CN108329316A - 一种检测镍离子的生物荧光探针及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测镍离子的生物荧光探针及其制备方法。该生物荧光探针是快速高灵敏性的Ni2+荧光探针，并且对其他常见的金属离子具有较强的抗干扰能力，可以用来定性定量检测环境中以及细胞内的镍离子。且制备方法简单，操作方便，结果稳定性佳，易于实施推广。因此对镍离子检测具有良好的应用价值。极大提高了检测过程的便利性。更为符合实际应用过程中需求。

Description

一种检测镍离子的生物荧光探针及其制备方法
技术领域
本发明涉及荧光检测的技术领域，具体而言，涉及一种检测镍离子的生物荧光探针及其制备方法。
背景技术
自然界中广泛存在的金属离子对环境、医学、生物、化学科学都起着重要作用。其中一些重金属和过渡金属离子虽然在生物体内含量很低，但由于它们大多以金属蛋白质和金属酶的形式存在，参与到生物体内的许多重要反应及信息传递、能量转移等过程中，对生物体的代谢发展有重要的影响，在医药化学中也占据着重要的位置。镍离子是人体和某些作物的必需元素。虽然镍及其盐类的毒性较低，但由于它本身具有生物化学活性，能激活或抑制一系列的酶(精氨酸酶、羧化酶、酸性磷酸酶和拓脱羧酶)而发挥其毒性。而镍缺乏时对肝细胞和线粒全结构产生变化，尤其导致内网质不规整，线粒体氧化功能降低。但过量的镍离子对人体以及动植物又具有很强的毒性，镍可引起接触性皮炎。直接进入血流的镍盐毒性较高，硫化镍或氯化镍毒性较大，可引起中枢性循环和呼吸紊乱，使心肌、脑、肺和肾出现水肿、出血和变性。因此，对镍离子含量的检测极为重要。
目前，检测金属离子的方法有电感耦合等离子体发射光谱，即ICP-AES、原子吸收光谱、循环伏安法和分光光度法等。但这些方法的检测过程比较繁琐，检测设备的价格普遍昂贵，不适合大批量的检测和实时的检测。相比以上检测方法，荧光探针由于其灵敏度高、选择性好、快速分析，能实现实时检测，能应用于生物成像等优势被广泛应用于环境与生物体内金属离子的检测。
但目前报道的用于检测的荧光探针仍存在一些问题，比如选择性不强，响应速度不够快、合成复杂水溶性差等。所以发展一种快速、高选择性、高灵敏度、合成简单且能用于细胞内检测镍离子的荧光探针是非常必要的。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的缺陷，提供了一种检测镍离子的生物荧光探针及其制备方法。
该种检测镍离子的生物荧光探针的制备方法包括以下步骤：
S1：混合2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶、水合肼至溶解得到混合物；
S2：冷凝回流混合物后冷却析出晶体，过滤，洗涤，烘干后得到浅黄色中间产物A；
S3：称取1-苯基-1，3-丁二酮，溶解于乙醇溶液后滴入所述中间产物A中，反应后冷却至室温，过滤，洗涤，烘干得到生物荧光探针L；
反应过程如下：
在某些实施方式中，所述S1中取2mmol 2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶加入4mmol水合肼，摇匀至2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶溶解。
在某些实施方式中，所述2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶缓慢的加入所述水合肼中。
在某些实施方式中，所述S2中混合物于120℃冷凝回流3h后冷却析出晶体，过滤，洗涤，烘干后得到浅黄色中间产物。
在某些实施方式中，所述S2中冷却析出晶体，过滤，并用冰乙醇洗涤。
在某些实施方式中，所述中间产物A的产率为93.6％。
在某些实施方式中，所述S3中取3mmol 1-苯基-1，3-丁二酮，溶解于35mL的乙醇溶液后滴入所述中间产物A中，反应后冷却至室温，过滤，洗涤，烘干得到生物荧光探针。
在某些实施方式中，所述1-苯基-1，3-丁二酮溶解于所述乙醇溶液后缓慢的滴入所述中间产物A中。
在某些实施方式中，所述S3中反应后冷却至室温，过滤，并用乙醚洗涤，烘干得到生物荧光探针。
本发明提供的一种检测镍离子的生物荧光探针相对于现有技术而言，有益效果是：本发明提供了一种吡唑嘧啶类衍生物荧光探针及其制备方法，其有效的解决了现有的荧光探针存在的灵敏度低或者水溶性差的问题。
具体而言，本发明的生物荧光探针分别与Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Fe2+，Co2 +，Zn2+，Cd2+，Ag+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Pb4+等金属离子进行作用，均不能导致生物荧光探针的荧光光谱的明显改变。
然而，当加入Ni2+时，生物荧光探针在491nm处的荧光发射峰荧光强度几乎完全淬灭，从而实现对Ni2+的选择性识别。进而可任选地用于排除Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Zn2+，Cd2+，Ag+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Pb4+等金属离子对Ni2+测定的干扰。
再者，本发明的生物荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
可以理解的是，本发明提供的生物荧光探针是快速高灵敏性的Ni2+荧光探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。
由此可知，该生物荧光探针具有选择性好、灵敏度高，并且对其他常见的金属离子具有较强的抗干扰能力，可以用来定性定量检测环境中以及细胞内的镍离子。因此对镍离子检测具有良好的应用价值。
且该种检测镍离子的生物荧光探针的制备方法操作方便，结果稳定性佳，易于实施推广。可以快速、方便的得到检测结果。极大提高了检测过程的便利性。更为符合实际应用过程中需求。
综上所述，本发明提供的一种检测镍离子的生物荧光探针其具有上述诸多的优点及价值，并在同类产品中未见有类似的方法公开发表或使用而确属创新，产生了好用且实用的效果，较现有的技术具有增进的多项功效，从而较为适于实用，并具有广泛的产业价值。
附图说明
应当理解的是，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1是生物荧光探针(10μM)对不同金属(50μM，Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Fe2 +，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+，Cd2+，Ag+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Pb4+)的响应情况；
图2是生物荧光探针(10μM)加入镍离子后的荧光光谱及线性关系；
图3是不同金属离子(50μM)对生物荧光探针(10μM)检测Ni2+的干扰；
图4a是生物荧光探针(1.5μM)在T-24细胞中培养30min后的明场图像；
图4b是生物荧光探针(1.5μM)在T-24细胞中培养30min后的荧光成像图；
图4c是生物荧光探针(1.5μM)在T-24细胞中培养30min后加入Ni2+(15μM)培养1h的荧光成像图。
具体实施方式
在下文中，将结合附图更全面地描述本公开的各种实施例。本公开可具有各种实施例，并且可在其中做出调整和改变。因此，将参照在附图中示出的特定实施例更详细地描述本公开。然而，应理解：不存在将本公开的各种实施例限于在此公开的特定实施例的意图，而是应将本公开理解为涵盖落入本公开的各种实施例的精神和范围内的所有调整、等同物和/或可选方案。结合附图的描述，同样的附图标号标示同样的元件。
在下文中，可在本公开的各种实施例中使用的术语“包括”或“可包括”指示所公开的功能、操作或元件的存在，并且不限制一个或更多个功能、操作或元件的增加。
在本公开的各种实施例中，表述“或”或“A或/和B中的至少一个”包括同时列出的文字的任何组合或所有组合。例如，表述“A或B”或“A或/和B中的至少一个”可包括A、可包括B或可包括A和B二者。
在本公开的各种实施例中使用的表述(诸如“第一”、“第二”等)可修饰在各种实施例中的各种组成元件，不过可不限制相应组成元件。例如，以上表述并不限制所述元件的顺序和/或重要性。以上表述仅用于将一个元件与其它元件区别开的目的。例如，第一用户装置和第二用户装置指示不同用户装置，尽管二者都是用户装置。例如，在不脱离本公开的各种实施例的范围的情况下，第一元件可被称为第二元件，同样地，第二元件也可被称为第一元件。
应注意到：如果描述将一个组成元件“连接”到另一组成元件，则可将第一组成元件直接连接到第二组成元件，并且可在第一组成元件和第二组成元件之间“连接”第三组成元件。相反地，当将一个组成元件“直接连接”到另一组成元件时，可理解为在第一组成元件和第二组成元件之间不存在第三组成元件。
在本公开的各种实施例中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的并且并非意在限制本公开的各种实施例。如在此所使用，单数形式意在也包括复数形式，除非上下文清楚地另有指示。除非另有限定，否则在这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本公开的各种实施例所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。所述术语(诸如在一般使用的词典中限定的术语)将被解释为具有与在相关技术领域中的语境含义相同的含义并且将不被解释为具有理想化的含义或过于正式的含义，除非在本公开的各种实施例中被清楚地限定。
实施例
本发明提供了一种检测镍离子的生物荧光探针及其制备方法。
该种检测镍离子的生物荧光探针的制备方法包括以下步骤：
S1：混合2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶、水合肼至溶解得到混合物；
S2：冷凝回流混合物后冷却析出晶体，过滤，洗涤，烘干后得到浅黄色中间产物A；
S3：称取1-苯基-1，3-丁二酮，溶解于乙醇溶液后滴入所述中间产物A中，反应后冷却至室温，过滤，洗涤，烘干得到生物荧光探针L；
反应过程如下：
参见图1，是生物荧光探针(10μM)对不同金属(50μM，Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Cd2+，Ag+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Pb4+)的响应。
有图1可知，本发明的生物荧光探针分别与Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Zn2+，Cd2+，Ag+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Pb4+等金属离子进行作用，均不能导致生物荧光探针的荧光光谱的明显改变。
参见图2，是生物荧光探针(10μM)加入镍离子后的荧光光谱及线性关系。
参见图3，为不同金属离子(50μM)对生物荧光探针(10μM)检测Ni2+的干扰。
有图1至图3可知，当加入Ni2+时，生物荧光探针在491nm处的荧光发射峰荧光强度几乎完全淬灭，从而实现对Ni2+的选择性识别。进而可任选地用于排除Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2 +，Ba2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Zn2+，Cd2+，Ag+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Pb4+等金属离子对Ni2+测定的干扰。
参见图4a，为生物荧光探针(1.5μM)在T-24细胞中培养30min后的明场图像；
参见图4b，为生物荧光探针(1.5μM)在T-24细胞中培养30min后的荧光成像图；
参见图4c，为生物荧光探针(1.5μM)在T-24细胞中培养30min后加入Ni2+(15μM)培养1h的荧光成像图。
由此可知，本发明的生物荧光探针的稳定性好，进而能够长期保存使用。
可以理解的是，本发明提供的生物荧光探针是快速高灵敏性的Ni2+荧光探针，且合成简单，有利于商业化的推广应用。
由此可知，该生物荧光探针具有选择性好、灵敏度高，并且对其他常见的金属离子具有较强的抗干扰能力，可以用来定性定量检测环境中以及细胞内的镍离子。因此对镍离子检测具有良好的应用价值。
该种检测镍离子的生物荧光探针的制备方法操作方便，结果稳定性佳，易于实施推广。可以快速、方便的得到检测结果。极大提高了检测过程的便利性。更为符合实际应用过程中需求。
优选的，所述S1中取2mmol 2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶加入4mmol水合肼，摇匀至2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶溶解。
优选的，所述2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶缓慢的加入所述水合肼中。
优选的，所述S2中混合物于120℃冷凝回流3h后冷却析出晶体，过滤，洗涤，烘干后得到浅黄色中间产物。
优选的，所述S2中冷却析出晶体，过滤，并用冰乙醇洗涤。
优选的，所述中间产物A的产率为93.6％。
优选的，所述S3中取3mmol 1-苯基-1，3-丁二酮，溶解于35mL的乙醇溶液后滴入所述中间产物A中，反应后冷却至室温，过滤，洗涤，烘干得到生物荧光探针。
优选的，所述1-苯基-1，3-丁二酮溶解于所述乙醇溶液后缓慢的滴入所述中间产物A中。
优选的，所述S3中反应后冷却至室温，过滤，并用乙醚洗涤，烘干得到生物荧光探针。
本发明还提供了该种检测镍离子的生物荧光探针的性能检测过程。包括以下步骤：
一、储备液的制备
1、生物荧光探针储备液的配制
将用于镍离子检测的吡唑嘧啶类衍生物荧光探针以乙醇为溶剂配制成浓度为1×10-5mol/L的溶液作为储备溶液A。
2、金属离子储备液的配制
用金属氯化盐和硝酸盐以二次蒸馏水为溶剂配制成浓度为2×10-3mol/L的溶液作为储备溶液B。
二、光谱性能测试
1、考察生物荧光探针对金属离子的选择性识别
于比色皿中加入3m L 1×10-5mol/L的储备溶液A，然后用微量进样器分别加入等体积的2×10-3mol/L的储备溶液B(Li+，Na+，K+，Mg2+，Ca2+，Ba2+，Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Zn2+，Cd2 +，Ag+，Hg2+，Al3+，Fe3+，Pb4+)，保证生物荧光探针与金属离子的摩尔浓度比为1：5，充分摇匀1min后测定不同金属离子对生物荧光探针荧光光谱的影响。
其中，激发波长是300nm，发射波长是491nm，夹缝是5，5，测试温度为25℃。
结果如图1所示。由图1中可知，加入不同金属离子后，各金属离子与生物荧光探针的荧光光谱曲线形状类似，波长在491nm处的发射峰荧光强度变化不明显，而加入Ni2+后，该发射峰的荧光强度明显淬灭。因此，从荧光发射光谱可以确定，生物荧光探针对Ni2+具有选择识别特性。
2、考察不同浓度的Ni2+对生物荧光探针荧光光谱的影响
于比色皿中加入3mL配制好的1×10-5mol/L储备溶液A中，用微量进样器分别向待测体系中不断加入2×10-3mol/L的Ni2+(0-1.5equiv.)水溶液，测定不同浓度的Ni2+存在时，生物荧光探针的荧光光谱的变化。
结果如图2所示。由图2可以看出，随着金属离子Ni2+浓度的增大，在491nm处的发射峰荧光强度逐渐减小。在以荧光强度变化值ΔI对金属离子浓度作图，并进行曲线拟合。
如图2所示，可知，Ni2+浓度在0-8.4μM的范围内呈现出良好的线性关系，其线性相关系数分别为0.99513，对Ni2+的检测限是0.038μM，根据线性方程即可计算出任意荧光变化值强度下所对应的Ni2+的浓度，其中ΔI＝I0-I,I0不加Ni2+体系在491nm波长处的荧光强度，I为加入Ni2+体系在491nm波长处的荧光强度。
同时，通过Benesi-Hildebrand公式，1/(I0-I)＝1/{Ka(I0-Imax)[Ni2+]}+1/(I0-Imax)可以计算出生物荧光探针与Ni2+的结合常数为2.85×104M-1。
说明生物荧光探针对镍离子具有良好的线性关系和较高的测定灵敏度，这证明了借助于该生物荧光探针能够对镍离子进行定量分析。
3、考察生物荧光探针对Ni2+的竞争性识别
在17个装3m L 1×10-5mol/L的储备溶液A的小瓶子中，分别依次加入100μL的2×10-3mol/L的17种金属离子储备液(Li+,Na+,K+,Mg2+,Ca2+,Ba2+,Mn2+,Fe2+,Co2+,Ni2+,Zn2+,Cd2 +,Ag+,Hg2+,Al3+,Fe3+,Pb4+)，且在除了加有Ni2+的小瓶子中再分别加入2×10-3mol/L的Ni2+溶液，使干扰离子与Ni2+的浓度比为2:1。另取3mL 1×10-5mol/L的储备溶液A于小瓶子中，加入与所加金属离子溶液等体积的三次蒸馏水，作为空白组。摇匀后再次测试其荧光光谱，即完成Ni2+对其他金属离子的竞争识别曲线。
结果如图3所示，生物荧光探针对铜离子和镍离子的识别并不受其他离子的干扰，说明生物荧光探针除了具有良好的选择性，同时具有良好的抗干扰能力。
4、考察了生物荧光探针在活细胞中的生物方面应用
采用T-24细胞进行试验。将生物荧光探针(1.5μM)加入培养好的细胞中，在95％O2，5％CO2，37℃的条件下培养箱里培养30min，使荧光分子充分渗透到细胞膜内。30分钟后，将培养皿拿出，用PBS缓冲溶液反复冲洗3遍。随后将该细胞放入荧光显微镜下观察(如图4所示)。
通过明场图像，可以看到细胞轮廓形态完整(图4a)，并没有因为加入探针分子而脱水导致丧失生物活性。从荧光显微镜中可以看出(图4b)，此时细胞显示较强的蓝光。然后向上述细胞培养液中加入Ni2+(15μM)，在相同环境下继续培养1h，并用PBS缓冲溶液淋洗3遍，去除表面残留的Ni2+，继续观察细胞，发现与之前未加入Ni2+的细胞相比，此时细胞显示完全猝灭的细胞荧光成像(图4c)。
结果表明，生物荧光探针能顺利地穿透细胞膜被细胞吸收，并成功检测活体细胞内Ni2+，这对于生物体内Ni2+的监测和生物荧光探针在生物体系的应用都有很高的价值。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
发明人声明，本发明通过上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程。并且即不意味着本发明应依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：混合2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶、水合肼至溶解得到混合物；
S2：冷凝回流混合物后冷却析出晶体，过滤，洗涤，烘干后得到浅黄色中间产物A；
S3：称取1-苯基-1，3-丁二酮，溶解于乙醇溶液后滴入所述中间产物A中，反应后冷却至室温，过滤，洗涤，烘干得到生物荧光探针L；
反应过程如下：
2.如权利要求1所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述S1中取2mmol 2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶加入4mmol水合肼，摇匀至2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶溶解。
3.如权利要求2所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述2，6-二氯-3-氰基-4甲基吡啶缓慢的加入所述水合肼中。
4.如权利要求1所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述S2中混合物于120℃冷凝回流3h后冷却析出晶体，过滤，洗涤，烘干后得到浅黄色中间产物。
5.如权利要求4所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述S2中冷却析出晶体，过滤，并用冰乙醇洗涤。
6.如权利要求1所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述中间产物A的产率为93.6％。
7.如权利要求1所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述S3中取3mmol 1-苯基-1，3-丁二酮，溶解于35mL的乙醇溶液后滴入所述中间产物A中，反应后冷却至室温，过滤，洗涤，烘干得到生物荧光探针。
8.如权利要求7所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述1-苯基-1，3-丁二酮溶解于所述乙醇溶液后缓慢的滴入所述中间产物A中。
9.如权利要求7所述的检测镍离子的生物荧光探针的制备方法，其特征在于：所述S3中反应后冷却至室温，过滤，并用乙醚洗涤，烘干得到生物荧光探针。
10.一种检测镍离子的生物荧光探针，其特征在于：由权利要求1～9所述的制备方法制得。
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