CN108280321B - 基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法 - Google Patents

基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于细胞生物学和分析化学领域，涉及一种基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法。本发明采用LC‑MS/MS技术分析12种肿瘤细胞在给予临床上常用的4类抗肿瘤药(破坏DNA结构类，抗代谢类，干扰RNA合成类和影响微管蛋白类)后细胞内代谢物的变化，经多元统计分析找出与药物作用机制相关的52个差异代谢物，应用化学计量学方法建立基于这四类作用机制的预测模型。并验证了模型的稳定性和准确性，考察模型的适用范围。本发明通过细胞代谢轮廓研究方法将细胞内差异代谢物与抗肿瘤药物作用机制直接联系起来，结合生物信息学方法建立一种抗肿瘤候选化合物机制预测模型。该模型可应用于抗肿瘤活性成分的作用机制初步研究。

Description

基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测 模型的方法
技术领域
本发明属于细胞生物学和分析化学领域，涉及一种基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法。
背景技术
肿瘤是世界医学难题，寻找高效、低毒、易得的抗肿瘤药物迫在眉睫，作用机制研究是药物研发的重要组成部分，对于某些具有抗肿瘤活性的候选化合物在被广泛应用之前，阐明其作用靶点和相关信号通路，发现潜在的毒副作用，研究其耐药机制等都具有重要意义。然而，作用机制研究是一个耗时耗力的过程，据报道，所有药物失败中有接近三分之一的资金损失是由于药物开发早期无法准确预测其作用机制。因此，有必要开发一种初步预测化合物抗肿瘤机制的方法，有助于为进一步研究指明方向，从而减少研发盲目性，提高效率。
目前基于代谢轮廓分析的正交偏最小二乘判别分析模型(OPLS-DA)被广泛用于药物作用机制研究中。胡永胜等人构建判别模型，筛选出与雷公藤红素抗肿瘤作用密切相关的14个生物标记物。(Hu Y,Qi Y,Liu H,Fan G,Chai Y.Effects of celastrol on humancervical cancer cells as revealed by ion-trap gas chromatography–massspectrometry based metabolic profiling.Biochim Biophys Acta.2013；1830:2779-89.)Pestana等人分析人脐血管内皮细胞在血清剥夺后的自噬代谢谱，构建治疗作用评价模型，从而预测了抗疟药氯喹对于细胞自噬的抑制作用。(Pestana C R,Urbaczek A C,Alberici J V.Metabolic profiling of human endothelial cells during autophagyassessed in a biomimetic microfluidic device model.Life Sci,2016；172:42-7.)然而，这些模型普遍缺少验证和评价，而且还没有将此类模型应用于抗肿瘤候选化合物作用机制预测的报道。
发明内容
本发明的目的在于避免抗肿瘤化合物作用机制研究中的盲目性，建立机制预测模型，能够在研究初期预测候选化合物相关的作用机制，在一定程度上为机制的后续深入研究提供线索。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种基于细胞代谢轮廓分析构建的抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型，采用LC-MS/MS技术分析12种肿瘤细胞在给予临床上常用的4类抗肿瘤药(破坏DNA结构类，抗代谢类，干扰RNA合成类和影响微管蛋白类)后细胞内代谢物的变化，经多元统计分析找出与药物作用机制相关的52个差异代谢物，应用化学计量学方法建立基于这四类作用机制的预测模型。并验证了模型的稳定性和准确性，考察模型的适用范围。
步骤如下：
1)根据IC50对12种人源性肿瘤细胞进行给药，淬灭收集细胞团，样品前处理后用LC-MS法进行代谢轮廓分析。
2)将原始数据用MarkerLynx4.0进行降噪、峰检测、峰对齐处理后导入SIMCA13.0，采用OPLS-DA模型区别各组代谢物差异,确定差异代谢物的结构，基于差异代谢物信息建立抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型。
3)通过内交叉验证、置换检验考察模型的稳定性，并另选4种抗肿瘤药用同法进行处理分析，验证模型的准确性。
4)应用建立的模型对2种天然抗肿瘤化合物芹菜素和薯蓣皂苷元进行机制预测，参照现有文献分析预测结果，从而评价模型的适用范围。
本发明中模型建立所用12种抗肿瘤药物有：表柔比星、柔红霉素、放线菌素-D、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、顺铂、丝裂霉素、依托泊苷、紫杉醇，多西他赛、长春新碱，分别属于四类不同作用机制的抗肿瘤药物。
步骤1)中药物作用时间为24-72h，细胞淬灭方法为液氮淬灭刮板法，细胞团用甲醇和二氯甲烷两步提取后，用一种结合RP-UPLC-MS/MS和HILIC-UPLC-MS/MS的液质联用分析方法进行分析。
步骤2)中数据经多元统计分析后，破坏DNA结构类，抗代谢类，干扰RNA合成类和影响微管蛋白类中抗肿瘤药物中分别筛选出17,11,12和12种代谢物与该四类药物的作用机制密切相关。
步骤3)采用非建模抗肿瘤药物吉西他滨、卡莫司汀、长春地辛和米托蒽醌验证模型，代表四种药物的样品点能够准确地落在模型相应区域。
步骤4)模型的预测结果显示，芹菜素通过影响微管蛋白的合成发挥抗肿瘤作用，而薯蓣皂苷元既影响微管蛋白的合成又能破坏DNA的结构，模型对于具有多种作用机制的化合物的预测也具有准确性。
具体地，本发明包括如下步骤：
1)细胞系选择
选择12种肿瘤细胞系人宫颈癌Hela细胞，人肝癌HepG2细胞，人口腔癌KB细胞，人乳腺癌MCF7细胞，人乳腺癌T47D细胞，人胃癌SGC7901细胞，人成纤维肉瘤HT1080细胞，人卵巢癌SKOV3细胞，人前列腺癌PC3细胞，人前列腺癌DU145细胞，人肺癌A549细胞，人横纹肌肉瘤A204细胞。
2)选择4类不同作用机制的抗肿瘤药物对12种肿瘤细胞系分别孵育每份样品平行制备4份，静置培养，液氮淬灭后收集细胞团，制备分析用样品；
其中，4类抗肿瘤药物分别为：
a.影响DNA结构和功能药物顺铂、丝裂霉素、依托泊苷；
b.干扰微管蛋白药物紫杉醇、多西他赛、硫酸长春新碱；
c.抗代谢药物5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、甲氨蝶呤；
d.干扰RNA合成药物表柔比星、柔红霉素、放线菌素-D。
3)细胞样品提取
至分析前取出样品，加入二氯甲烷200-400μl，加内标20μl(丙酸睾酮甲醇溶液，25-75μg/ml)；涡旋2-3min，冰水浴10-30min；涡旋混匀，4℃16000g离心5-10min；吸净上清液，25-50℃下氮气流吹干；进样分析前，用乙腈-水100-200μl复溶，乙腈-水的比例范围为3:1-1:3。
向残渣中加入甲醇200-400μl，加内标20μl(蛋氨酸砜水溶液，25-75μg/ml)，涡旋2-3min，冰水浴10-30min；涡旋混匀，4℃16000g离心5-10min；吸净上清液，25-50℃下氮气流吹干；进样分析前，用乙腈-水100-200μl复溶，乙腈-水的比例范围为3:1-1:3。
4)UPLC-MS/MS样品分析方法
色谱柱采用C18色谱柱(长50-150mm，内径2.1-3.0mm，粒径1.5-3.0μm)，柱温为25-50℃；流动相A和B分别为水(含0.05-0.3％甲酸)和乙腈(含0.05-0.3％甲酸)，梯度洗脱，流动相B：15-90％，流动相A：85-10％；流速为0.15-0.4ml/min；进样体积为2-8μl；离子源温度为120℃；毛细管电压为2.5-3.5kV；锥孔压为25-50V；脱溶剂气流速为600L/h；脱溶剂气温度为350℃；m/z(质荷比)扫描范围为124-1000Da。
5)HILIC-MS/MS样品分析方法
色谱柱为HILIC色谱柱(长50-150mm，内径2.1-3.0mm，粒径1.5-3.0μm)，柱温为25-50℃；流速为0.15-0.4ml/min；流动相A和B分别为水(含0.05-0.3％甲酸)和乙腈(含0.05-0.3％甲酸)，梯度洗脱，流动相B：95-60％，流动相A：5-40％；进样体积为2-8μl；离子源温度为120℃；毛细管电压为2.5-3.5kV；锥孔压为25-50V；脱溶剂气流速为600L/h；脱溶剂气温度为350℃；m/z(质荷比)扫描范围为80-1000Da。
6)数据处理
将所得数据通过MarkerLynx软件进行滤噪、峰对齐、峰检测、降维等处理。所得数据参照80％规则排除零值的累计次数超过20％变量，将获得的二维数据阵文件(.csv)导入SIMCA软件(version 12.0,Umetrics AB,Umes,Sweden)，进行多元统计分析。采用主成分分析(PCA)，观察各组数据的聚类与离群样品，剔除异常样品点。采用正交偏最小二乘判别分析(PLS-DA)筛选与药物作用机制相关的差异代谢物。
7)建立预测模型
以不同作用机制抗肿瘤药物所得数据为基础，建立基于这四种作用机制的OPLS-DA预测模型。
8)模型验证
采用非建模抗肿瘤药物吉西他滨、卡莫司汀、长春地辛和米托蒽醌对数学模型的预测准确性进行验证。
9)模型应用
选用芹菜素和薯蓣皂苷元2种具有抗肿瘤活性的天然化合物，采用建立的模型对2种天然化合物的抗肿瘤机制进行预测，参考现有文献及相关报道对预测结果进行综合分析。
本发明有益效果：通过细胞代谢轮廓研究方法将细胞内差异代谢物与抗肿瘤药物作用机制直接联系起来，在此基础上，结合生物信息学方法建立一种抗肿瘤候选化合物机制预测模型。该模型可应用于抗肿瘤活性成分的作用机制初步研究，作为辅助预分类手段推动抗肿瘤活性成分后续的基因与蛋白水平和作用靶点的研究，在一定程度上可以加快抗肿瘤药物研究和开发的进程，具有便捷、高效和低成本的优势。
附图说明
图1为两种分析方法采集得到的经典色谱图；
A为反相色谱图；B为亲水性色图。
图2为差异代谢物(m/z 116.0708)结构确证图；
A为m/z 116.0708的提取离子色谱图；B为L-脯氨酸标准品的总离子色谱图；
C为正离子模式下m/z 116.0708离子的LC-MS/MS谱和离子碎裂途径。
图3为预测模型得分图和模型置换检验图；
A为OPLS-DA机制预测模型图；B为置换检验图。
图4为模型验证和机制预测得分图；
A为卡莫司汀验证得分图；B为米托蒽醌验证得分图；C为长春地辛验证得分图；
D为吉西他滨验证得分图；E为芹菜素预测得分图；F为薯蓣皂苷元预测得分图。
具体实施方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。
实施例1：细胞代谢轮廓分析
<1-1>细胞系选择
选择12种肿瘤细胞系人宫颈癌Hela细胞，人肝癌HepG2细胞，人口腔癌KB细胞，人乳腺癌MCF7细胞，人乳腺癌T47D细胞，人胃癌SGC7901细胞，人成纤维肉瘤HT1080细胞，人卵巢癌SKOV3细胞，人前列腺癌PC3细胞，人前列腺癌DU145细胞，人肺癌A549细胞，人横纹肌肉瘤A204细胞)分别进行体外培养,培养温度为37℃，湿度为100％，CO2浓度5％；
上述细胞系均为实验室自行培养，由于细胞系的种类较多。即便是相同细胞系，也可能因培养条件、技术人员操作等因素导致误差。
<1-2>细胞给药与收集
选择4类不同作用机制的抗肿瘤药物(影响DNA结构和功能药物顺铂、丝裂霉素、依托泊苷，干扰微管蛋白药物紫杉醇、多西他赛、硫酸长春新碱，抗代谢药物5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、甲氨蝶呤，干扰RNA合成药物表柔比星、柔红霉素、放线菌素-D)对12种肿瘤细胞系分别孵育，每份样品平行制备4份。静置培养48h后，其中3份液氮淬灭，加入1ml预冷PBS后用细胞刮板刮取细胞，4℃下1500rpm离心3min，弃去上清获得细胞团，作为分析用样品。另外1份用胰酶消化后细胞计数板计数。同时设置空白对照组，每份细胞样品含2.0×106个细胞，存储于-80℃中待处理。
<1-3>细胞样品提取
至分析前取出样品，向细胞团加入二氯甲烷300μl，加入内标20μl(丙酸睾酮甲醇溶液，50μg/ml)，涡旋3min，冰水浴20min，涡旋30s混匀，4℃16000g离心10min，吸净上清液，40℃下氮气流吹干，进样分析前，用100μl乙腈-水(1：1)复溶。
向残渣中加入甲醇300μl，加入内标20μl(蛋氨酸砜水溶液，50μg/ml)，涡旋3min，冰水浴20min，涡旋30s混匀，4℃16000g离心10min，吸净上清液，40℃下氮气流吹干，进样分析前，用100μl乙腈-水(1：1)复溶。
<1-4>：UPLC-MS/MS样品分析方法
色谱柱采用Phenomenex Kinetex XB C18(50mm×2.1mm,1.7μm)，柱温40℃，流动相A和B分别为水(含0.1％甲酸)和乙腈(含0.1％甲酸)，流速0.2ml/min，进样体积为5μl，流动相梯度为0-6min：B15-25％；6-20min：B25％-50％；20-25min：B50％；25-40min：B50-90％；40-45min：B90％；45-50min：B90-15％，离子源温度为120℃，毛细管电压为3.0kV，锥孔压为30V，脱溶剂气流速为600L/h，脱溶剂气温度为350℃，m/z(质荷比)扫描范围为124-1000Da。
<1-5>：HILIC-MS/MS样品分析方法
色谱柱为Acquity BEH Amide(100mm×2.1mm,1.7μm)，柱温30℃，流动相A和B分别为水(含0.1％甲酸)和乙腈(含0.1％甲酸)，流速为0.2ml/min，进样体积5μl，流动相梯度为0-5min：95％B；5-15min：95-85％B；15-25min：85％B；25-35min：85-60％B；35-40min：60-95％B；40-45min：95％B，离子源温度为120℃，毛细管电压为3.0kV，锥孔压为20V，脱溶剂气流速为600L/h，脱溶剂气温度为350℃，m/z(质荷比)扫描范围为80-1000Da。
色谱分析结果可能因仪器型号、色谱柱类型、试剂类型等多种因素导致误差。
实施例2：模型建立及应用
<2-1>：数据处理
将所得数据通过MarkerLynx软件进行滤噪、峰对齐、峰检测、降维等处理。所得数据参照80％规则排除零值的累计次数超过20％变量，将获得的二维数据阵文件(.csv)导入SIMCA软件(version 12.0,Umetrics AB,Umes,Sweden)，进行多元统计分析。采用主成分分析(PCA)，观察各组数据的聚类与离群样品，剔除异常样品点。采用正交偏最小二乘判别分析(PLS-DA)筛选与药物作用机制相关的差异代谢物。按照变量权重值(VIP)大于1，ROC(receiver operating characteristic curve)曲线下面积AUC>0.5和p<0.05为标准筛选结果如表1所示。
表1-1 影响微管蛋白类药物的差异代谢物信息
Figure GDA0003194040560000061
Figure GDA0003194040560000071
表1-2 影响DNA结构类药物的差异代谢物信息
Figure GDA0003194040560000072
表1-3 抗代谢类药物的差异代谢物信息
Figure GDA0003194040560000073
表1-4 干扰RNA合成类药物的差异代谢物信息
Figure GDA0003194040560000074
Figure GDA0003194040560000081
<2-2>：建立预测模型
以不同作用机制抗肿瘤药物所得数据为基础，建立基于这四种作用机制的OPLS-DA预测模型，模型参数R2(cum)和Q2(cum)分别为0.909和0.869。为验证模型的稳定性，进行7倍内交叉检验，结果如表2所示，P<<0.01，达极显著水平。999次置换检验结果如图3所示，获得R2(三角)与真实模型的R2值共同构成的回归线截距为0.0871；Q2(方块)与真实模型的Q2值共同构成的回归线截距为-0.4360，其中Q2值均小于R2，说明构建的OPLS-DA判别模型并未过度拟合。
表2 OPLS-DA模型交叉验证方差分析结果
Figure GDA0003194040560000082
<2-3>：模型验证
采用非建模抗肿瘤药物吉西他滨、卡莫司汀、长春地辛和米托蒽醌对数学模型的预测准确性进行验证，各得分图如图4所示，结果表明，数学预测模型对干扰微管蛋白合成类药物能够很好地进行预测，长春地辛样本点能够完全分布于对映机制区域；对吉西他滨、卡莫司汀和米托蒽醌有较高的预测能力，待预测样本点能绝大多数分布于对映机制区域，各OPLS-DA模型参数R2(cum)和Q2(cum)如表3所示。结果表明模型有较好的稳定性并对4类机制药物的预测有良好的准确性。
表3 各OPLS-DA模型参数R2(cum)和Q2(cum)
Figure GDA0003194040560000083
Figure GDA0003194040560000091
注：RP+HI代表反相和亲水分析获得的数据整合到一起。
<2-4>：模型应用
选用芹菜素和薯蓣皂苷元2种具有抗肿瘤活性的天然化合物，采用建立的模型对2种天然化合物的抗肿瘤机制进行预测，经OPLS-DA分析后得分图如图4所示，参数R2(cum)和Q2(cum)如表3所示。代表芹菜素给药组的数据点绝大部分分布于影响微管蛋白区域，从而提示芹菜素可能是通过影响微管蛋发挥抗肿瘤作用的。代表薯蓣皂苷元的数据点分布于破坏DNA结构以及影响微管蛋白区域之间，表明薯蓣皂苷元很可能有两种抗肿瘤机制。预测结果得到相关研究报道的验证。
根据本实施例，基于细胞代谢轮廓分析结合化学计量学和多元统计分析，建立抗肿瘤候选化合物机制预测模型。对模型进行内部交叉验证，外部置换检验考察模型的稳定性良好。用未参与建模的抗肿瘤药物对模型进行验证，模型准确性好。模型对于两种天然化合物的预测结果与现有文献报道相一致，模型对多种抗肿瘤机制的预测也有一定方向性。该模型可应用于抗肿瘤候选化合物的作用机制初步研究，作为辅助预分类手段推动化合物后续的基因与蛋白水平和作用靶点的研究，在一定程度上加快抗肿瘤药物研究和开发进程，具有便捷、高效和低成本的优势。

Claims (8)

1.基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：采用LC-MS/MS技术分析12种肿瘤细胞在给予临床上常用的破坏DNA结构类，抗代谢类，干扰RNA合成类和影响微管蛋白类4类抗肿瘤药后细胞内代谢物的变化，经多元统计分析找出与药物作用机制相关的52个差异代谢物，应用化学计量学方法建立基于这四类作用机制的预测模型；包括如下步骤：
1)12种肿瘤细胞系选择
2)选择4类不同作用机制的抗肿瘤药物对12种肿瘤细胞系分别孵育每份样品平行制备4份，静置培养，液氮淬灭后收集细胞团，制备分析用样品；
3)细胞样品提取
4)UPLC-MS/MS样品分析方法
色谱柱采用C18色谱柱，柱温为25-50℃；流动相为A和B的组合，其中，流动相A为含0.05-0.3％甲酸的水，流动相B为含0.05-0.3％甲酸的乙腈，梯度洗脱，流动相B：15-90％，流动相A：85-10％；流速为0.15-0.4ml/min；进样体积为2-8μl；离子源温度为120℃；毛细管电压为2.5-3.5kV；锥孔压为25-50V；脱溶剂气流速为600L/h；脱溶剂气温度为350℃；质荷比m/z扫描范围为124-1000Da；
5)HILIC-MS/MS样品分析方法
色谱柱为HILIC色谱柱，柱温为25-50℃；流速为0.15-0.4ml/min；流动相为A和B的组合，其中，流动相A为含0.05-0.3％甲酸的水，流动相B为含0.05-0.3％甲酸的乙腈，梯度洗脱，流动相B：95-60％，流动相A：5-40％；进样体积为2-8μl；离子源温度为120℃；毛细管电压为2.5-3.5kV；锥孔压为25-50V；脱溶剂气流速为600L/h；脱溶剂气温度为350℃；m/z质荷比扫描范围为80-1000Da；
6)数据处理
将所得数据通过MarkerLynx软件进行滤噪、峰对齐、峰检测、降维处理；所得数据参照80％规则排除零值的累计次数超过20％变量，将获得的二维数据阵文件导入SIMCA软件，进行多元统计分析，采用主成分分析，观察各组数据的聚类与离群样品，剔除异常样品点，采用正交偏最小二乘判别分析筛选与药物作用机制相关的差异代谢物；
7)建立预测模型
以不同作用机制抗肿瘤药物所得数据为基础，建立基于这四种作用机制的OPLS-DA预测模型；
8)模型验证
采用非建模抗肿瘤药物对数学模型的预测准确性进行验证；
9)模型应用
采用建立的模型对2种天然化合物的抗肿瘤机制进行预测。
2.根据权利要求1所述的基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：所述抗肿瘤药物为：表柔比星、柔红霉素、放线菌素-D、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、甲氨蝶呤、顺铂、丝裂霉素、依托泊苷、紫杉醇，多西他赛、长春新碱。
3.根据权利要求1所述的基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：步骤2)中药物作用时间为24-72h，细胞淬灭方法为液氮淬灭刮板法，细胞团用甲醇和二氯甲烷两步提取后，用一种结合RP-UPLC-MS/MS和HILIC-UPLC-MS/MS的液质联用分析方法进行分析。
4.根据权利要求1所述的基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：所述的12种肿瘤细胞为人宫颈癌Hela细胞，人肝癌HepG2细胞，人口腔癌KB细胞，人乳腺癌MCF7细胞，人乳腺癌T47D细胞，人胃癌SGC7901细胞，人成纤维肉瘤HT1080细胞，人卵巢癌SKOV3细胞，人前列腺癌PC3细胞，人前列腺癌DU145细胞，人肺癌A549细胞，人横纹肌肉瘤A204细胞。
5.根据权利要求1所述的基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：所述的破坏DNA结构类，抗代谢类，干扰RNA合成类和影响微管蛋白类抗肿瘤药物中，分别筛选出17,11,12和12种代谢物与该四类药物的作用机制密切相关。
6.根据权利要求1所述的基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：步骤8)中模型验证用抗肿瘤药物为：吉西他滨、卡莫司汀、长春地辛和米托蒽醌。
7.根据权利要求1所述的基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：步骤9)中选用的两种天然化合物为：芹菜素和薯蓣皂苷元。
8.根据权利要求1所述的基于细胞代谢轮廓分析构建抗肿瘤候选化合物作用机制预测模型的方法，其特征在于：预测结果显示芹菜素通过影响微管蛋白的合成发挥抗肿瘤作用，而薯蓣皂苷元既影响微管蛋白的合成又能破坏DNA的结构。
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