CN108277220B - srp54k基因及其特异性dsRNA在柳蓝叶甲防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种srp54k基因及其特异性dsRNA在柳蓝叶甲防治中的应用。本发明基于柳蓝叶甲srp54k基因序列，构建可表达靶向该基因dsRNA细菌表达载体，通过细菌表达靶向srp54k基因的dsRNA，并将细菌喷洒于叶片表面，对柳蓝叶甲进行毒杀。该dsRNA基因沉默效率高，基因干扰后有明显表型变化，解决了柳蓝叶甲目前没有有效的srp54k基因的dsRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。

Description

srp54k基因及其特异性dsRNA在柳蓝叶甲防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及srp54k基因及其特异性dsRNA在柳蓝叶甲防治中的应用。

背景技术

柳蓝叶甲(鞘翅目，叶甲科)(Plagiodera versicolora Laicharting)是一种重要的林业及城市园林害虫，主要危害杨树、柳树等杨柳科树种的叶部及嫩梢，对我国林业及其城市绿化林木造成巨大经济损失。目前对于该害虫的防治主要以化学农药和生物(苏云金芽孢杆菌(Bt)制剂及转Bt植物)防治为主，物理防治为辅。化学农药对柳蓝叶甲有较好的防治效果，但对环境不友好，可能会引起人畜中毒。苏云金芽孢杆菌(Bt)制剂及转Bt植物对柳蓝叶甲也表现出较高的抗性，但Bt生物农药价格昂贵，且在自然环境中很不稳定，作为喷洒剂，在紫外线的照射下也很快被分解。而对于转Bt植物而言，转Bt杀虫晶体蛋白杀虫活性的散失及其对非靶标昆虫的毒害都可能引起严重的生态危机。物理防治包括人工振击枝干、震落捕杀，人工饲养并释放害虫天敌等，但该方法耗时耗力、成本高且效果不佳。因此有必要开发一种新的针对柳蓝叶甲的防治策略。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现的一种重要基因沉默手段，是指由双链RNA(双链核糖核酸，dsRNA)诱发的同源RNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性抑制特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于靶向干扰害虫必需基因以杀死昆虫从而达到防治害虫的目的。该方法无需添加化学农药、无需合成蛋白、靶基因选择性多(任何必需基因)、可叠加多种靶基因(防止目的害虫对单一基因产生抗性)等优点。RNAi介导的抗虫主要通过两种方式：转基因植物特异性的表达靶向害虫基因的dsRNA并被害虫摄取，细菌表达的靶向害虫基因dsRNA喷洒于植物叶片表面被害虫摄取。后者具有操作简单、成本低、时间周期短等优点。但是目前国内外对柳蓝叶甲基因功能研究较少，无序列信息，具有杀虫活性的靶标基因未知，无成熟RNA干扰抗虫方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供基于柳蓝叶甲转录组数据，筛选得到一种致死基因——srp54k基因(signal recognition particle protein 54k(信号识别颗粒蛋白54k))，并构建细菌dsRNA表达载体，开发出细菌介导的RNAi防治柳蓝叶甲技术。

本发明的一方面提供一种用于合成柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA的核苷酸序列，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

本发明的另一方面提供一种柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA，所述dsRNA的序列的一条链全长与上述SEQ ID NO：3的全长完全互补。

根据本发明的实施方式，上述柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA的制备方法为：提取柳蓝叶甲RNA，反转录成cDNA，并用引物对srp54k基因进行扩增，随后将扩增的srp54k基因通过含有双向T7强启动子且具有氨苄青霉素抗性的质粒导入大肠杆菌中，表达srp54k基因dsRNA。

根据本发明的实施方式，上述引物的序列可以为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

根据本发明的实施方式，上述大肠杆菌可以为大肠杆菌HT115。

此外，本发明还提供上述柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA在防治柳蓝叶甲中的应用。

有益效果

本发明，通过转录组数据筛选得到一种针对柳蓝叶甲的必需基因——srp54k基因，并成功构建靶向表达srp54k基因dsRNA的细菌载体，可高效率的沉默柳蓝叶甲srp54k基因，显著性地影响幼虫化蛹、成虫存活。本发明的dsRNA以及杀虫方法对环境友好，价格低廉，并且解决了目前国内外针对柳蓝叶甲没有有效的杀虫dsRNA的问题，在研发新型杀虫剂方面有很好的应用前景。

附图说明

图1：表达靶向srp54k基因dsRNA的载体图。

图2：喂食表达dsSrp54k和dsGFP基因细菌的柳蓝叶甲成虫生存曲线。

图3：喂食表达dsSrp54k和dsGFP细菌的柳蓝叶甲幼虫羽化率。

图4：喂食表达dsSrp54k和dsGFP基因细菌的柳蓝叶甲成虫srp54k基因表达情况。

具体实施方式

实验材料

昆虫饲养：于28±2℃；60％相对湿度；14L：10D光照周期。

菌种：大肠杆菌(Escherichia coli XL10-Gold；Escherichia coli HT115)。

dsRNA表达的载体：含有双向T7强启动子且具有氨苄青霉素抗性的质粒L4440为表达载体，并导入具有四环素抗性的大肠杆菌E.coli HT115中，作为表达srp54k基因dsRNA的细菌载体。

具体包括如下步骤：

实施例1柳蓝叶甲srp54k基因的获得

1、柳蓝叶甲srp54k基因特异性引物的设计

上游引物F：5'-actatagggagaccggcagatctgaATGTGTTCACCTGTGCCTATG-3'(SEQ IDNO：1)；

下游引物R：5'-ggtaccgggccccccctcgaggtcgAACTGGAAGTCTTGCTTGGTT-3'(SEQ IDNO：2)；

下划线部分序列代表质粒同源臂。

目的片段(srp54k基因cDNA)序列(SEQ ID NO：3)：

ATGTGTTCACCTGTGCCTATGAAAATTATTGGACTACTTGTGGCTGCCACAGCACTGAGGGCCCCACCACCTTTGGCGTGCCCGTCTAACTTTGTTATGATAACAGAACCAACATCGACTTTCCCTTTGAAGGCCTTCGCTTGCGATTCACAAGCTTGACCAATAGTAGCGTCCATAACGAAAATGATATTGTCAGGTTTCACAGCATTCGAAACTGCCAACATCTCTTCGAAAAGAGACTCCTCCTGCTTATGTCTACCACTCGTGTCTACAATGATTATTTCAAAACCTTCTTTCTTGAACATATCCACACCGTCTTGAGCGATAACCACAGGATCCACTTCAGTGTAACTTCCGTAAAACGGTATCCTAGCTTTTGTACAATTTTGTTTCACTTGGTCGTAAGCACCAGCTCTGAATGTGTCAGCACAAACCAAGCAAGACTTCCAGTT

2、柳蓝叶甲mRNA的获得

2.1、柳蓝叶甲总RNA的提取

(1)材料的获取：选取生长良好的成虫，立即液氮研磨。

(2)总RNA提取步骤：

采用TaKaRa公司RNAiso Plus试剂提取柳蓝叶甲的总RNA，主要步骤为：

1)取四头柳蓝叶甲成虫，立即液氮研磨。

2)加入适量的RNAiso Plus后轻微晃动，并用涡旋仪匀浆，确保使裂解液均匀分布于细胞表面，室温静置5min。

3)12,000g 4℃离心5min后，将上清转移至新的1.5ml离心管中。

4)加入1/5RNAiso Plus体积量的氯仿，振荡混匀，室温静置5min。

5)12,000g 4℃离心15min，将上清液转移至新的离心管中。

6)加入0.25倍RNAiso Plus体积量的NaCl和异丙醇，室温静置10min。

7)12,000g 4℃离心10min，吸出上清。

8)用与RNAiso Plus等量的75％乙醇清洗沉淀，7,500g 4℃离心5min，弃上清保留沉淀，洗涤两次。

9)在超净工作台中干燥5min。

10)溶解于适量的DEPC处理水中。

2.2、mRNA的纯化

从柳蓝叶甲总RNA中纯化mRNA，主要步骤为：

1)在微量离心管中配置下列反应液。

表1反应液配置

补DEPC处理的ddH₂O至50μL。

2)37℃反应20～30min。

3)按以下方法失活重组DNA酶I。

(a)加入2.5μL 0.5M EDTA，混匀，80℃保持2min。

(b)用DEPC处理的ddH₂O定容至100μL。

4)加入10μL 3M醋酸钠和250μL乙醇，混匀后-80℃放置20min。

5)4℃，12,000g离心10min，弃上清。

6)加入70％乙醇洗涤，4℃，12,000g离心5min，弃乙醇。

7)干燥沉淀。

8)取适量的DEPC处理的ddH₂O溶解RNA，电泳检测基因组DNA是否除去，测定RNA的浓度。如果基因组DNA未完全除去，适当增加重组DNA酶I的量或延长反应时间。

3、柳蓝叶甲cDNA的制备

取1μg总RNA，1μL的Oligo(dT)₁₆(50μM)引物，然后用水补足到6μL，金属浴70℃温育10min，迅速取出，冰上冷却2min。

(1)逆转录反应

表2逆转录反应体系

(2)反转录反应条件如下：

42℃1h→70℃15min→冰上冷却2min。

(3)反应结束后可以进行下一步实验，或将反应液保存于-20℃。

4、特异性扩增srp54k基因及其验证

以柳蓝叶甲cDNA为模板，以已设计的引物1和2组成配对引物，进行PCR反应，反应体系如下：

表3srp54k基因扩增体系

混匀后，进行PCR反应：

94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35循环；72℃，5min，上样、电泳，在紫外凝胶成像系统中观测目的条带。

目的片段的回收：

1)在紫外灯下用干净的刀片切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶条，将其装入1.5mL离心管中，估计其体积。

2)加入1倍凝胶体积的结合缓冲液，放到58℃中水浴7到8min，使其融化。

3)将DNA预处理管置于2mL微量离心管中，将步骤2中的混合液移入DNA预处理管中的膜上，13,000rpm离心1min，弃清液(重复两次)。

4)加入700μL的洗涤缓冲液到DNA预处理管中，13,000rpm离心1min(重复两次)。

5)弃去清液，13,000rpm空离2min。

6)换到新的EP管中,在通风橱中干燥5min左右。

7)再加20μL洗脱缓冲液，13,000rpm离心2min，弃小柱子。

8)检测浓度，放入-20℃保存。

实施例2靶向表达srp54k基因dsRNA的细菌载体构建

本文将srp54k基因片段克隆到含有双向T7强启动子且具有氨苄青霉素抗性质粒L4440载体上，并导入具有四环素抗性的大肠杆菌E.coli HT115中，作为表达srp54k基因dsRNA的细菌表达载体，如图1所示。

1、感受态制备

采用CaCl₂法制备大肠杆菌感受态细胞。

2、连接转化及验证

将载体L4440用BglⅡ和SalⅠ(Quick cut)酶切3个小时，体系如下：

表4载体L4440酶切体系

上样、电泳，在紫外凝胶成像系统中观测目的条带。目的片段的回收同上。

将上述得到的srp54k基因cDNA序列与载体L4440连接，并导入大肠杆菌E.coliXL10-Gold感受态细胞中，构建L4440载体，体系如下：

表5 srp54k基因cDNA序列与载体L4440连接反应体系

将连接产物转化到大肠杆菌E.coli XL10-Gold感受态细胞中，并涂布于加入氨苄青霉素于四环素的LB培养基上。

12h后，从培养基上随机挑取单菌落，分别接入1mL含有100μg氨苄青霉素和25μg四环素的LB液体培养基中，过夜培养(37℃，220rpm)，培养的菌液直接作为PCR模板。PCR反应体系如下：

表6 PCR反应体系

混匀后，进行PCR反应：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，30s，35cycles；72℃，5min。

选取PCR阳性克隆进行测序验证。

提取连接好的L4440质粒，将其导入大肠杆菌E.coli HT115，作为细菌表达载体。

实施例3细菌表达载体抗柳蓝叶甲效果测定

1、dsSrp54k与dsGFP细菌喂食对柳蓝叶甲的影响

表达靶向柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA的E.coli HT115设置为处理组(dsSrp54k)，表达GFP基因dsRNA的E.coli HT115设置为对照组(dsGFP)。细菌过夜培养，并接种至新的培养基，待OD到0.4后用IPTG诱导，继续培养5小时。随后5,000rpm离心收集菌体，并用1mL无菌水重悬，取50μL重悬液涂布与2cm²柳树叶表面，并对柳蓝叶甲进行喂食。记录幼虫化蛹和羽化率，记录成虫的死亡率。

喂食表达靶向srp54k基因dsRNA细菌的成虫死亡率显著性高于对照组(dsGFP)(如图2，P<0.001)。取食表达靶向srp54k基因dsRNA细菌幼虫羽化率(3.75±1.83％)也显著性的低于对照组(82.50±2.50％)(如图3，P<0.001)。

2、细菌喂食对柳蓝叶甲srp54k基因表达的影响

喂食4天后，取对照组和处理组柳蓝叶甲各3头，迅速用液氮研磨，并按上述方法提取RNA、纯化、反转录，获得cDNA。将核糖体RNA基因(5s rRNA)作为内参基因。采用SYBRGreen法进行荧光定量检测，用Promega公司的荧光定量检测试剂盒(GoTaq qPCR MasterMix)。

5sRNA上游引物F：5'-CTTCCTCGTCGGAGCATTCT-3'(SEQ ID NO：4)

5sRNA下游引物R：5'-GTTCGCCTTAACTGCCATCAA-3'(SEQ ID NO：5)

srp54k基因上游引物F:5'-CCAAGCAAGACTTCCAGTTCT-3'(SEQ ID NO：6)

srp54k基因下游引物R:5'-AAGCCTTACCAGCCAGTCAA-3'(SEQ ID NO：7)

然后使用荧光定量PCR仪(Bio-Rad)进行PCR，反应体系(10μL)如下：

表7荧光定量PCR反应体系

混匀后，进行PCR反应：95℃，2min；95℃，5s,60℃，30s,39个循环；95℃，5s；60℃，30s。计算srp54k基因表达量时，以5sRNA为内参，使用标准曲线法计算表达量。

取食表达靶向srp54k基因dsRNA细菌的成虫的srp54k基因表达量显著性低于对照组(如图4，P<0.001)，说明该dsRNA可显著性的降解srp54k基因mRNA。

以上结果表明，喂食表达靶向srp54k基因dsRNA的细菌可以显著性抑制srp54k基因，并可以有效的杀死成虫及抑制幼虫羽化。

序列表

<110> 湖北大学

<120> srp54k基因及其特异性dsRNA在柳蓝叶甲防治中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actataggga gaccggcaga tctgaatgtg ttcacctgtg cctatg 46

<210> 2

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggtaccgggc cccccctcga ggtcgaactg gaagtcttgc ttggtt 46

<210> 3

<211> 452

<212> DNA

<213> 柳蓝叶甲(Plagiodera versicolora Laicharting)

<400> 3

atgtgttcac ctgtgcctat gaaaattatt ggactacttg tggctgccac agcactgagg 60

gccccaccac ctttggcgtg cccgtctaac tttgttatga taacagaacc aacatcgact 120

ttccctttga aggccttcgc ttgcgattca caagcttgac caatagtagc gtccataacg 180

aaaatgatat tgtcaggttt cacagcattc gaaactgcca acatctcttc gaaaagagac 240

tcctcctgct tatgtctacc actcgtgtct acaatgatta tttcaaaacc ttctttcttg 300

aacatatcca caccgtcttg agcgataacc acaggatcca cttcagtgta acttccgtaa 360

aacggtatcc tagcttttgt acaattttgt ttcacttggt cgtaagcacc agctctgaat 420

gtgtcagcac aaaccaagca agacttccag tt 452

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttcctcgtc ggagcattct 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gttcgcctta actgccatca a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccaagcaaga cttccagttc t 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagccttacc agccagtcaa 20

Claims (4)

1.一种用于合成柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA的核苷酸，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

2.一种柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA，所述dsRNA的序列的一条链全长与权利要求1所述SEQ ID NO：3的全长完全互补。

3.根据权利要求2所述的柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA，其制备方法为：提取柳蓝叶甲RNA，反转录成cDNA，并用引物对srp54k基因进行扩增，随后将扩增的srp54k基因通过含有双向T7强启动子且具有氨苄青霉素抗性的质粒L4440导入大肠杆菌HT115中，表达srp54k基因dsRNA，其中，所述引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

4.根据权利要求2或3所述的柳蓝叶甲srp54k基因dsRNA在防治柳蓝叶甲中的应用。

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