CN108289976B - 可再吸收交联形式稳定膜 - Google Patents

Abstract

本发明涉及：‑可再吸收交联形式稳定膜，其包含夹在两层弹性预张紧胶原蛋白材料之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，所述复合层含有每1重量份胶原蛋白材料1.5至3.5重量份无机陶瓷，所述胶原蛋白材料包含50‑100％(w/w)的胶原蛋白和0‑50％(w/w)的弹性蛋白，‑上述经交联的可再吸收交联形式稳定膜，用作植入物以支持在人或动物的非含有牙骨缺陷部位处的骨形成、骨再生、骨修复和/或骨置换，‑制备上述经交联的可再吸收交联形式稳定膜的方法，包括以下步骤：(a)制备无机陶瓷颗粒和胶原蛋白材料的复合层，可选的是交联该复合层，(b)将所述胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层组装并粘合在两个经受张紧而导致胶原蛋白材料拉伸至应力‑应变曲线的线性区中的胶原蛋白材料层之间，由此得到夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，以及(c)使所述夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层交联，随后进行亲水化处理。

Description

可再吸收交联形式稳定膜

本发明涉及用于口腔的新型可再吸收交联形式稳定膜，该膜的制备方法及其作为用作植入物以支持在人或动物的非含有牙骨缺陷部位(a non-containing dental bonydefect site)处的骨形成、骨再生、骨修复和/或骨置换的用途。

为了通过骨形成再生非含有骨缺陷，例如，在上颌骨或下颌骨的水平或垂直增大中，需要对缺陷进行机械稳定(Bendkowski 2005"Space to Grow"The Dentist:3；Merli,Migani等，2007Int.J.Oral Maxillofac.Implants 22(3):373-82；Burger 2010J.OralMaxillofac.Surg.68(7):1656-61；Louis 2010Oral Maxillofac.Surg.Clin.North Am.22(3):353-68)。事实上，口腔组织在咀嚼、吞咽、舌头运动、言语、牙齿移动和正畸治疗期间暴露于复杂的机械力。特别是在外科手术后的伤口愈合期间，可能产生内部力和外部力，在再生装置和新形成的组织上产生压力、剪切力和弯曲力矩。

抵抗这些力的形式稳定膜是实现机械稳定的有用手段。

为此目的已知使用Ti网、Ti板或Ti增强PTFE形式稳定膜，在第二次手术期间必须在骨再生之后将其移除。可商售获得的Ti增强形式稳定膜的一个实例是Osteogenics销售的膜。然而，据报道当使用膨胀的Ti-增强膜时，较多出现开裂或其他并发症(Strietzel 2001Mund Kiefer Gesichtschir.5(1):28-32；Merli,Migani等，2007supra；Rocchietta,Fontana等，2008J.Clin.Periodontol.35(8Suppl):203-15)。

在1996年引入可再吸收胶原蛋白膜之前广泛使用非增强PTFE膜，但在胶原蛋白膜引入后很快消失。

为了避免需要在二次手术中去除形式稳定的膜或网状物，可再吸收的形式稳定膜是令人感兴趣的。已经描述了几种可再吸收的形式稳定的膜或网状物，其基本上由PLA(聚乳酸)或PLGA(聚乳酸-共-乙醇酸)制成。实例特别是(1)来自KLS Martin的“Sonic”和“Resorb-”，(2)来自Sunstar Americas的(3)来自Curasan的“Inion GTR System^TM”和(4)来自Depuy Synthes的这些膜的缺点在于，在其体内水解降解过程中，它们释放引起组织刺激和伤口愈合受干扰的组织学迹象的乳酸和/或乙醇酸(Coonts,Whitman等，1998Biomed.Mater.Res.42(2):303-11；Heinze2004Business briefing:Lobal Surgery:4；Pilling,Mai等，2007Br J.OralMaxillofac.Surg.45(6):447-50)。

为了克服PLGA/PLA相关的伤口愈合问题，使用来自患者的自体骨块以及部分或完全纯化的骨块，例如，Geistlich Bio-Block(Geistlich Pharma A.G.)或Allograft Block(RTI Surgical Inc.)被广泛接受。自体骨块的缺点是它们从第二部位采集，导致更多的疼痛。(Esposito,Grusovin等，2009Eur.J Oral Implantol.2(3):167-84)

为了能够使用手术期间收获的自体骨碎片，通常与异种骨移植颗粒组合，使用来自下颌骨的自体皮质骨开发了所谓的骨盾(bone shield)技术(Khoury,Hadi等，2007"BoneAugmentation in Oral Implantology",London,Quintessence)。该过程的缺点在于它是极其技术敏感性的，并且与第二部位的发病率和更多的疼痛有关。此外，骨盾仅侧向施加，因此从缺陷的冠状面并没有给予机械保护。术语“骨盾”用于对PLA/PLGA膜以及部分去矿物质的皮质骨盾进行推广(来自Tecnoss的半软或软薄板)。这种去矿物质的骨盾的缺点是弯曲的骨盾必须始终固定，使得它们例如与Ti-增强PTFE膜相比比较厚，并且它们只能在骨缺陷的冠状面上形成弯曲边缘的圆形。对于牙医来说，牙脊的冠状面上6-8毫米宽的平台(plateau)更受欢迎(Wang and Al-Shammari 2002Int.J.PeriodonticsRestorative Dent.22(4):335-43)。

结合良好愈合和形式稳定性的尝试是在US-8353967-B2中公开的可再吸收形式稳定胶原蛋白膜，其通过冷冻干燥并在100至140℃加热而从在模具中的5-25％乙醇/水中的胶原蛋白悬浮液制备。这种膜由美国的Osseous Technologies制造，并且由Zimmer以商品名“Zimmer CurV Preshaped Collagen Membrane”销售。该商业膜具有弱形式稳定性和约1.5mm的厚度，在盐水中温育后增加至约2.3mm；这可能导致高开裂率的风险。

总而言之，因此对于牙医或患者而言，目前的解决方案并不完全令人满意。或者必须进行二次手术，以及/或者存在高风险的伤口愈合不良。与高风险的伤口愈合不良无关的解决方案或者不是形式稳定膜，需要二次手术或者具有其他缺点。

US2013/0197662公开了一种用于制造生物材料的方法，所述方法包括a)通过将控制量的包含胶原蛋白的凝胶涂覆到无孔胶原蛋白基材料的结合表面，并使多孔胶原蛋白基材料表面与涂覆到结合表面的凝胶接触以部分水合位于材料之间界面处的一部分多孔材料，从而将多孔胶原蛋白基材料与无孔胶原蛋白基材料结合；b)干燥所述凝胶以将材料粘合在一起；和c)使粘合层中的胶原蛋白交联。所获得的制造的生物材料结合了可以矿物质化[0042],[0048]的多孔胶原蛋白基材料和机械强度高的非多孔胶原蛋白基材料，因此提供用于使承载组织(特别是半月板、关节软骨、肌腱和韧带)再生的支架，其具有孔隙率和机械强度，即能够抵抗压缩力和拉伸力。没有公开关于该组合生物材料的抗弯曲力矩或矿物质化的多孔胶原蛋白基材料的组成。

US2014/0193477教导了在由可溶性胶原蛋白制备胶原蛋白垫时，在其交联之前拉伸胶原蛋白增加其机械强度，特别是极限拉伸强度(UTS)、刚度和弹性模量(杨氏模量)(具体参见[0109]，[0110])。

Langdon,Shari E等，Biomaterials 1998,20(2),137-153CODEN和Chachra,Debbie等，Biomaterials 1996,17(19),1865-1875CODEN公开了在交联之前拉伸心包衍生膜增加其拉伸强度和刚度。

本发明的目的是提供用于口腔的可再吸收形式稳定膜(resorbable form stablemembrane)，其易于抵抗压力、剪切力和弯曲力矩，以致于支持非含有骨缺陷部位处(non-containing bony defect site)，特别是在上颌骨或下颌骨的水平或垂直增大部位的骨形成、骨再生、骨修复和/或骨置换，其没有上述缺点。

该目的通过如所附权利要求限定的本发明来实现。

本发明提供了用于口腔的可再吸收交联形式稳定膜，其包含夹在两个弹性预张紧(pretensed)胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，所述复合层含有每1重量份胶原蛋白材料1.5至3.5重量份无机陶瓷，所述胶原蛋白材料包含50-100％(w/w)胶原蛋白和0-50％(w/w)弹性蛋白。

此处的术语“胶原蛋白材料”是指包含50-100％(w/w)胶原蛋白和0-50％(w/w)弹性蛋白的胶原蛋白基材料(collagen-based material)。弹性蛋白含量在这里通过根据涉及水解和RP-HPLC的已知方法的修改方案的锁链素/异锁链素(desmosine/isodesmosine)测定来测量(例如参见Journal of Chromatography中的Guida E.等，1990Developmentand validation of a high performance chromatography method for thedetermination of desmosines in tissues或者The Open Respiratory MedicineJournal中的Rodriguqe P 2008Quantification of Mouse Lung Elastin DuringPrenatal Development)。为了确定干弹性蛋白的锁链素/异锁链素含量，将胶原蛋白材料的弹性蛋白进行如1976年Starcher和Galione所述的弹性蛋白分离程序(AnalyticalBiochemistry中的Purification and Comparison of Elastin from Different AnimalSpecies)。

该胶原蛋白材料适合地来源于含有如此比例的胶原蛋白和弹性蛋白的天然来源的组织。此类组织的实例包括脊椎动物特别是哺乳动物(例如猪、牛、马、羊、山羊、兔)的腹膜或心包膜、胎盘膜、小肠粘膜下层(SIS)、真皮、硬脑膜、韧带、肌腱、膈肌(胸膈)、网膜、肌肉或器官的筋膜。这种组织优选是猪、牛或马。一种令人感兴趣的组织是猪、牛或马的腹膜。

通常胶原蛋白主要是I型胶原蛋白、III型胶原蛋白或其混合物。所述胶原蛋白还可以包括一定比例的II型、IV型、VI型或VIII型胶原蛋白或其任何组合或任何胶原蛋白类型。

优选所述胶原蛋白材料含有70-90％(w/w)的胶原蛋白和30-10％(w/w)的弹性蛋白。

用于制备此类胶原蛋白材料的合适起始材料的实例是通过类似于EP-B1-1676592的“实施例”中所述的方法制备的、来自猪、牛或马腹膜或心包膜的胶原蛋白膜，或者是通过这种方法由猪腹膜制备的膜Geistlich Bio-(可由瑞士Geistlich Pharma A.G.获得)。

优选地，所述胶原蛋白材料来源于猪、牛或马的腹膜或心包膜、小肠粘膜(SIS)或肌肉筋膜。

所述胶原蛋白材料通常优选为纤维胶原蛋白材料，或者具有天然纤维结构或者作为切割胶原蛋白纤维。

然而，非纤维胶原蛋白材料，例如由分子胶原蛋白复原的原纤维或具有足够生物相容性和可再吸收性的交联胶原蛋白片段也可以用于所述胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层中，或者用在弹性预张紧胶原蛋白材料层中，条件是胶原蛋白材料在弹性模量以及最大拉伸强度方面具有足够的机械稳定性(参见下文)。

此处术语“可再吸收的”是指交联形式稳定膜能够通过胶原蛋白酶和弹性蛋白酶的作用显著地在体内被吸收。交联形式稳定膜的受控体内可再吸收性对没有过度的炎症或开裂的愈合至关重要。下文详细描述的使用来自溶组织梭菌(Clostridium histolicum)的胶原蛋白酶(实施例4、3)的酶促降解测试给出了体内可再吸收性的优异预测。

经测试的本发明可再吸收交联形式稳定膜的所有测试模型(prototype)显示4小时后至少10％胶原蛋白降解(通过使用I型胶原蛋白作为标准的DC蛋白测定评估)，胶原蛋白降解速率(低于Geistlich Bio-膜)取决于所用的交联条件。

术语“交联”是指可再吸收形式稳定膜已经进行至少一个交联步骤，通常是化学交联(使用例如EDC和NHS)或通过脱氢热处理(DHT)进行交联，该步骤通常通过化学交联(使用例如EDC和NHS)或通过脱氢热处理(DHT)在组装的夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层上进行。可选的是，所述胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层在组装到本发明的膜中之前已经交联，通常通过化学交联或通过脱氢热处理(DHT)进行。

术语“用于口腔的形式稳定膜”是指通过提供对缺陷的机械稳定化即抵抗在口腔中产生的压力、剪切力和弯曲力矩，可再吸收交联膜能够在人或动物的非含有(non-containing)牙骨缺陷部位处支持骨形成、骨再生、骨修复和/或骨置换。本发明的膜的形式稳定性通过下面详细描述(在实施例4 2中)的3点单轴弯曲测试进行评估：该测试类似于ENISO 178和ASTM D6272-10中所述的方法，将本发明的膜浸入pH 7.4和温度37℃的PBS中。该测试显示本发明的膜提供比竞争性PLA膜Resorb-(KLS Martin)实质上更强的稳定性。

通常，在3点单轴弯曲测试中，对于8mm应变，可再吸收交联形式稳定膜抵抗至少0.20N，优选至少0.30N的力。

术语“弹性预张紧胶原蛋白材料层(layers of elastic pretensed collagenmaterial)”是指在它们交联之前，胶原蛋白材料层已经受到张紧作用，导致胶原蛋白材料层的初始尺寸从应力-应变曲线的趾部区域(toe region)伸长或拉伸进入线性(也称为弹性)区(参见Blayne A.Roder等，2002,Journal of Biomechanical Engineering,124,214-222，特别是第216页图3，或本申请的图5)。在这个线性区内，弹性模量最高，因此可以达到最高的刚度。该张紧(tensioning)可以在胶原蛋白材料块(pieces)上例如通过弹簧径向进行。导致胶原蛋白材料伸长或拉伸到应力-应变曲线的线性区所施加的力取决于胶原蛋白材料。当胶原蛋白材料来源于猪、牛或马的腹膜时，导致胶原蛋白材料的应力-应变曲线的线性区的张紧(tensioning)可以在胶原蛋白材料块上径向地进行，例如通过张力在1至3N的弹簧，导致胶原蛋白材料层的初始尺寸伸长或拉伸40％至100％。

因此术语“弹性预张紧胶原蛋白材料”意指已经被拉伸以致于处于应力-应变曲线的线性/弹性区的胶原蛋白材料。

弹性预张紧胶原蛋白材料的弹性模量(也称为杨氏模量)，即以MPa表示的应力-应变曲线的线性区的斜率，通常为1至1000MPa，优选2至150MPa，特别是从5到80MPa。

夹着胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层的那两个“弹性预张紧胶原蛋白材料”层的存在似乎在所述膜受到拉伸、压缩、剪切力和弯曲力矩时对于防止复合层破裂是必要的。

优选的是弹性预张紧胶原蛋白材料层之一包含5-500μm的孔。当膜处于弹性预张紧胶原蛋白材料的刺穿层将朝向骨缺陷取向的位置时，这些孔允许骨形成细胞容易侵入无机陶瓷-胶原蛋白复合材料。

所述无机陶瓷是促进骨再生的生物相容性材料，例如羟基磷灰石或天然骨矿物质。

促进牙齿、牙周和上颌骨骨缺陷中骨生长的公知天然骨矿物质是Geistlich Bio-可从Geistlich Pharma AG购得。该羟基磷灰石基骨矿物质材料通过美国专利第5,167,961号中描述的方法由天然骨制造，其能够保存天然骨的小梁结构和纳米晶体结构。

优选地，所述无机陶瓷是基于羟基磷灰石的天然骨矿物质，例如，Geistlich Bio-

所述无机陶瓷颗粒通常具有50至600μm，优选150至500μm，特别是250至400μm的尺寸。

所述胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合物包含每1重量份胶原蛋白材料1.5-3.5重量份，优选2.0-3.0重量份无机陶瓷。

事实上，出乎意料地发现，如果相对于每1重量份胶原蛋白材料而言少于1.5重量份的无机陶瓷或相对于每1重量份胶原蛋白材料而言多于3.5重量份的无机陶瓷，则膜不是如上定义的和通过下面详细描述的3点单轴弯曲测试(在实施例4.2中)评估的“形式稳定的”。当胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合物包含每1重量份胶原蛋白材料2.0-3.0重量份无机陶瓷时形式稳定性特别高。

本发明的可再吸收交联形式稳定膜是亲水性的，通常在5至10分钟内被PBS完全润湿。

本发明的可再吸收交联形式稳定膜具有类似于Geistlich Bio-的细胞粘附性质，Geistlich Bio-以其具有低开裂率或过度炎症的良好愈合性质而众所周知。这表明具有良好的愈合性能而没有不良事件，例如开裂或过度炎症。

当植入本发明的交联形式稳定膜以防止在兔子头骨中产生的骨缺陷时已经观察到了这种良好的愈合性质。

本发明的可再吸收交联形式稳定膜的厚度通常为0.5-2.5mm，优选1.0-2.0mm，特别是1.2-1.8mm。

图1中示出本发明的可再吸收交联形式稳定膜的典型形状和典型尺寸。

本发明还涉及上述可再吸收交联形式稳定膜用作植入物以支持人或动物的非含有牙骨缺陷部位处的骨形成、骨再生、骨修复和/或骨置换。

本发明还涉及制备上述定义的可再吸收交联形式稳定膜的方法，所述膜包括夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，该方法包括以下步骤：

(a)制备胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，可选的是交联该复合层，

(b)将所述胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层组装并粘合在两个经受张紧作用而导致胶原蛋白材料伸展至应力-应变曲线的线性区中的胶原蛋白材料层之间，由此得到夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，以及

(c)使所述夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层交联，随后进行亲水化处理(hydrophilic making treatment)。

步骤(a)可以通过以下来进行：

‐通过与US-A-5417975中描述的方法相似的方法，或者将Geistlich Bio-OssSmall Granules(可由Geistlich Pharma AG获得)研磨成更小的颗粒，从而得到来自皮层或松质骨的羟基磷灰石骨矿物质颗粒作为无机陶瓷颗粒，并使这些颗粒在期望的范围内(例如150-500μm或250-400μm)进行筛分，由此得到经筛分的羟基磷灰石骨矿物质颗粒。

‐如下制备纤维胶原蛋白材料

o将来自猪、牛或马腹膜或心包膜的富含胶原蛋白的组织经与EP-B1-1676592的实施例中所描述的方法类似的方法处理，或者从通过这种方法从猪腹膜获得的GeistlichBio-Gide膜(可由Geistlich Pharma AG获得)或从Geistlich Bio-Gide膜的工业生产中灭菌之前获得的中间产物，在此称为未灭菌的Geistlich Bio-Gide膜开始，

o将由此获得的胶原蛋白纤维组织切成块(例如用剪刀)，用刀磨机将这些被切割的胶原蛋白纤维组织块与干冰混合，由此得到切割的胶原蛋白纤维，

o用带筛的切磨机切割胶原蛋白纤维组织块，从而得到胶原蛋白纤维碎片的筛分级分。

‐通过如下制备纤维胶原蛋白材料和羟基磷灰石骨矿物质颗粒的复合层

o将0至40重量％的切割胶原蛋白纤维和60至100重量％上述得到的胶原蛋白纤维碎片的筛分级分在磷酸盐缓冲盐水PBS中混合并摇动，

o将1.5至3.5重量份，特别是2.0至3.0重量份的如上获得的经筛分羟基磷灰石骨矿物质颗粒加入到1重量份如上获得的纤维胶原蛋白中，在2000至6000×g，优选3000至5000×g下离心，将所得球团浇注成矩形并使用刮刀形成平板。将获得的纤维胶原蛋白材料和羟基磷灰石骨矿物质颗粒的复合层在真空烘箱中干燥。

在(a)结束时将胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的干燥复合层交联不是必需的，但其具有在步骤(b)期间有助于处理该复合层的优点。

该交联可以使用化学品进行或通过脱氢热处理(DHT)进行。

可以使用任何能够赋予交联形式稳定膜所需的机械强度的药学上可接受的交联剂来进行使用化学品的交联。合适的这种交联剂包括戊二醛、乙二醛、甲醛、乙醛、1,4-丁烷二缩水甘油醚(BDDGE)、N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、六亚甲基二异氰酸酯(HMDC)、氰胺、二苯基磷酰基叠氮化物、京尼平(genipin)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)以及EDC和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的混合物。

使用化学品的交联可方便地使用EDC和NHS的混合物进行。

在那种情况下，如上获得的纤维胶原蛋白材料和羟基磷灰石骨矿物质颗粒的干燥复合层可以于10-400mM EDC和13-520mM NHS在0.1M MES(2-(N-吗啉代)-乙磺酸)和40％乙醇的溶液中于pH 5.5在室温下交联1至3小时。然后可以通过在pH9.5的0.1M Na₂HPO₄缓冲液中温育模型1至3小时两次来终止反应。通过将模型在1M氯化钠溶液中温育1小时并在2M氯化钠溶液中温育1小时两次来去除极性残留物。化学交联的模型可以在蒸馏水中洗涤30-60分钟共8次。然后可以通过如下进行干燥：在乙醇中浸渍15分钟共5次，然后乙醚处理5分钟三次，然后在10mbar和40℃下干燥过夜，或通过冷冻干燥(冷冻至低于-5℃并通过常规冷冻干燥处理进行干燥)。

或者，通过在0.1-10mbar和80-160℃下脱氢热处理(DHT)进行交联1-4天。在这种情况下，不需要后续的干燥方法。

步骤(b)可以如下进行：

‐如下制备胶原蛋白纤维胶

o使用高压均化器在1500-2000巴下将以上胶原蛋白碎片的筛分级分在pH3.5的H₃PO₄水溶液中以3％的浓度混合，将该混合重复数次，

o通过加入氢氧化钠溶液中和所得浆料至pH 7.0，通过冷冻干燥浓缩胶原蛋白并通过刀磨将其匀质化，

o通过加热至60℃直至观察不到其它颗粒，由作为在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水PBS中2-10％溶液得到的的浆液制备胶原蛋白纤维胶，以及

‐使用例如类似于图2的设备，将两个预先润湿的胶原蛋白材料层经受张紧作用，导致所述胶原蛋白材料拉伸在应力-应变曲线的线性区中，从而得到两个湿弹性预张紧胶原蛋白材料层，

将在(a)中获得的吸收有上述胶原蛋白纤维胶的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒复合层插入上述两个湿弹性预张紧胶原蛋白材料层之间，

使用例如类似于图3的设备，将这两个湿弹性预张紧胶原蛋白材料层压在吸收有胶原蛋白纤维胶的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层上，以及

在35至45℃的温度和减压(例如20至1mbar)下干燥夹在两个湿弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层。

在上述过程中，预先润湿的胶原蛋白材料层中的一层可能已经用针进行穿刺，从而包括5-500μm的孔。

在步骤(c)中，可以使用化学品(使用例如EDC和NHS)或通过脱氢热处理DHT来交联夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层。

可以使用任何能够赋予交联形式稳定膜所需的机械强度的药学上可接受的交联剂来进行化学交联。合适的这种交联剂包括戊二醛、乙二醛、甲醛、乙醛、1,4-丁烷二缩水甘油醚(BDDGE)、N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮基-2'-硝基苯基氨基)己酸酯、六亚甲基二异氰酸酯(HMDC)、氰胺、二苯基磷酰基叠氮化物、京尼平、EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)以及EDC和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的混合物。

使用化学品的交联可方便地使用EDC和NHS的混合物进行。

在那种情况下，如上获得的纤维胶原蛋白材料和羟基磷灰石骨矿物质颗粒的干燥复合层可以于10-400mM EDC和13-520mM NHS在0.1M MES(2-(N-吗啉代)-乙磺酸)和40％乙醇的溶液中于pH 5.5在室温下交联1至3小时。然后可以通过在pH 9.5的0.1M Na₂HPO₄缓冲液中温育模型1至3小时两次来终止反应。通过将模型在1M氯化钠溶液中温育1小时并在2M氯化钠溶液中温育1小时两次来去除极性残留物。化学交联的模型可以在蒸馏水中洗涤30-60分钟共8次。然后可以通过如下干燥：在乙醇中浸渍15分钟共5次，然后乙醚处理5分钟三次，然后在10mbar和40℃下干燥30分钟，或通过冷冻干燥(冷冻至低于-10℃并通过常规冷冻干燥处理进行干燥)而无需溶剂处理。

或者，通过在0.1-10mbar和80-160℃下脱氢热处理(DHT)进行交联1-4天。在这种情况下，不需要后续的干燥方法。

步骤c)的亲水化处理通常包括将夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的经交联复合层浸入生理上可接受的盐溶液中，例如氯化钠溶液)，优选100-300g/l，特别是150-250g/l的氯化钠溶液，使其亲水。

优选的是所述亲水制作处理包括将夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的经交联复合层浸入氯化钠溶液中，使其亲水。

本发明的可再吸收交联形式稳定膜可以通过X射线、β射线或γ射线进行灭菌。

附图说明

下面将参考本发明的优选实施方式的说明性实例和附图来更详细地描述本发明，其中：

图1表示根据本发明的可再吸收交联形式稳定膜的典型形状和典型尺寸。这些膜可以是扁平的(1),(1')，U形笔直的(2),(2')或U形弯曲的(3),(3')，对应于位于义齿前部、左侧或右侧曲部或在后部的1至3颗牙齿(门齿、犬齿、前臼齿或臼齿)的牙槽空间。

前部产品的尺寸与后部产品的尺寸相似，曲率半径与牙槽嵴一致。

典型的尺寸是a＝5-20nm，b＝8-20mm，c＝6-10mm，d＝25-40mm，e＝15mm，f＝20-40mm。

图2是适用于在将聚合物层组装成本发明的扁平或U形形式稳定膜之前能够使所述聚合物层张紧的设备的示意图。

图3表示扁平形式稳定膜的组件，其中(1)是钢板，(2)是压缩聚氨酯海绵，(3)是聚酰胺网，(4)是个弹性预张紧胶原蛋白层，以及(5)是交联的羟基磷灰石-胶原蛋白板。

图4表示与PLA膜Resorb-(KLS Martin)相比，在通过EDC/NHS或DHT交联的本发明的可再吸收形式稳定膜的三点弯曲分析测试中作为应变函数的力的变化。

图5表示可用于根据本发明的可再吸收交联形式稳定膜的弹性预张紧胶原蛋白材料层中的一些市售湿润无菌胶原蛋白材料的应力-应变曲线，即猪腹膜来源的GeistlichBio-胶原蛋白膜(Geistlich Pharma AG)、猪心包膜来源的胶原蛋白膜(aapBiomaterials/Botiss)和猪SIS来源的胶原蛋白膜(Cook Biotech Inc.)，以及来源自肌肉筋膜的胶原蛋白材料。在这些应力曲线的每一个中，都有以最小应力值时有大应变为特征的脚趾区(toe region)，以单位应力的应变线性增加为特征的线性或弹性区，以及以聚合物纤维断裂为特征的失效区。在该图中表示的应力-应变曲线中，GeistlichBio-膜的弹性模量(或杨氏模量，即应力-应变曲线的线性区的斜率)约为8MPa，Jason膜为约64MPa，膜为约54MPa，来源自肌肉筋膜的胶原蛋白材料为约56MPa。

图6是对于Geistlich Bio-胶原蛋白膜、通过DHT交联的本发明的可再吸收形式稳定膜的模型(FRM)和Cystoplast PTFE膜(Keystone Dental)而言在37℃于PBS中温育24小时后已粘附于膜的人牙龈成纤维细胞的百分比的柱状图。

以下实施例用于描述说明本发明而并非限制其范围。

实施例

实施例1 原料的制备

制备尺寸为250至400μm的羟基磷灰石细颗粒(A)

如US-A-5417975的实施例1至4中所述，使用额外的250-400μm的筛分步骤从皮质或松质骨制备羟基磷灰石骨矿物质细颗粒。

或者，通过使用喷枪(pistol)和额外的250-400μm的筛分步骤的仔细冲击，通过研磨Geistlich Bio-Small Granules(可由Geistlich Pharma AG，CH-6110，瑞士获得)来生产羟基磷灰石骨矿物质细颗粒。

将上述制备的尺寸为250-400μm的羟基磷灰石骨矿物质细颗粒(A)保存于玻璃瓶中备用。

制备胶原蛋白纤维(B)

如EP-B1-1676592的“实施例”中所述，来自幼猪的腹膜通过机械手段完全从肉和油脂中剥离，在流水中洗涤并用2％NaOH溶液处理12小时。然后将膜在流水中洗涤并用0.5％HCl酸化。材料在整个厚度上被完全酸化后(约15分钟)，将材料用水洗涤直到获得pH3.5。然后将材料用7％盐水溶液收缩，用1％NaHCO₃溶液中和并用流水洗涤。然后将材料用丙酮脱水，正己烷脱脂并使用乙醇醚干燥。

用剪刀手工切割2×2cm的如此获得的胶原蛋白膜块。

或者，用剪刀手工切割2×2cm的Geistlich Bio-膜(可得自GeistlichPharma AG)块。

将1g如上获得的2×2cm胶原蛋白膜块与200ml干冰混合并在刀磨机(Grindomix)中以5000rpm混合直至不发生堵塞。然后将速度增加至6000、7000、9000和10'000rpm，持续20至30秒，每次加入50ml干冰。

将干冰蒸发并将由此获得的胶原蛋白纤维(B)储存在Minigrip塑料包装中直至进一步使用。

制备切磨机胶原蛋白纤维片段(C)

将上述获得的2×2cm胶原蛋白纤维块在具有0.8mm筛的切磨机中以1500rpm的速度切割，得到切磨机胶原蛋白纤维片段(C)的筛分级分。

制备胶原蛋白纤维胶(D)

将切磨机胶原蛋白纤维片段(C)的筛分级分在水中混合以获得3％的溶液，通过添加磷酸H₃PO₄将pH设定为3.5，并且将悬浮液在1500-2000巴下高压均质化，重复3至5次。

通过加入氢氧化钠溶液NaOH将所得浆液中和至约pH 7，并在4℃胶凝过夜。在-40℃冷冻4小时后，在-10℃和0.310mbar下通过冷冻干燥浓缩胶原并通过刀磨进行匀质化。在-40℃冷冻4小时后，在-10℃和0.310mbar下通过冷冻干燥而浓缩胶原蛋白并通过刀磨进行均质化。

通过加热至60℃直至观察不到颗粒，由得到的作为磷酸缓冲盐溶液(PH 7.4)中2-10％溶液的浆液制备胶原蛋白纤维胶(D)。

实施例2 制备可选交联的羟基磷灰石/胶原蛋白板(E)

将实施例1中制备的4g胶原蛋白纤维(B)和6g切磨机胶原蛋白纤维片段(C)与140g磷酸盐缓冲盐水混合，并在鸡尾酒混合器中振荡。在另一个实例中，胶原蛋白纤维完全替换为切磨机胶原蛋白纤维片段。

加入实施例1中制备的20g羟基磷灰石细颗粒(A)并手动混合。

将34.14g该混合物在7000g(重力加速度的7000倍)下离心2分钟。

将球团(pellet)倒入8×12cm的扁平矩形形式的两个聚酰胺网(孔径21μm，总计17％的开放结构)中，并通过用实验室勺除去多余的水而冷凝。将获得的板在1-1.7kPa的压力下压缩，并在30℃/50mbar的真空烘箱中干燥2小时，然后在30℃/10mbar下干燥8小时。移除聚酰胺网。

羟基磷灰石-胶原蛋白板的可选交联

为了便于处理羟基磷灰石-胶原蛋白板，后者通过化学交联或通过脱氢热处理(DHT)交联。

进行胶原蛋白与EDC/NHS的化学交联，导致羟基磷灰石-胶原蛋白板平板的整体稳定性增加。然后在室温下，将干燥的平板在于0.1M MES(2-(N-吗啉代)-乙烷磺酸)和40％乙醇(pH 5.5)中的10-400mM EDC和13-520mM NHS中交联2小时。

通过在pH 9.5的0.1mol/l Na₂HPO₄缓冲液中温育模型1小时两次来停止反应。通过在1mol/l氯化钠溶液中温育模型1小时并在2mol/l氯化钠溶液中温育1小时两次来除去极性残留物。化学交联的模型在蒸馏水中洗涤30-60分钟共8次。然后在乙醇中浸渍15分钟共5次。然后乙醚处理5分钟三次，然后在10mbar和40℃下干燥30分钟，或通过冷冻干燥(冷冻至低于-10℃并通过常规冷冻干燥处理进行干燥)来进行干燥。

或者，通过在0.1-10mbar和80-120℃下脱氢热处理(DHT)进行交联1-4天。在这种情况下，不需要后续的干燥方法。

实施例3 通过在羟基磷灰石/胶原蛋白板(E)的两个相对面上组装和胶合两个弹性预张紧胶原蛋白层来制备可再吸收交联形式稳定膜(M)

参考图2和3将更好地理解以下描述。

扁平或U形模型的组装需要使用固定或可弯曲的框架，以实现胶原蛋白材料层的张紧。

形成扁平或U形模型(F)

图2是适用于在将胶原蛋白材料层组装成本发明的扁平或U形形式稳定膜之前能够使所述胶原蛋白材料层张紧的设备的示意图。

该设备由框架(a)组成，框架(a)可以由任何合适的材料制成，例如，钢或铝。框架的主要目的是锚固弹簧(b)，这可以拉紧两个湿胶原蛋白层(c)。羟基磷灰石/胶原蛋白板(E)位于两个胶原蛋白层(c)之间。

如果需要U形可再吸收交联形式稳定膜，则使用用于弯曲胶原蛋白板(E)和带有铰链(f)的框架的负形式(negative form)(e)，从而得到U形笔直模型。

未消毒的Geistlich Bio-Gide胶原蛋白层的胶原蛋白材料层通过每个弹簧2-3N张紧来延长或拉伸初始长度的40％至100％来预张紧，从而在胶原蛋白材料的应力曲线的线性区中。在该线性区内，弹性模量最高，因此达到最高刚度

由于胶原蛋白组织的粘弹性，润湿张紧的材料在张紧状态下保持约30分钟。由于预张紧胶原蛋白膜松弛，弹簧再次张紧至1-3N，从而处于胶原蛋白材料应力曲线的线性区。

使用由未消毒的Geistlich Bio-胶原蛋白膜切割的直径为10cm的两个圆形胶原蛋白块，其中一个用每cm²包含50根针且轴直径为0.88mm的针筒穿刺。将这两个圆形胶原蛋白块湿润并通过12个每个张紧至1-3N的弹簧以径向方式张紧，以致于胶原蛋白块伸长初始尺寸的40-100％。

完成此步骤后，羟基磷灰石/胶原蛋白板(E)用胶原蛋白纤维胶(C)在两面上润湿，然后将羟基磷灰石/胶原蛋白板放置在两个弹性预张紧胶原蛋白层之间。中心杆(e)以及铰链(f)对于生产U形样品是必要的(见下文)。

将弹性预张紧膜置于加热板上并预热至40℃。

将实施例2中获得的交联Bio-Oss板(E)短暂地浸没在预热的胶原蛋白纤维胶(D)中并放置在两个弹性预张紧胶原蛋白膜之间。

将聚酰胺网以及海绵(厚度5厘米，密度约20-25mg/cm³，含有互连孔，由聚氨酯制成)置于两侧，压缩50-95％，导致压缩压力高达120kPa。

参见图3，其表示扁平形式稳定膜的组装，其中(1)是钢板，(2)是压缩聚氨酯海绵，(3)是聚酰胺网，(4)是弹性预张紧胶原蛋白层，(5)是交联羟基磷灰石-胶原蛋白板。

随后，将该构建体在40℃的真空烘箱中干燥，同时气压稳定降低至10mbar，共32小时。

形成U形模型

本领域技术人员将容易地将图2和图3的装置和上述方法适用于通过将该构造物弯曲成适当的负形式并用较薄的聚氨酯海绵或无纤维纸巾替换其中一个海绵从而来形成U形笔直样品或弯曲样品。

交联扁平或U形模型(G)

使用剪刀或小圆锯将扁平或U形模型(F)切割成期望的尺寸。然后模型经化学交联或脱氢热处理(DHT)。

化学交联在EDC和NHS浓度分别为10-400mM和13-520mM、乙醇含量为40％(体积)、pH 5.5的0.1mol/L MES缓冲液中进行。交联溶液中的模型浓度为10％。为了实现均匀的交联，首先在真空(<40mbar)下处理板，并在4℃下进行交联反应2小时，将所有缓冲液预冷至该温度。

通过在pH 9.5的0.1M Na₂HPO₄缓冲液中温育样品1小时两次来终止反应。通过将样品在1M氯化钠溶液中温育1小时并在2M氯化钠溶液中温育1小时两次来去除极性残留物。样品在蒸馏水中洗涤30-60分钟共8次。然后如下进行干燥，即通过乙醇处理15分钟5次，然后乙醚处理5分钟三次，然后在10mbar和40℃下干燥过夜或直至产品完全干燥，或者通过未经溶剂处理的产品的冷冻干燥(冷冻至低于-10℃并通过常规冷冻干燥处理进行干燥)。

或者，通过在0.1-10mbar和80-160℃下脱氢热处理(DHT)进行交联1-4天。在这种情况下，不需要后续的干燥方法。

将通过上述方法获得的模型在盐水或PBS中一小时或两小时内润湿。为了在10分钟内润湿，模型在蒸馏水中再润湿约1至2小时。此时也可以用上述针筒刺穿一侧。通过在200g/l NaCl溶液中温育模型40分钟共三次来施加氯化钠。

干燥交联的扁平或U形样品(H)

通过在乙醇中浸渍15分钟共5次来使交联的样品脱水。然后通过或者溶剂干燥(乙醚处理5分钟三次，随后在10mbar和40℃下干燥)或者常规冷冻干燥(冷冻至低于-10℃并通过常规冷冻干燥处理进行干燥)来将它们干燥。

湿润状态下不同模型的交联形式稳定膜的厚度为1.0至2.0mm，其中大多数为1.2至1.8mm。

干燥的模型可选地通过27-33kGy的X射线照射灭菌。

实施例4 可再吸收交联形式稳定膜的性质

测定实施例3中获得的可再吸收交联形式稳定膜的以下特征：(1)在PBS中的可润湿性、(2)机械强度、(3)使用来自溶组织梭菌的胶原蛋白酶的酶促降解和(4)细胞粘附、(5)弹性预张紧胶原蛋白材料层的伸长率的测量(6)胶原蛋白羟基磷灰石板和最终模型的厚度测量。

(1)在PBS中的润湿性

对于可再吸收交联形式稳定膜的不同模型而言，可以观察到由视觉上评估的PBS(磷酸盐缓冲盐水)中完全润湿的时间在5至10分钟之间，该时间主要取决于在用乙醇脱水和干燥之前用氯化钠处理。

(2)机械强度

本发明的膜的形式稳定性通过与EN ISO 178和ASTM D6272-10中描述的方法类似的3点单轴弯曲测试来评估，将本发明的膜浸入pH 7.4和温度37℃的PBS中。

该测试被认为是最有用的，因为被设计用于机械稳定非含有部位(non-containing site)处的骨缺陷的每个形式稳定膜将经受弯曲力矩。因此，3点或4点弯曲可以用作表征所用材料的测试，并且另外可用于比较例如具有不同厚度的不同产品。对于材料表征，弯曲模量是最合适的参数。然而，为了比较具有不同厚度的不同产品，压痕8-10mm后的最大力更为相关并因此用于表征产品。

在所使用的三点单轴弯曲测试中，将样品切割成50×13mm的尺寸，并在37℃下在PBS中温育直至目视观察到完全润湿。在三点弯曲设备中以5mm/分钟的速度进行机械测试，该设备的支撑跨度宽度为26mm，每个支撑结构的半径为5mm。弯曲模量在1％和5％弯曲应变内计算。将中心压头下降8至10毫米后，读出所产生的最大力。

对通过EDC/NHS交联的厚度为1.5mm的本发明的膜、通过DHT交联的厚度为1.6mm的本发明的膜和厚度为0.137mm的来自KLS Martin的PLA膜Resorb-进行测试。

图4表示作为这些膜应变的函数的力的变化，其显示了通过EDC/NHS交联(对于8mm应变约为0.65N)或DHT交联(对于8mm应变而言约为0.40N)的本发明的膜的机械稳定性实质性优于PLA膜Resorb-(对于8mm应变而言约为0.10N)。因此，本发明的膜将更好地稳定非含有部位处的骨缺陷。

(3)使用来自溶组织梭菌的胶原蛋白酶的酶降解测试

在人体中，胶原蛋白被人体组织基质金属蛋白酶(MMP)、组织蛋白酶以及推定被一些丝氨酸蛋白酶所降解。研究最好的是MMP，其中胶原蛋白酶(特别是MMP-1、MMP-8、MMP-13和MMP-18)是对于胶原蛋白直接降解最重要的酶(Biopolymers–Peptide Science Section中的Lauer-Fields等，2002Matrix metalloproteinases and collagen catabolism和Frontiers in Bioscience中的Song等，2006Matrix metalloproteinase dependent andindependent collagen degradation)。

降解胶原蛋白组织和膜的胶原蛋白酶能力取决于底物柔性和胶原蛋白类型、MMP活性位点和MMP外切位点。胶原蛋白酶对齐在三重螺旋胶原蛋白上，展开并随后切割(Song等，2006，见上文)。

考虑到克服不同胶原蛋白类型之间的降解差异，通常使用来自溶组织梭菌的具有高催化速度的胶原蛋白酶来评估胶原蛋白酶的降解(J Cell Sci中Kadler等，2007Collagen at a glance)。通常，天然胶原蛋白产品比化学交联的胶原蛋白产品更快降解。

在该测试中，将胶原蛋白产品(1mg/ml胶原蛋白的可再吸收交联形式稳定膜的样品)在含有钙的Tris缓冲液中在37℃与来自溶组织梭菌的50单位/ml一起温育(一个单位被定义为从来自牛跟腱的胶原蛋白中释放肽，该肽相当于在钙离子存在下，在pH 7.4、37℃下，以茚三酮显色法，在5小时内释放出1.0微摩尔的亮氨酸)，以及使用I型胶原蛋白作为参考材料，用Bio-Rad Laboratories(Hercules，USA，订单号500-0116)的“DC蛋白测定”目视测量胶原蛋白基质的降解。使用微孔板分光计(Infinite M200，购自Tecan)测定胶原蛋白浓度。

本发明的可再吸收交联形式稳定膜的所有样品在4小时后显示出至少10％胶原蛋白降解(如通过使用胶原蛋白I型作为标准的DC蛋白测定评估的)，胶原蛋白降解速率(低于Geistlich Bio-膜)取决于所使用的交联条件。

(4)细胞粘附

如下评估细胞对不同膜的粘附，即用先前用荧光亲脂性染料标记的100000个人类牙龈成纤维细胞首先接种8mm膜冲孔，在37℃，PBS中温育24小时，通过在PBS中洗涤膜去除非贴壁细胞，裂解贴壁细胞并通过在485nm测量荧光对其进行定量。将荧光归一化为使用在裂解之前未洗涤的细胞种子膜冲孔建立的标准曲线。

在图5中示出了对于形式稳定可再吸收膜获得的结果，图5是水平表示能够粘附在不同类型牙科膜上的细胞百分比的柱状图，本发明的可再吸收交联形式稳定膜和PTFE膜(Keystone Dental)。

图5显示了与本发明的可再吸收交联形式稳定膜的粘附性约为10.5％，与PTFE膜约为4％的值相比，该值与Geistlich Bio-膜约为13％的值更为接近。Geistlich Bio-膜以其良好的愈合性质以及低开裂率(Zitzmann，Naef等，1997；Tal，Kozlovsky等，2008)或无过度炎症(Jung，2012)而闻名。人牙龈成纤维细胞与本发明可再吸收交联形式稳定膜的粘附的这种测量值可预测不会出现不良反应(例如过度炎症或开裂)的软组织愈合。

(5)弹性预张紧胶原蛋白材料层的伸长率的测量

为了确定胶原蛋白层的张紧量，使用尚未拉紧的弹簧(图2，部分b)将干胶原蛋白层安装到张紧环(图2，部分a)上。在膜的中心彼此相距几厘米的至少4点用铅笔或钢笔标记。使用标尺测量每个点之间的距离。测量的距离被定义为每个点之间的初始长度。将胶原蛋白层浸没在水中并张紧至所需的力。胶原蛋白层在水中温育30分钟。由于大多数胶原蛋白层的粘弹性，张力降低。因此，胶原蛋白层需要再次张紧。温育30-40分钟后，使用标尺测量每个点之间的距离。应变百分比通过从拉伸后长度减去初始长度，除以初始长度再乘以100来确定。

例如在应力-应变曲线的线性区的典型结果是对于未灭菌的Geistlich Bio-Gide而言在40和100％之间的应变(伸长、拉伸)。

用这种方法测得的应变值不能直接与单轴伸长测试中得到的应变值相比较。

(6)测量胶原蛋白羟基磷灰石板和最终样品的厚度

可以如上所述或者通过使用滑动卡尺来测量最终样品或胶原蛋白/羟基磷灰石板“E”的厚度。

(7)不同胶原蛋白层的机械性质分析(图5)

为了比较胶原蛋白层的不同来源并估计其机械性质，使用湿润样品的标准单轴张紧。用于这种分析方法的一般设置在ASTM D882-09“用于薄塑料薄片的拉伸性质的标准测试方法(Standard Test Method for Tensile Properties of Thin Plastic Sheeting)”中进行了描述。由于所用胶原蛋白膜的高成本，调整几个测试参数。将样品切成例如2×1厘米的长方形片，在等渗磷酸盐缓冲盐水中预先润湿，并安装到每个样品架之间距离为1厘米的拉伸测试机上。样品以每分钟初始长度的33％的恒定速度张紧。记录为100％初始长度的预先加力通常设定为50kPa。使用两个样品架之间的距离计算样品的伸长率。

由此获得图5的应力-应变曲线。

虽然已经在附图和前面的描述中详细说明和描述了本发明，但是这样的说明和描述被认为是说明性的或示例性的而非限制性的：本发明不受所公开的实施方式的限制。

通过研究附图、公开内容和修改的权利要求，本领域技术人员在实施要求保护的本发明时可以理解并实现所公开的实施方式的其他变型。

在权利要求中，“包含”一词不排除其他元素；定冠词“一种(a)”或“一个(an)”不排除多个。

Claims (15)

1.一种用于口腔的可再吸收交联形式稳定膜，其包含胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，所述复合层含有每1重量份胶原蛋白材料1.5至3.5重量份无机陶瓷，并且夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间，其中所述弹性预张紧胶原蛋白材料是已被拉伸从而处于应力-应变曲线的线性/弹性区的胶原蛋白材料，所述胶原蛋白材料包含50-100％w/w的胶原蛋白和0-50％w/w的弹性蛋白，

所述夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层是使用化学品交联的，或者是通过脱氢热处理DHT交联的。

2.如权利要求1所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层含有每1重量份胶原蛋白材料2.0至3.0重量份无机陶瓷。

3.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述胶原蛋白材料包含70-90％w/w的胶原蛋白和10-30％w/w的弹性蛋白。

4.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述胶原蛋白材料源自天然来源的组织，所述天然来源的组织选自下述组：哺乳动物的腹膜或心包膜、胎盘膜、小肠粘膜下层、真皮、硬脑膜、韧带、肌腱、膈肌、网膜、以及肌肉或器官的筋膜。

5.如权利要求4所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述膈肌是胸膈。

6.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述胶原蛋白材料源自猪、牛或马的腹膜或心包膜、小肠粘膜下层或肌肉筋膜。

7.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述弹性预张紧胶原蛋白材料具有2至150MPa的弹性模量。

8.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述弹性预张紧胶原蛋白材料层中的一个包含5至500μm的孔。

9.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中无机陶瓷颗粒的尺寸为150至500μm。

10.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述无机陶瓷是羟基磷灰石。

11.如权利要求1或2所述的可再吸收交联形式稳定膜，其中所述无机陶瓷是羟基磷灰石骨矿物质。

12.用于制备权利要求1-11中任一项所述的可再吸收交联形式稳定膜的方法，包括以下步骤：

(a)制备无机陶瓷颗粒和胶原蛋白材料的复合层，

(b)将所述胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层组装并粘合在两个经受张紧而导致胶原蛋白材料拉伸至应力-应变曲线的线性区中的胶原蛋白材料层之间，由此得到夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层，以及

(c)使所述夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层交联，随后进行亲水化处理，

其中所述交联通过化学品进行或脱氢热处理DHT进行。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法包括在步骤(b)之前将步骤(a)获得的复合层交联。

14.如权利要求12所述的方法，其中亲水化处理包括将夹在两个弹性预张紧胶原蛋白材料层之间的经交联的胶原蛋白材料和无机陶瓷颗粒的复合层浸入氯化钠溶液中。

15.权利要求1至11中任一项所述的可再吸收交联形式稳定膜在制备用于支持人或动物的非含有牙骨缺陷部位处的骨形成、骨再生、骨修复和/或骨置换的植入物中的用途。