25
<211> 224
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
<210> 26
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 27
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 27
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gactatgcca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtgtcagct attacttgga atagtggtca catagactac 180
gcagactccg tggagggccg gttcaccatc tccagagaca atgccaagaa ctccctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaagtgagc 300
tacctgagta ctgcctccag cctggactac tggggccaag gaaccctggt caccgtctcc 360
tcagcctcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420
gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480
tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540
tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600
acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagcagag 660
cccaaatctt gc 672
<210> 28
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 28
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgcc gggcgagtca gggcattcgc aattatttag cctggtatca gcagaaacca 120
gggaaagctc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatgttg caacttatta ctgtcaacgc tataaccgtg ccccttacac gttcggccaa 300
gggaccaagg tggaaatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gc 642
<210> 29
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 29
Val Lys Gln Ser Thr Ile Ala Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr
1 5 10 15
Pro Val Ala Lys Ala
20
<210> 30
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 30
gtgaaacaaa gcactattgc actggcactc ttaccgttac tgtttacccc tgtcgcaaaa 60
gcc 63
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 31
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 32
tacccgtacg acgttccgga ttatgccagc 30
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 33
Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 34
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala
<210> 35
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 35
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Ser
20
<210> 36
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 36
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys
1 5 10 15
Ala Gly Pro Pro Gly Pro
20

Claims (20)

1.33型噬菌体M13载体，其包含编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的第一多核苷酸序列和编码如由SEQ ID NO:2给出的多肽序列的第二多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的载体，其中所述第一多核苷酸序列由SEQ ID NO:3给出，且所述第二多核苷酸序列由SEQ ID NO:4给出。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的33型噬菌体M13载体，其进一步包含编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的第一多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。
4.根据权利要求3所述的载体，其中编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列由SEQID NO:8给出。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的噬菌体M13载体，其中所述载体包含如由SEQ IDNO:15给出的多核苷酸序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的噬菌体M13载体，其进一步包含编码外源多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆，或与编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的噬菌体M13载体，其中所述载体是双链DNA分子。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的噬菌体M13载体，其中所述载体是双链DNA质粒。
9.用于产生噬菌体M13颗粒的方法，其包括：
(a) 用双链33型噬菌体M13载体转染细菌宿主细胞，所述双链33型噬菌体M13载体包含编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的第一多核苷酸序列和编码如由SEQ ID NO:2给出的多肽序列的第二多核苷酸序列，
(b) 在适合于表达所述第一和第二多核苷酸序列并且在所述细菌宿主细胞中装配噬菌体M13颗粒的条件下孵育所述细菌宿主细胞，和
(c) 从所述细菌宿主细胞回收噬菌体M13颗粒，所述噬菌体M13颗粒包含独立地展示在噬菌体M13外壳表面上的由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列给出的多肽序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一多核苷酸序列由SEQ ID NO:3给出，且所述第二多核苷酸序列由SEQ ID NO:4给出。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的方法，其中所述双链噬菌体M13载体进一步包含编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与编码如由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的第一多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。
12.根据权利要求11所述的方法，其中编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列由SEQID NO:8给出。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的方法，其中所述双链M13载体包含如由SEQ IDNO:15给出的多核苷酸序列。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的方法，其中所述双链M13载体进一步包含编码外源多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与编码由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆，或与编码合适的检测标签序列的多核苷酸序列符合读框且在其上游克隆。
15.根据权利要求9至14中任一项所述的方法，其中所述细菌宿主细胞是F+细菌菌株。
16.噬菌体M13颗粒，其中所述颗粒包含独立地展示在噬菌体颗粒外壳表面上的由SEQID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列给出的多肽。
17.根据权利要求16所述的噬菌体M13颗粒，其中所述颗粒进一步包含与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的N端融合的合适的检测标签序列。
18.根据权利要求17所述的噬菌体M13颗粒，其中所述合适的检测标签序列由SEQ IDNO:7给出。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的噬菌体M13颗粒，其中所述颗粒进一步包含与由SEQ ID NO:1的氨基酸序列给出的多肽序列的N端或与合适的检测标签序列的N端融合的外源多肽。
20.根据权利要求19所述的噬菌体M13颗粒，其中将所述外源多肽与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列或与合适的检测标签序列经由与由SEQ ID NO:1给出的多肽序列的N端或与合适的检测标签序列的N端和外源多肽的C端融合的肽接头进行融合。
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