CN108308032B

CN108308032B - 杉木组织培养快速繁殖方法

Info

Publication number: CN108308032B
Application number: CN201810340051.7A
Authority: CN
Inventors: 卢泳全; 潘瑶瑶
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2018-04-16
Filing date: 2018-04-16
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2038-04-16
Also published as: CN108308032A

Abstract

本发明公开了一种杉木组织培养快速繁殖方法，依次包括以下步骤：1)、外植体采集及消毒；2)、诱导不定芽：将消毒处理后的枝条经修剪处理后，接种到诱导培养基中进行培养，直至茎段上诱导生成1～3cm高的不定芽；3)、不定芽增殖：割取不定芽接种到增殖培养基中进行增殖培养，直至长至3～6cm高；4)、分化生根：将其接种到生根培养基中进行分化生根，直至获得长度≥4cm且至少有3条长于2cm根的植株；5)、将所得的植株进行炼苗移栽。本发明的方法以优良无性系茎段为外植体，采用该方法能快速获得大量的杉木组培种苗。

Description

杉木组织培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及一种杉木组织培养快速繁殖方法。

背景技术

杉木(Cunninghamia lanceolate)是我国独有的树种之一，在我国人工育林中也发挥着重要作用，主要分布在中国长江流域、秦岭以南地区，其生长快、主干通直圆满，木材纹理美观，结构均匀，材质优良，病虫害少和木材产量高的特点，因此，也被广泛应用为经济林树种。我国杉木林发展仍旧比较缓慢，目前杉木主要采用扦插、嫁接和播种等传统方式进行育苗，存在育苗成本高，苗木长势不好、参差不齐、良种潜力未能得到充分发挥等缺点，使得目前杉木优质壮苗的供应还无法满足市场的需求。

为了满足市场需求，目前急需通过组培快繁技术进行杉木苗培育，从而获得具有遗性稳定、受自然灾害影响小、经济快捷等优势的杉木立体再生植株，建立杉木组织培养快速繁殖体系，促进杉木优良无性系苗木的规模化生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种杉木的组织培养法，该方法以优良无性系茎段为外植体，采用该方法能快速获得大量的杉木组培种苗。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种杉木组织培养快速繁殖方法，依次包括以下步骤：

1)、外植体采集及消毒：

采用杉木树桩基部当年生萌动状态的健康枝条作为外植体，将其进行消毒，得消毒处理后枝条；

2)、诱导不定芽：

将消毒处理后的枝条，剪成长为1.5±0.2cm的茎段，再将所述茎段上的叶片修剪至长为0.5±0.1cm，然后接种到诱导培养基中进行培养，直至茎段上诱导生成1～3cm高的不定芽；

培养条件为：光照时间16±0.5小时/天，光照强度为1600±100lx，培养温度为25±2℃，空气相对湿度为75±3％；

3)、不定芽增殖：

割取步骤2)所得的不定芽接种到增殖培养基中进行增殖培养，直至长至3～6cm高；

4)、分化生根；

将步骤3)所得的不定芽接种到生根培养基中进行分化生根，直至获得长度≥4cm(一般为4～8cm)且至少有3条长于2cm根的植株；

5)、炼苗移栽：

将步骤4)所得的植株进行炼苗移栽。

作为本发明的杉木组织培养快速繁殖方法的改进，步骤5)为：

将步骤4)所得的瓶苗移至室温(25±5℃左右)打开瓶盖，一周后出瓶，洗去附着于根部的培养基并晾干至根系发白，移栽至基质容器中置于人工气候箱室培养，培养条件为温度20～27℃，湿度85％～90％，光照强度先设定为15～25μmol m^-2.s^-1；3～5周后光照强度改为30～40μmol m^-2.s^-1；2个月后，获得杉木苗(移栽至温室大棚中种植的杉木苗，存活率达到95％以上)。

作为本发明的杉木组织培养快速繁殖方法的进一步改进，所述步骤1)为：

将枝条先在流水下冲洗0.5～2h，用毛刷刷洗(用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷刷洗)，再用自来水冲洗(以滴水的形式冲洗)60～90min，用蒸馏水冲洗(冲洗3～5次)，吸干水分后，将枝条上的针叶(密集针叶)修剪至长度为1±0.2cm(便于后续消毒处理)，于超净工作台中以75％(体积％)乙醇溶液浸泡30～60s，立即用0.1～0.5％(体积％)升汞溶液消毒8～10min，无菌水冲洗3～5次后用无菌滤纸吸干表面的水分(备用)。

备注说明：针叶密集导致消毒效果不理想，将枝条修剪后，便于操作，消毒效果好。

作为本发明的杉木组织培养快速繁殖方法的进一步改进：

诱导培养基为：CLM(杉木组培快繁培养基)+0.2mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8；

增殖培养基为：CLM+1mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8；

生根培养基：1/2CLM+1mg/L NAA+VB₁₂ 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8。

作为本发明的杉木组织培养快速繁殖方法的进一步改进，杉木组培快繁培养基(CLA)配方如下所示：

本发明的杉木组织培养法，属于一种以茎段快速繁殖的组织培养方法；依照植物组织培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长势一致的优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中，将生长健壮的杉木茎段进行催芽，并割取小芽进行消毒；再通过合适的诱导培养基进行诱导不定芽以及增殖不定芽，可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需45～60天即可得到可出瓶种植的种苗。所以，本发明的杉木茎段的组织培养法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质杉木种苗的方法，可以加速良种推广速度，提高田间品种种植产量。

综上所述，本发明建立的杉木组织培养体系将为良种工厂化育苗提供理论依据和技术支撑。

依照本发明的方法，只需30～45天(步骤3)～步骤4)所需时间)即可获得试管苗；增殖倍数为5～10倍，因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。

综上所述，本发明的杉木的组织培养法具有如下特点：1、繁殖系数高(5～10倍)，增值周期短(步骤3)所需时间为14～20天)；2、增值阶段不诱导根原基发育，不定芽的增殖一致性好。3、种苗质量好，移栽成活率高达95％以上。

注：增殖倍数＝有效芽总数/接种芽苗数量，有效芽指1cm以上的芽条。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1为外植体诱导不定芽的示意图；

图2为分化出芽的示意图；

图3为分化出根的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：杉木组织培养快速繁殖方法，以杉木幼嫩枝条(带菌的杉木幼嫩枝条)为初始外植体；

杉木组织培养快速繁殖不同培养阶段的培养基如下表1：

表1

培养基	配制方法
		诱导培养基	CLM+0.2mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8
增殖培养基	CLM+1mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8
		生根培养基	1/2CLM+1mg/L NAA+VB<sub>12</sub> 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8

即，

诱导培养基的制备方法为：在1L的CLM培养基中加入0.2mg的NAA、30g的蔗糖、7g的琼脂粉/L，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。

增殖培养基的制备方法为：在1L的CLM培养基中加入1mg的NAA、30g的蔗糖、7g的琼脂粉/L，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。

生根培养基的制备方法为：在1L的1/2CLM培养基(即溶液中所有物质的含量为CLM基本培养基的一半)中加入1mg的NAA+1mg的VB₁₂、30g的蔗糖、7g的琼脂粉，利用1mol/L的KOH或1mol/L的HCl调节pH为5.8。

杉木组培快繁培养基(CLA)的基本配方见下表2。

表2、杉木组培快繁培养基(CLA)配方

即，1L杉木组培快繁培养基(CLA)由如下浓度的成分和作为余量的水组成，然后经高温灭菌(为常规的高温灭菌，一般为在1.1个大气压，121℃下灭菌20min)。

依次进行以下步骤：

1)、外植体采集及消毒：

采用杉木树桩基部当年生萌动状态的健康枝条(即，满足生长健壮、无病害的枝条)作为外植体，在流水下冲洗0.5～2h，用沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷刷洗(刷洗的目的是为了去除表面灰尘、死组织和污染物)，再用自来水以滴水的形式冲洗60～90min，用蒸馏水冲洗3～5次(每次冲洗时间为约1分钟)，吸干水分后，将枝条上的叶片修剪至1cm左右(便于后面消毒处理)，于超净工作台中以75％(体积％)乙醇溶液浸泡30～60s，立即用0.1～0.5％(体积％)升汞溶液消毒8～10min，无菌水冲洗3～5次(每次冲洗时间为约1分钟)后，用无菌滤纸吸干表面的水分备用。

2)、诱导不定芽：

将上述消毒处理后的枝条，剪成约1.5cm的茎段，再将所述茎段上的叶片修剪至长度为0.5cm，接种到培养基中进行培养，直至茎段上诱导生成1～3cm高的不定芽；培养条件光照16小时/天，光照强度为1600lx，置于培养温度为25±2℃，空气相对湿度为75％，如图1。所需时间约为50～60天。

3)、不定芽增殖：

割取步骤2)所得的不定芽接种到增殖培养基中进行增殖培养；直至长至3～6cm高；培养条件光照16小时/天，光照强度为1600lx，置于培养温度为25±2℃，空气相对湿度为75％，如图2。所需时间约为14～20天。

4)、分化生根；

将步骤3)增殖获得的植株(即长至3～6cm高的不定芽)接种到生根培养基中进行分化生根，直至获得长度≥4cm(一般为4～8cm)且至少有3条长于2cm根的植株；培养条件光照16小时/天，光照强度为1600lx，置于培养温度为25±2℃，空气相对湿度为75％，如图3。所需时间约为16～25天。

5)、炼苗移栽：

将步骤4)所得的植株(瓶苗)移至室温(25℃左右)打开瓶盖，一周后出瓶，洗去附着于根部的培养基(生根培养基)并晾干至根系发白，移栽至基质容器中培养。置于人工气候箱室培养，培养条件为温度25±2℃，湿度85％，光照强度15～25μmol m-2.s-1；3～5周后光照强度改为30～40μmol m-2.s-1；2个月后，获得杉木苗(移栽至温室大棚中种植的杉木苗)，存活率达到95％以上。

增殖倍数约为5～10倍。

对比例1-1、将实施例1中的“CLA培养基”改成“1/2MS基本培养基”，其余等同于实施例1。

对比例1-2、将实施例1的CLA培养基中的“NH₄Cl”改成“NH₄NO₃”，保持总N元素不变，其余等同于实施例1。该配方的CLA培养基中，铵态氮：硝态氮＝1:1。

对比例1-3、将实施例1的CLA培养基中的“NH₄NO₃”改成2mol/L，“NH₄Cl”改成14mol/L，其余等同于实施例1。该配方的CLA培养基中，铵态氮：硝态氮＝7:1。

对比例1-4、将实施例1的CLA培养基中的硫酸亚铁的用量由“150μmol/L”改成“100μmol/L”，其余等同于实施例1。

对比例1-5、将实施例1的CLA培养基中的硫酸亚铁的用量由“150μmol/L”改成“200μmol/L”，其余等同于实施例1。

对比例2-1、取消生根培养基中的“VB₁₂”的使用，其余同实施例1。

对比例2-2、将生根培养基中“VB₁₂”的浓度由“1mg/L”改成“2mg/L”；其余等同于实施例1。

将上述所有案例的“步骤2)、诱导不定芽”设定成直至茎段上诱导生成2cm高的不定芽，“步骤3)、不定芽增殖”设定成直至长至5cm高，“步骤4)、分化生根”设定成直至获得长度≥4cm(一般为4～8cm)且至少有3条长于2cm根的植株；所需时间、存活率、增殖倍数的对比如下表3所述。

表3

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.杉木组织培养快速繁殖方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)、外植体采集及消毒：

2)、诱导不定芽：

诱导培养基为：CLA+0.2mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8；

3)、不定芽增殖：

增殖培养基为：CLA+1mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8；

4)、分化生根；

将步骤3)所得的不定芽接种到生根培养基中进行分化生根，直至获得长度≥4cm且至少有3条长于2cm根的植株；

生根培养基：1/2CLA+1mg/L NAA+VB₁₂ 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉7g/L，PH5.8；

1L杉木组培快繁培养基CLA由如下浓度的成分和作为余量的水组成，然后经高温灭菌；

5)、炼苗移栽：

将步骤4)所得的植株进行炼苗移栽。

2.根据权利要求1所述的杉木组织培养快速繁殖方法，其特征是所述步骤5)为：

将步骤4)所得的瓶苗移至室温打开瓶盖，一周后出瓶，洗去附着于根部的培养基并晾干至根系发白，移栽至基质容器中置于人工气候箱室培养，培养条件为温度20～27℃，湿度85％～90％，光照强度先设定为15～25μmol·m^-2·s^-1；3～5周后光照强度改为30～40μmol·m^-2·s^-1；2个月后，获得杉木苗。

3.根据权利要求1所述的杉木组织培养快速繁殖方法，其特征是所述步骤1)为：

将枝条先在流水下冲洗0.5～2h，用毛刷刷洗，再用自来水冲洗60～90min，用蒸馏水冲洗，吸干水分后，将枝条上的针叶修剪至长度为1±0.2cm，于超净工作台中以75％乙醇溶液浸泡30～60s，立即用0.1～0.5％升汞溶液消毒8～10min，无菌水冲洗3～5次后用无菌滤纸吸干表面的水分。