CN108273038A - 防治肠型放射病的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于防治肠型放射病的药物组合物，该药物组合物包括FTY720和利那洛肽。本发明的实验证明，FTY720和利那洛肽两种药物联合应用可以产生协同增效作用，显著增强辐射后肠组织损伤修复。本发明的研究成果为临床上治疗肠型放射病提供了一种特效药，该特效药具有广泛的应用前景。

Description

防治肠型放射病的药物组合物

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种防治肠型放射病的药物组合物，该药物组合物包括FTY720和利那洛肽。

技术背景

由于核泄漏(如切尔诺贝利核事故、福岛核事故)引起大剂量核物质的外泄，造成对人体的辐照引起的损伤，成为放射病。根据受照时间长短不同放射病可分为急性、亚急性和慢性。当辐照剂量超过15Gy时，全身多脏器(如骨髓、胃肠道等)出现严重的损害以肠道组织的损伤最为明显，故称为肠型放射病。肠型放射病(intestinal form of acuteradiation sickness)是以呕吐、腹泻、血水便等胃肠道症状为主要特征的非常严重的急性放射病。机体全身或腹部受到大剂量照射后，小肠粘膜发生了广泛坏死脱落，病人出现反复呕吐，呕吐物多含胆汁或血性液体。严重腹泻是极期的突出表现，每天可达20-30次。腹泻以血水便为其特征，血水便中含肠粘膜脱落物。由于肠蠕动功能紊乱，肠套叠，肠梗阻、肠麻痹等发生率较高。肠型放射病病人病情极为危重，多在辐照后3-7天死亡。目前，因缺乏特效的肠型放射病防治药物，迄今尚无治活的先例。

芬戈莫德(FTY720)是冬虫夏草中提取的有效成分多球壳菌素去除手性中心、改变侧链而合成的新型免疫抑制剂。FTY720在体内经鞘氨醇激酶2磷酸化后，形成活性形式FTY720-P。FTY720-P是鞘氨醇-1-磷酸(S1P)的结构类似物，可以作用于除S1P2以外的其他4种S1P受体而发挥作用。现阶段芬戈莫德主要具有如下应用：芬戈莫德为首个防止淋巴细胞从淋巴结中离开的鞘氨醇1-磷酸盐受体调节剂类药，降低多发性硬化症患者疾病复发的频率，延缓多发性硬化症患者的病情恶化程度；它还可以保持淋巴结内特定的免疫细胞，防止它们作用于中枢神经系统并造成损害，并且对淋巴细胞的保持力是可逆的，从而使患者在治疗停止后体内循环的淋巴细胞恢复到正常水平。研究显示，1-磷酸鞘氨醇(S1P)受体调节剂FTY720对于放射病的防治显示一定的效果，但仍不甚理想。

鸟苷酸环化酶(GUCY2C)是在胃肠道中位于上皮细胞的顶端表面上的跨膜受体，其天然配体为鸟苷素(guanlyin)和尿鸟苷素(uroguanlyin)，二者结合能够调节肠液的分泌，促进肠上皮细胞的增生和修复。鸟苷酸环化酶具有细胞外配体结合结构域、单个跨膜区和C-末端鸟苷酰基环化酶结构域。当配体结合鸟苷酸环化酶的细胞外结构域时，细胞外催化结构域催化cGMP由GTP产生。在体内，在细胞内cGMP的该增加激活导致至肠腔内的氯化物和碳酸氢盐的分泌增加、腔道pH增加、腔道钠吸收增加、流体分泌增加、和肠道传输加速的事件的串联。利那洛肽(商品名：Linzess)是阿斯利康研发的一种GUCY2C的激动剂，目前已经上市。在美国已由FDA批准用于治疗伴有便秘的肠易激综合征(IBS-c)和慢性特发性便秘(CIC)。利那洛肽已显示出能影响人类胃肠的生理功能，包括可减轻内脏痛、减轻腹胀和加快胃肠转运，这可引起大便次数增加以及大便稠度改善。经口施用的利那洛肽结合至肠腔面的鸟苷酸环化酶后将该受体激活，由此局部发挥作用。

目前，尚未见FTY720和利那洛肽组合应用于防治肠型放射病的报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种含有FTY720和利那洛肽的防治肠型放射病的药物组合物及其用途，组合用药后使药效产生了协同增效的作用，有效抑制了放射后的肠道组织损伤。

具体的，为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于防治肠型放射病的药物组合物，所述药物组合物包括有效量的SP1受体调节剂、鸟苷素环化酶C激动剂。

进一步，所述药物组合物中所述SP1受体调节剂和所述鸟苷素环化酶C激动剂的质量比的范围是5:1-50:1。

优选地，所述药物组合物中所述SP1受体调节剂和所述鸟苷素环化酶C激动剂的质量比是20:1。

可用于本发明的S1P受体调节剂从整体结构酸碱性可大致分为三大类：氨基醇、氨基酸和中性多芳香环化合物，结构多式多样，详细可见两篇国外的综述：Bolli MH，LescopC，Nayler O.Synthetic Sphingosine 1-Phosphate Receptor ModulatorsOpportunities and Potential Pitfalls.Curr.Top.Med.Chem.，2011，11，726-757和Buzard，D.J.；Thatte，J.；Lerner，M.；Edwards，J.；Jones，R.M.Recent progress in thedevelopment of selective S1P1receptor agonists for the treatment ofinflammatory and autoimmune disorders.Expert Opin.Ther.Pat.，2008，18，1141-1159；及其中所提及的文献。目前已进入临床研究的S1P调节剂包括FTY720、ACT-128800、BAF312、Ono-4641、KRP-203、CS-0777。

可用于本发明的鸟苷素环化酶C激动剂包括尿鸟苷素、鸟苷肽、淋巴鸟苷素、利那洛肽、SP-304、SP-333、细菌ST肽，或其盐或其活性形式。

优选地，所述SP1受体调节剂是FTY720或其盐或其活性形式；所述鸟苷素环化酶C激动剂是利那洛肽或其盐或其活性形式。

更优选地，所述SP1受体调节剂是FTY720，所述鸟苷素环化酶C激动剂是利那洛肽。

本发明的药物组合物可以根据患者的实际需要制备成各种剂型，优选口服剂型，所述口服剂型包括片剂、胶囊、包含预定量的活性成分小丸的囊剂、凝胶、糊剂、糖浆、大丸剂、药糖剂、膏剂、粉末、冻干粉、颗粒、作为溶液或者在水溶液或非水溶液中悬浮剂；作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂、通过脂质体配制物(参见例如，EP736299)或者在一些其他形式中。

本发明的药物组合物的口服剂型可包括粘合剂、润滑添加剂、惰性稀释剂、润滑剂、表面活性剂和分散剂、调味品和湿润剂。可任选包覆或刻痕或者可配制诸如片剂的口服配制物以得到持续、延迟或缓释的本发明的药物组合物。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了利那洛肽或其盐或其活性形式在制备防治肠型放射病的药物制剂中的应用。

进一步，本发明还提供了利那洛肽在制备防治肠型放射病的药物制剂中的应用。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了前面所述的药物组合物在制备防治肠型放射病的药物制剂中的应用。

进一步，所述肠型放射病包括急性肠型放射病、亚急性肠型放射病、慢性肠型放射病。

在本发明的具体实施方案中，所述肠型放射病是急性肠型放射病。

本发明的所述肠型放射病是由施用电离辐射诱导而成。

所述电离辐射的放射源包括α射线，β射线，γ射线，x射线，中子或其混合物。

在本发明的具体实施方案中，采用的电离辐射的放射源是x射线。

所述电离辐射的方式包括：急性致死剂量的全身照射、急性亚致死剂量的全身照射、慢性低剂量的全身照射，急性致死剂量的腹部照射、急性亚致死剂量的腹部照射、慢性低剂量的腹部照射，单次腹部照射，多次分隔腹部照射，单次骨盆部照射，多次分隔骨盆部照射。

在本发明的具体实施方案中，采用的电离辐射的方式是单次腹部照射。

本发明的药物组合物对于肠型放射病的治疗属于药物组合物中的两种活性成分SP1受体调节剂和鸟苷素环化酶C激动剂的联合应用治疗。可以分别单独配制和使用SP1受体调节剂、鸟苷素环化酶C激动剂，也可以通过在单一配制物中施用SP1受体调节剂、鸟苷素环化酶C激动剂可达到联合治疗的目的。通过联合治疗也涵盖其他组合，例如，可连同包含第三种试剂的单独配制物一起配制和施用SP1受体调节剂、鸟苷素环化酶C激动剂。尽管在联合治疗中两种活性成分可同时施用，但是不需要一定如此。例如，第一种活性成分的施用可以在第二种活性成分的施用之前数分钟、数小时、数天或数周。因此，两种活性成分可在相隔数分钟内、或者在相隔1、2、3、6、9、12、15、18、或24小时、或者相隔1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14天、或者相隔2、3、4、5、6、7、8、9、或10周施用。在一些情况下，更久的间隔是可能的。尽管在一些情况下，在患者的体内可同时存在联合治疗使用的两种活性成分，但是不需要一定如此。

在本发明的具体实施例中，本发明的药物组合物的两种活性成分间隔给药时间是30分钟。

将本发明的药物组合物的给药至个体的时间为约1周至约2周的期间。在治疗期间可间歇给药或持续给药。

在本发明的具体实施例中，本发明的药物组合物的给药至个体的时间为10天。

在本发明的具体实施例中，本发明的药物组合物的给药方式是持续给药。

本发明的药物组合物中FTY720的成人口服剂量范围通常为0.3-0.5mg/天，本发明的药物组合物中利那洛肽的成人口服剂量范围通常为0.15-0.29mg/天。采用的剂量取决于多种因素，这就包括患者的年龄和性别、待治疗的具体疾患、和它的严重程度。

优选地，本发明的药物组合物中FTY720的成人口服剂量0.5mg，本发明的药物组合物中利那洛肽的成人口服剂量范围通常为0.29mg天。

本发明的药物组合物可以在一天中任意时间与食物一起施用、在一天中任意时间不与食物一起施用、在空腹一晚之后与食物(例如早餐)一起施用、在低脂肪餐点之后就寝时施用。

在具体的实施方案中，在食物消耗(例如，饮食)之前施用。

在进一步的实施方案中，在食物消耗之前约30分钟至1小时施用。

本发明的药物组合物可以在每天一次、一天两次、一天三次、一天四次、一天五次或一天六次施用。

在本发明的具体实施例中，本发明的药物组合物的给药至个体是一天一次。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种用于在有其需要的个体内预防和/或治疗电离辐射所引起的胃肠组织损伤的方法。所述方法包括将治疗有效量的FTY720或其盐或其活性形式和利那洛肽或其盐或其活性形式施用给所述个体。

进一步，所述方法包括将治疗有效量的FTY720和利那洛肽施用给所述个体。

根据本发明的又一个方面，本发明还提供了一种防治肠型放射病的方法，该方法包括在照射之前和/或之后对个体施用治疗有效量的FTY720或其盐或其活性形式和利那洛肽或其盐或其活性形式。

本发明所指的“盐”是药学上可接受的盐，盐的具体实例包括：与无机酸形成的盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐和硫酸盐；与有机酸形成的盐，例如醋酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、苹果酸盐、甲磺酸盐和苯磺酸盐；或在合适的情况下，与诸如钠、钾、钙和铝的金属形成的盐，与诸如三乙胺的胺类形成的盐，以及与诸如赖氨酸的二元氨基酸形成的盐。

本发明的FTY720或利那洛肽也包括各自的变体形式，变体形式比非变体形式活性更低或更高，在一些情况下也可为患者所需要，都能发挥防治肠型放射病的治疗作用。

以利那洛肽为例，一旦结合或降低肽的稳定性，则由于受体亲和力降低或者激活受体的能力降低导致活性降低。一旦结合或增加肽的稳定性，则由于受体的亲和力增加或者激活受体的稳定性增加可导致活性增加。

本发明的FTY720的活性形式包括磷酸化的FTY720(FTY720-P)，本发明的利那洛肽的活性形式包括利那洛肽的活性代谢物。

本发明的利那洛肽可以通过以下方式获得：

在任何已知蛋白表达体系中可重组产生本发明的利那洛肽，该已知蛋白表达体系包括但不限于细菌(例如，大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)、昆虫细胞体系(例如，DrosophilaSf9细胞体系)、酵母细胞体系(例如，酿酒酵母、酵母菌属)或者丝状真菌表达体系、或动物细胞表达体系(例如，哺乳动物细胞表达体系)。

如果利那洛肽由重组产生，例如，大肠杆菌，则编码肽的核酸分子也可编码使得成熟肽由细胞分泌的前导序列。因此，编码肽的序列可包括例如天然存在的细菌ST肽的前肽顺序(pre sequence)和前导序列(pro sequence)。分泌的成熟肽可由培养基中纯化。

可将编码本文利那洛肽的序列插入能够在细菌细胞中递送和携带核酸分子的载体内。可将DNA分子插入自主复制载体内(合适的载体包括例如pGEM3Z和pcDNA3、及其衍生物)。载体核酸可以为细菌或噬菌体DNA，例如噬菌体λ或M13或其衍生物。包含本文所述的核酸的载体构建之后可以为诸如细菌的宿主细胞的转化。合适的细菌宿主包括但不限于：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、假单胞菌属和沙门氏菌属。除了编码核酸分子之外，遗传构建物也包括使得可表达例如启动子和调节序列的元件。表达载体可包含控制转录起始的转录控制序列，例如启动子、增强子、操纵基因、和阻抑物序列。各种转录控制序列是本领域众所周知的。表达载体也可包括翻译调节序列(例如，未经翻译的5′序列、未经翻译的3′序列、或者内核糖体进入位点)。载体能够自主复制或者它能够整合至宿主DNA以确保在肽产生时稳定性。

包括本文所述肽的编码蛋白的序列也可与编码以下肽亲和标签的核酸融合，例如，谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白、蛋白A、FLAG标签、六-组氨酸、myc标签或流感HA标签，从而便于纯化。亲和标签或报道基因融合将目标肽的阅读框架与编码亲和标签的基因的阅读框架连接，从而生成翻译融合。融合基因的表达导致单个肽的翻译，该单个肽包括目标肽和亲和标签。在利用亲和标签的一些情况下，编码蛋白酶识别位点的DNA序列将在亲和标签的阅读框架和目标肽之间融合。

适合在除细菌之外的蛋白表达体系中产生利那洛肽的不成熟和成熟形式以及变体的遗传构建物和方法、和本领域技术人员众所周知的那些也可用在生物系统中于产生肽。

可利用化学方法制备利那洛肽。这些方法包括使用BOC或FMOC保护的溶液和固相合成。例如，使用保守氨基酸偶联可在2-氯代三苯甲基或Wang树脂上合成肽。可使用以下保护基团：芴基甲氧基羰基或者叔丁基氧基羰基(α-氨基，N-末端)；三苯甲基或叔丁基(Cys的硫醇基团)；叔丁基(谷氨酸的γ-羧基和苏氨酸的羟基，如果存在)；以及三苯甲基(天冬酰胺侧链的β-酰胺官能团和酪氨酸的苯酚基，如果存在)。

在叔胺的存在下，使用DIC和HOBt可作用于偶联，并且使用混合物K(三氟乙酸81％、苯酚5％、苯甲硫醚5％、1，2-乙二硫醇2.5％、水3％、二甲硫2％、碘化铵1.5％w/w)肽可由固体载体中去保护和分裂。在去除三氟乙酸和其他挥发物之后，使用有机溶剂可沉淀肽。使用二甲亚砜(Tam等人，(1991)J.Am.Chem.Soc.113：6657-62)或者使用空气氧化策略可形成Cys残基之间的二硫键。通过反向色谱法可纯化所得肽，然后冻干。在合成肽之后，可对化学合成的肽进行化学修饰。

术语“治疗”指减少或减轻受治疗者的症状，防止症状的恶化或发展，或防止疾病的发展。对于给定的受治疗者，症状的改善、恶化、恢复或发展可以由本领域技术人员通常采用的主或客观测量方法来确定。对于治疗癌症的功效可以用发病率或死亡率的改善(例如对所选群体的存活曲线的延长)来量度。因此，有效的治疗应该包括对已有疾病的治疗、通过减缓疾病的发展或使其停止来控制疾病、预防疾病的出现、降低症状数量或严重程度或其组合。使用一或多个统计上显著的标准，治疗效果可以在有对照的研究中表现出来。

FTY720购自Cayman Chemicals，利那洛肽由杭州中肽生化合成(纯度超过95％)。利那洛肽结构式如图1所示。

本发明优点和有益效果：

本发明的药物组合物组分简单，毒性低，疗效确切，符合现代医学研究理论。

本发明的药物组合物中的两种活性成分在防治肠型放射病中具有明显的协同增效作用。

附图说明

图1显示本发明的利那洛肽的结构式图；

图2显示利用HE染色观察FTY720和利那洛肽对肠组织损伤的治疗作用效果图，A：未照射组；B：照射未治疗组；C：F治疗组；D：L治疗组；E：F+L治疗组；图3显示FTY720和利那洛肽对肠组织干湿重比的影响统计图；

图4显示利用ELISA检测FTY720和利那洛肽对促炎因子表达的影响统计图，其中，A：IL-6，B：IL-12p40，C：IL-1β，D：TNF-α。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

实施例1小鼠肠型放射病模型建立

1、实验动物的选择与饲养

6-8周龄雄性C57/BL6小鼠50只，体重20-25g。全部小鼠饲养于标准化动物中心无特定病原体动物(SPF)级动物房，采用标准颗粒饲料喂养，自由饮水摄食，室温为(22±2)℃，相对湿度为40％-60％。适应性饲养7天后用于实验。

2、模型的制作原理

小鼠经大剂量的X射线照射腹部即可造成胃肠道组织损伤，引起肠型放射病。

3、模型的制备及标准

用屏障设备(如铅板)将小鼠的其他部位屏蔽，暴露腹部，给予小鼠腹部X射线照射(25Gy)，检测到血象中白细胞数量急剧减少即为造模成功。

实施例2FTY720和利那洛肽对实验动物的治疗作用

以上述制备的模型作为实验对象验证FTY720和利那洛肽对其治疗效果。

1、给药方式及具体途径

造模成功后，立即空腹口服给药，剂量：FTY720，1mg/kg/次；利那洛肽，50μg/kg/次，每天1次，持续10天。两者的给药时间间隔约30分钟。

2、切片HE染色

2.1取材

处死老鼠并取出肠组织。

2.2切片并染色

2.3结果

结果如图2所示，照射未治疗组可见严重的肠组织损伤，包括肠粘膜可见上皮基底膜分离，隐窝细胞水肿，充血，坏死，绒毛裸露。FTY720(F)治疗组和利那洛肽(L)治疗组，组织损伤有一定程度的减轻。而FTY720和利那洛肽(F+L)联合治疗组，组织水肿明显减轻，隐窝细胞形态良好，绒毛较完整，显示两种药物具有明显的协同增效作用。

3、干湿重比检测

3.1步骤

取小鼠肠组织一小块(约100-150mg)，称重记录，即为湿重。将组织置于37℃烤箱中，放置5分钟，取出称重，即为干重。干湿重比＝干重/湿重。

3.2结果

结果如图3所示，相比于未照射组，照射组小鼠肠组织干湿重比显著降低，提示组织严重水肿。FTY720(F)治疗组、利那洛肽(L)治疗组、FTY720和利那洛肽(F+L)联合治疗组，干湿重比均明显升高，其中，联合治疗组的升高幅度最大，且与单独药物治疗组相比有明显的升高。

4、促炎因子检测

4.1步骤

取小鼠肠组织2-3块小块(约200-300mg)，去除粪便，在预冷无菌PBS中漂洗3次，置于24孔板中，加入1ml无血清RPMI1640培养基(含青链霉素)，37℃培养箱中培养24小时，收取上清，ELISA检测促炎因子(IL-6、IL-1β、IL-12p40、TNF-α)的含量。

4.2结果

结果如图4所示，相比于未照射组，照射组小鼠肠组织促炎因子(IL-6、IL-1β、IL-12p40、TNF-α)表达水平显著升高，FTY720(F)治疗组、利那洛肽(L)治疗组、FTY720和利那洛肽(F+L)联合治疗组，炎性因子的表达均明显降低，其中，联合治疗组的下降幅度最大，且与单独药物治疗组相比有明显的降低。

上述参照具体实施方式对本发明的药物组合物进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于防治肠型放射病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括有效量的SP1受体调节剂、鸟苷素环化酶C激动剂。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述SP1受体调节剂是FTY720或其盐或其活性形式；所述鸟苷素环化酶C激动剂是利那洛肽或其盐或其活性形式。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述SP1受体调节剂是FTY720，所述鸟苷素环化酶C激动剂是利那洛肽。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述SP1受体调节剂和所述鸟苷素环化酶C激动剂的质量比是5:1-50:1。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述SP1受体调节剂和所述鸟苷素环化酶C激动剂的质量比是20:1。

6.利那洛肽或其盐或其活性形式在制备防治肠型放射病的药物制剂中的应用。

7.权利要求1-5中任一项所述的药物组合物在制备防治肠型放射病的药物制剂中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述肠型放射病包括急性肠型放射病、亚急性肠型放射病、慢性肠型放射病；优选地，所述肠型放射病是急性肠型放射病。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的应用，其特征在于，所述肠型放射病是由施用电离辐射诱导而成。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述电离辐射的放射源包括α射线，β射线，γ射线，x射线，中子或其混合物；所述电离辐射的方式包括：急性致死剂量的全身照射、急性亚致死剂量的全身照射、慢性低剂量的全身照射，急性致死剂量的腹部照射、急性亚致死剂量的腹部照射、慢性低剂量的腹部照射，单次腹部照射，多次分隔腹部照射，单次骨盆部照射，多次分隔骨盆部照射。