CN108344690A - 基于微流混合器的sers基底制备及检测一体化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微流混合器的表面增强拉曼散射(SERS)基底制备及检测一体化方法，上述一体化的方法，包括如下步骤：利用微流混合器均匀且快速地混合分析物和金属纳米颗粒；分析物均匀吸附在金属纳米颗粒表面；吸附了分析物的金属纳米颗粒致密地沉积在微流混合器的检测区，形成高灵敏度固相SERS基底；进行SERS检测；利用微流混合器灵活地改变通道中的微环境对分析物进行原位的SERS研究。本方法将以上的所有的功能全部集成到了一块1.25cm×1.85cm的微流芯片中，极大地缩短了实验时间，降低了分开实验中每一步带来的误差，提高了检测的可靠性及长期稳定性；本方法制备的SERS基底能将分析物耦合到“热点”区域，因而具有极高的SERS增强效果，此外，均匀且快速的混合能够使得分析物均匀地吸附，从而得到均匀的SERS信号。

Description

基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法
技术领域
本发明涉及一种高效的检测技术，属于功能化微流器件的技术领域，特别是提出了一种利用超快微流混合器实现高的“热点”利用率的SERS基底的制备方法。
背景技术
表面增强拉曼散射(SERS)检测技术目前已经应用于各个领域，包括环境监测，食品安全，国土安全，生物医疗，等等。其指纹谱的特点有利于更好地了解生物大分子的结构以及研究生物大分子的变化过程。微流控器件可以在流动的状态下实时观察生物、化学等反应的过程，因此，SERS功能化的微流器件(LoC-SERS)在目前的研究应用中具有重要意义。
目前，LoC-SERS器件可以分为两大类，第一类为在微流器件中集成SERS功能的纳米颗粒阵列，使得整个微流器件具有SERS功能，但是，这类方法只是简单的两种技术的叠加，而且“热点”利用率不高，灵敏度差；第二类为在微流器件中通入液态的纳米颗粒胶体，这种方法胶体的稳定性是一个难题，可控的聚集才能得到稳定的信号，长期稳定几乎是不可能的，故而不可能成为一种可靠的原位研究的方法。
由此可见，目前在LoC-SERS器件中，两大类都有其自身的优势和缺陷，如何能够制备出高灵敏的，好的稳定性和均匀性的LoC-SERS器件是值得发展的，此外，制备和检测一体化的器件更加节省实验时间，提高效率。
发明内容
技术问题：基于传统的固相SERS基底的“热点”利用率低的问题，提出了基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法，实现高灵敏、高均匀、好的重复性和长期稳定的SERS检测及原位研究。
技术方案：本发明的一种基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法包括如下步骤：
步骤1、利用新鲜制备的聚二甲基硅氧烷PDMS超快微流混合器将金属纳米颗粒与分析物溶液快速均匀地混合，使金属纳米颗粒吸附了分析物；
步骤2、将吸附了分析物的金属纳米颗粒均匀致密地沉积在上述微流混合器的检测区，形成含有分析物的高灵敏度固相单层表面增强拉曼散射SERS基底；
步骤3、通入去离子水洗去未吸附在微流混合器内壁上的金属纳米颗粒和分析物；
步骤4、进行分析物的SERS信号检测。
其中，
所述含有分析物的固相单层SERS基底制备完成后，通入与分析物可能发生作用的液体，根据分析物SERS信号的变化原位研究分析物对所述通入的液体的响应。
所述的对通入液体的响应包括pH值、变性剂浓度、去垢剂浓度、离子强度、温度、分子-分子相互作用、分子-表面或分子-界面相互作用。
所述的微流混合器包括PDMS制备的采用各种混合机制的微流混合器。
所述的微流混合器在混合区不对称设置三角形挡板对流体产生级联式分裂-重组C-SAR效应，有效地提高了混合效率。
所述的金属纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒或铜纳米颗粒。
有益效果：本发明所述的一体化方法方便简洁，不需要有丰富的实验经验的人来操作。由于采用了高混合效率的微流混合器，使得分析物均匀地、可控地吸附在金属纳米颗粒上，并在形成固相SERS基底时被耦合在“热点”中，因此所制备的SERS基底具有极高的增强效果，良好的均匀性和重复性；采用分析物本身作为连接分子构筑了SERS基底制备-检测一体化方法，有效地避免额外引入的连接分子而造成的信号干扰，因此该SERS基底具有高的信噪比；由于制得的SERS基底是封闭在微流器件中的，有效地降低了氧化作用，因此具有长期稳定性；由于整个制备和检测过程都处于水环境中，可以营造很好的生理环境，有利于保持生物分子的天然活性；由于吸附了分析物的SERS基底是耦合在微流通道中的，因此可以灵活地改变通入的液体，以SERS信号原位研究分析物的环境响应及分子间作用。
附图说明
图1为基于微流混合器的SERS基底的形成过程。
图2为SERS基底的形貌图。
图3为制得的SERS基底上任意60点检测的R6G的SERS谱。
图4为制得的SERS基底的R6G的SERS谱在空气中放置10周的SERS谱及SERS强度变化。
图5为SERS强度随R6G浓度变化图，插图为9×10-11M的R6G的SERS谱。
图6为细胞色素c的SERS谱。
图7为PMP22-TM4蛋白质(野生型WT和突变体G150D)的SERS谱。
图8为cyt c,G150D,以及混合溶液(cyt c和G150D(浓度比为1:2))的SERS谱。
图9为原位监测PMP22-TM4蛋白质(WT和G150D)在不同pH的环境下的SERS响应。
具体实施方式
为了解决现有的LoC-SERS技术存在的步骤繁琐，重复性低，对制作环境的洁净度要求高，以及SERS“热点”利用率低等问题，申请人提出了如下方案：
本发明的基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化的方法，包括如下步骤：利用新鲜制备的PDMS超快微流混合器将银纳米颗粒与分析物溶液快速均匀地混合；吸附了分析物的银纳米颗粒均匀致密地沉积在微流芯片的检测区，洗去多余的金属纳米颗粒和分析物，形成高灵敏度SERS基底，实现制备-检测一体化；利用微流芯片灵活地改变流经吸附了分析物的SERS基底的液体条件，监测SERS信号变化，原位研究分析物对环境变化的响应。
本发明采用的超快微流混合器为级联式分裂-重组C-SAR混合器，混合时间在毫秒量级；本发明所使用的银纳米颗粒溶胶是采用成核与生长分开pH调控法制备的(RSC Adv.,2017,7,8771-8878)。
实施例1：基于微流混合器的SERS基底的均匀性表征
银纳米颗粒胶体溶液以200μl/min的流速从新鲜制备的C-SAR微流混合器的两个侧通道分别同时通入；2.2nM的R6G溶液以40μl/min的流速从主通道通入；在混合区将分析物和金属纳米颗粒充分快速地混合；R6G能够均匀地吸附在纳米颗粒表面。吸附了R6G的银纳米颗粒沉积在微流芯片的检测区，10分钟后，3个入口通道通入去离子水排除多余的未吸附颗粒，得到均匀的单层银纳米颗粒膜，其形貌图如图2所示。在检测区随机检测60个点，得到的R6G的SERS谱如图3所示，信号强度的偏差只有11％。
实施例2：基于微流混合器的SERS基底的长期稳定性表征
银纳米颗粒胶体溶液以200μl/min的流速从新鲜制备的C-SAR微流混合器的两个侧通道分别同时通入；2.2nM的R6G溶液以40μl/min的流速从主通道通入；在混合区将分析物和金属纳米颗粒充分快速地混合；R6G能够均匀地吸附在纳米颗粒表面。吸附了R6G的银纳米颗粒沉积在微流芯片的检测区，10分钟后，3个入口通道通入去离子水排除多余的未吸附颗粒，得到均匀的单层银纳米颗粒膜，在检测区得到的R6G的SERS谱，将芯片放置在空气中10周，每周都测试一次检测区的R6G的SERS谱，如图4所示，10周之内R6G的SERS强度几乎没有变化，信号强度的偏差仅有3.3％。
实施例3：基于微流混合器的SERS基底的检测能力表征
银纳米颗粒胶体溶液以200μl/min的流速从新鲜制备的C-SAR微流混合器的两个侧通道分别同时通入；10-7,5×10-8,10-8,5×10-9,10-9M的R6G溶液分别以40μl/min的流速从主通道通入；在混合区将分析物和金属纳米颗粒充分快速地混合；R6G能够均匀地吸附在纳米颗粒表面。检测区的R6G的浓度分别为9×10-9,4.5×10-9,9×10-10,4.5×10-10,2×10-10和9×10-11M，吸附了R6G的银纳米颗粒沉积在微流芯片的检测区，10分钟后，3个入口通道通入去离子水排除多余的未吸附颗粒，得到一系列均匀的单层银纳米颗粒膜，从而得到SERS强度随R6G浓度变化的图，如图5所示，在检测区浓度只有9×10-11M时仍有很高信噪比的SERS谱。
实施例4：cyt c的SERS检测及保持天然构象验证
银纳米颗粒胶体溶液以200μl/min的流速从新鲜制备的C-SAR微流混合器的两个侧通道分别同时通入；10μM的细胞色素c(cyt c)溶液以40μl/min的流速从主通道通入；在混合区将分析物和金属纳米颗粒充分快速地混合；cyt c能够均匀地吸附在纳米颗粒表面。吸附了cyt c的银纳米颗粒沉积在微流芯片的检测区，10分钟后，3个入口通道通入缓冲液排除多余的未吸附颗粒，得到均匀的单层银纳米颗粒膜，在检测区得到的cyt c的SERS谱如图6所示，天然的六配位低自旋结构的1585cm-1波数的拉曼峰的存在表明基于超快微流混合器的高灵敏度SERS基底制备及SERS检测一体化的方法可以保持cyt c的天然态构象。
实施例5：PMP22-TM4的两种突变体的高灵敏SERS分辨
银纳米颗粒胶体溶液以200μl/min的流速从新鲜制备的C-SAR微流混合器的两个侧通道分别同时通入；20μM的PMP22-TM4蛋白质(野生型WT和突变体G150D)溶液以40μl/min的流速从主通道通入；在混合区将分析物和金属纳米颗粒充分快速地混合；PMP22-TM4能够均匀地吸附在纳米颗粒表面。吸附了PMP22-TM4的银纳米颗粒沉积在微流芯片的检测区，10分钟后，3个入口通道通入缓冲液(pH＝5.5)排除多余的未吸附颗粒，得到均匀的单层银纳米颗粒膜，在检测区得到的PMP22-TM4的SERS谱如图7所示，两个PMP22-TM4突变体的SERS谱均具有很好的信噪比，并且934cm-1波数的差异能够清晰区分出这两个仅有一个氨基酸不同的蛋白质。
实施例6：蛋白质的多元检测
银纳米颗粒胶体溶液以200μl/min的流速从新鲜制备的C-SAR微流混合器的两个侧通道分别同时通入；10μM的cyt c和20μM的PMP22-TM4(G150D)混合溶液以40μl/min的流速从主通道通入；在混合区将两种蛋白质和金属纳米颗粒充分快速地混合；两种蛋白质都能够均匀地吸附在纳米颗粒表面。银纳米颗粒再沉积在微流芯片的检测区，10分钟后，3个入口通道通入缓冲液(pH＝5.5)排除多余的未吸附颗粒，得到均匀的单层银纳米颗粒膜，在检测区得到的蛋白质混合溶液的SERS谱如图8所示，该光谱包含上述两个蛋白质的信息。
实施例7：原位研究PMP22-TM4的pH响应
银纳米颗粒胶体溶液以200μl/min的流速从新鲜制备的C-SAR微流混合器的两个侧通道分别同时通入；20μM的PMP22-TM4蛋白质(野生型WT和突变体G150D)溶液以40μl/min的流速从主通道通入；在混合区将分析物和金属纳米颗粒充分快速地混合；PMP22-TM4能够均匀地吸附在纳米颗粒表面。吸附了PMP22-TM4的银纳米颗粒均匀沉积在微流芯片的检测区，10分钟后，3个入口通道通入缓冲液排除多余的未吸附颗粒，得到均匀的单层银纳米颗粒膜。向通道内通入不同pH的缓冲液(pH＝3,4,5,5.5,6)，原位得到不同pH下的PMP22-TM4(野生型WT和突变体G150D)的SERS谱，如图9所示，揭示了两种蛋白质突变体的不同pH值响应。

Claims (6)

1.一种基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
步骤1、利用新鲜制备的聚二甲基硅氧烷PDMS超快微流混合器将金属纳米颗粒与分析物溶液快速均匀地混合，使金属纳米颗粒吸附了分析物；
步骤2、将吸附了分析物的金属纳米颗粒均匀致密地沉积在上述微流混合器的检测区，形成含有分析物的高灵敏度固相单层表面增强拉曼散射SERS基底；
步骤3、通入去离子水洗去未吸附在微流混合器内壁上的金属纳米颗粒和分析物；
步骤4、进行分析物的SERS信号检测。
2.根据权利要求1所述的基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法，其特征在于，所述含有分析物的固相单层SERS基底制备完成后，通入与分析物可能发生作用的液体，根据分析物SERS信号的变化原位研究分析物对所述通入的液体的响应。
3.根据权利要求2所述的基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法，其特征在于，所述的对通入液体的响应包括pH值、变性剂浓度、去垢剂浓度、离子强度、温度、分子-分子相互作用、分子-表面或分子-界面相互作用。
4.根据权利要求1所述的基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法，其特征在于，所述的微流混合器包括PDMS制备的采用各种混合机制的微流混合器。
5.根据权利要求4所述的基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法，其特征在于，所述的微流混合器在混合区不对称设置三角形挡板对流体产生级联式分裂-重组C-SAR效应，有效地提高了混合效率。
6.根据权利要求1所述的基于微流混合器的SERS基底制备及检测一体化方法，其特征在于，所述的金属纳米颗粒包括金纳米颗粒、银纳米颗粒或铜纳米颗粒。
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