CN108265037A - 一种高育种价值的水稻叶色突变基因及应用 - Google Patents

一种高育种价值的水稻叶色突变基因及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高育种价值的水稻叶色突变体基因OsBH6，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，为甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16在第1346个碱基处由T到A的单碱基突变，该突变发生在基因ORF16第六个外显子上，导致表达蛋白的第217个氨基酸由异亮氨酸变为赖氨酸，表现为致死型。通过检测本发明所述突变基因OsBH6，可以发现潜在的白化幼苗隐性基因，对于白化幼苗的基因检测和水稻育种具有重要的意义。

Description

一种高育种价值的水稻叶色突变基因及应用
技术领域
本发明涉及水稻作物遗传育种的领域，具体涉及一种具有高育种价值的水稻叶色突变基因及其应用。
技术背景
氨酰tRNA合成酶是蛋白质合成过程中的关键酶,能专一辨认氨基酸的侧链基团和tRNA反密码子区域并催化氨基酸与特异一类tRNA结合,使mRNA的遗传信息准确地反映在蛋白质氨基酸序列上。氨酰tRNA合成酶为人们所熟知的功能是在蛋白合成过程中催化甘氨酸与特异tRNA结合，但除此之外氨酰tRNA合成酶还有其他功能，例如酿酒酵母中编码甘氨酰tRNA合成酶基因GRS1能绑定酵母体内ADH2和CYC1基因的3′末端从而调控转录终止[1]；水稻中编码缬氨酰tRNA合成酶基因WP1可以调控核糖体RNA的合成[2]，该基因也是水稻中发现的第一个氨酰tRNA合成酶的基因；拟南芥中的EDD1(embryo-defective development)是水稻甘氨酰tRNA合成酶基因的一个同源基因[3]，EDD1是高等植物中发现的第一个编码甘氨酰tRNA合成酶的基因，它在大肠杆菌中还有一个同源基因，Uwer通过Ds插入得到了一个拟南芥胚发育缺陷突变体，该基因的突变导致一个胚发育停滞在球形胚和心形胚之间的时期的致死表型。
氨酰tRNA合成酶的作用使得其发现和相关突变体的鉴定具有重要意义。
参考文献：
[1]Johanson K,Hoang T,Sheth M.et al.GRS1,a yeast tRNA synthetase witha role in mRNA 3′end formation[J].J Biol Chem,2003,278(38):35923-35930.
[2]Yunlong Wang,Chunming Wang,Ming Zheng et al.,WHITE PANICLE1,a Val-tRNA synthetase regulating chloroplast ribosome biogenesis in rice,isessential for early chloroplast development,Plant Physiology 2016.
[3]Uwer U,Willmitzer L,Altmann T.1998.Inactivation of a glycyl-tRNAsynthetase leads to an arrest in plant embryo development.The Plant Cell 10,1277–1294。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16。
本发明目的之二在于提供一种高育种价值的水稻叶色突变体基因OsBH6。
本发明目的之三在于提供叶色突变体基因OsBH6的应用。
本发明的目的通过下列技术方案实现：
本发明提供一种甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16，是一种叶绿体/线粒体前体蛋白，全长10,538bp，包含34个外显子33个内含子。
本发明还提供一种高育种价值的水稻叶色突变体，其特征在于为甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16在第1346个碱基处由T到A的单碱基突变。
本发明还提供一种高育种价值的水稻叶色突变体基因OsBH6，其cDNA序列如SEQID NO.1所示，为甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16在第1346个碱基处由T到A的单碱基突变，该突变发生在基因ORF16第六个外显子上，导致表达蛋白的第217个氨基酸由异亮氨酸变为赖氨酸，表现为致死型。
本发明还提供一段所述突变体基因OsBH6的特异性基因片段，序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供检测所述叶色突变基因OsBH6特异性基因片段的特异性引物：
BH6-9F:CCTCCCTGTTCCCTTTTCGA(如SEQ ID NO.3所示)；
BH6-9R:GCCCTCCATCTTTCCTTCCT(如SEQ ID NO.4所示)。
本发明还提供所述甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16、叶色突变基因OsBH6、其特异性基因片段或其特异性引物在水稻育种中的应用。
本发明还提供所述甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16、叶色突变基因OsBH6、其特异性基因片段或其特异性引物在水稻白花幼苗基因检测中的应用。
通过检测本发明所述突变基因OsBH6，可以发现潜在的白化幼苗隐性基因，对于白化幼苗的基因检测和水稻育种具有重要的意义；或者在杂交育种过程中，通过将该基因导入到杂交亲本中作为一种标记性状，在苗期对目标性状进行选择。此外，带有突变基因OsBH6的突变体在表现为叶色异常的同时还可能伴随着自身激素合成和对外界激素响应的变化，对研究植物的激素生理亦具有重要意义；对叶色作为标记性状筛选突变体寻找突变基因并对其功能进行研究亦具有重要意义。
附图说明
图1 野生型和突变体(bh6)不同天数表型情况；
图2 温度梯度处理下表型观察和叶绿素含量(mg/g)测定；
图3 野生型和突变体倒二叶叶片叶绿体结构观察；
图4 BH6的精细定位；
图5 BH6基因结构及验证；
图6 bh6进化树的构建；
图7 叶绿素合成相关基因定量分析；
图8 质体发育相关基因定量分析；
图9 PCAMBIA1305.1载体示意图；
图10 pCUbi1390载体示意图；
图11 对候选基因进行定点敲除后的表型；
图12 互补载体示意图。
具体实施方式
实施例1 bh6突变体的遗传分析和突变基因OsBH6的精细定位
(1)对bh6突变体进行了遗传分析以明确bh6突变体基因的突变类型：
白化致死突变体bh6来源于粳稻品种宁粳4号的自然突变，经过大田观察、培养箱培养移栽和光照培养箱持续培养我们发现该突变体表现为稳定的白化(图1，(a)出苗后3天幼苗情况(b)出苗后10天幼苗情况(c)出苗后18天幼苗情况(d)出苗后3天叶绿素自发荧光(e)出苗后10天叶绿素自发荧光(f)出苗后18天叶绿素自发荧光。宁粳4号野生型(左)白化突变体(右))，后期不能转绿致死，并且不随着温度的改变而变化。叶绿素含量测定和叶绿素自发荧光观察都证明了该突变体与野生型存在明显的叶绿素含量差异(图2，(a)和(d)20℃野生型和突变体的表型和叶绿素含量；(b)和(e)25℃野生型和突变体的表型和叶绿素含量；(c)和(f)30℃野生型和突变体的表型和叶绿素含量)。
由于该突变体为致死类型，故不能采用常规的两亲本正反杂交方法来进行测验，该突变体只能通过正常叶色表型的杂合植株后代分离产生,卡方测验发现bh6突变体白化致死表型是隐性单基因控制的。首先我们从挑选出bh6突变体极端作为亲本之一，作为父本的籼稻N22则为另一亲本，初定位时利用本实验室已有公共引物标记筛选出在这两个亲本之间存在多态的标记，再从F2群体中严格筛选表型与bh6亲本相同的极端个体10株，利用均匀覆盖水稻12条染色体组的标记来进行初步定位，结果将BH6定位与第六条染色体顶端标记N6-4之前约1.5Mb的物理距离，且确定BH6与标记N6-1紧密连锁；然后进一步扩大定位群体，将F2中全部白化极端个体318株全部用N6-1与N6-4两个标记筛选在其间发生重组的单株作为重要交换单株进一步定位，同时开发位于N6-4到第六条染色体顶端这段物理距离的InDel标记，最终将BH6定位在标记Bh6-12到第六条染色体顶端约266Kb的物理距离，这段距离包括B1460A05和OSJNBa0075G19两个BACs克隆(图4)。在杂交制种过程中，可以利用突变体苗期叶色表型，进行简单除杂，提高杂种的纯度。
(2)定位区间内候选基因的确定
由于定位区间位于染色体顶端，染色体顶端基因密度减少，我们便对定位区间内的序列在网站RiceXPro(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp)上进行基因预测，该区间包含18个ORF，其中有ORF4和ORF16注释与叶绿体前体有关，因此我们首先对这两个ORF进行测序寻找突变位点。
ORF4是只包含一个465bp外显子的基因，我们首先对ORF4进行测序，根据NCBI上提供的该基因日本晴序列分段设计引物扩增该基因的全长CDS以及基因上游2kb左右的启动子区域和下游3’非编码区，分别以野生型和突变体的总DNA为模板来扩增，经过琼脂糖凝胶电泳分离得到扩增条带再进行回收测序，然而野生型和突变体并未发现在该区间存在碱基的差异，排除了这个基因突变的可能。
ORF16注释为甘氨酰tRNA合成酶，是一种叶绿体/线粒体前体蛋白，进化树分析表明该基因编码的这一类蛋白广泛存在于高等植物中，并且同源性较高，证明了该基因的重要性(图6)。该基因全长10,538bp，包含34个外显子33个内含子(图5A，候选基因结构示意图)，这种酶包含四个结构域，而发生突变的位点位于其中各物种间最为保守的α核心结构域，该基因的突变很可能导致α核心结构域中的活性位点的改变导致酶活性的丧失。首先我们对野生型和突变体的总RNA进行提取，然后反转录为总cDNA，再根据NCBI上提供的该基因日本晴序列设计标记扩增该基因的cDNA，将野生型和突变体的cDNA送到测序公司进行测序，结果发现突变体的基因在第1346个碱基发生了由T到A的单碱基突变(其cDNA序列如SEQID NO.1所示)，该突变位于第六个外显子上，导致表达蛋白的第217个氨基酸由异亮氨酸变为赖氨酸。
为验证测序结果的准确性，我们进行过重复测序验证该碱基的确发生了突变，后代可以分离出白化幼苗的表型正常单株在该碱基处存在杂合双峰的情况(图5B，突变位点测序峰图)；此外我们还设计了dCAPs标记进行酶切验证，分别将野生型和突变体的dCAPs标记扩增片段用HindⅢ酶切，发现野生型不能被酶切而突变体可以被酶切(图5C，酶切dCAPs标记扩增片段13未酶切24HindⅢ酶切)。
实施例2叶绿素代谢与质体发育相关基因的表达
由于叶绿体的正常发育和叶绿素合成都是细胞核基因和叶绿体基因共同协调作用的结果，这其中存在核基因对叶绿体基因的正向调控也存在叶绿体向细胞核的逆向信号，所以其中某一个基因的突变很可能影响到其他基因的表达情况，所以我们对叶绿素合成相关基因进行了定量表达分析(图7)，结果发现bh6突变体中叶绿素合成相关多数基因表达量比野生型表现为上调，少量表现为下调，个别基因的表达量无明显差异，这些结果说BH6基因的突变的确影响了叶绿素合成相关基因的表达情况致使叶绿素合成缺陷。
质体发育相关基因定量主要检测了两类基因的表达情况，分别是核编码基因和质体编码基因，结果可以看出核编码基因大致表现为上调而质体编码基因大致表现为下调(图8)，说明质体基因的表达受到了一定程度的抑制。
实施例3
通过电子透射显微镜观察了叶片细胞中叶绿体的超微形态结构，结果发现BH6突变体中的叶绿体存在明显的结构缺陷，表现为类囊体结构的异常，并伴随着嗜锇颗粒的增加和光合能力的丧失(图3，(a)野生型叶片细胞(b)野生型叶绿体超微结构(c)bh6叶片细胞(d)bh6叶绿体超微结构)。
实施例4对候选基因进行定点敲除和互补实验
通过对BH6突变体的cDNA进行序列分析，将其特异序列基因片段‘TAGTCTAGTGGGTCTGTT’(SEQ ID NO.2)设计引物，
BH6-9F:CCTCCCTGTTCCCTTTTCGA(如SEQ ID NO.3所示)；
BH6-9R:GCCCTCCATCTTTCCTTCCT(如SEQ ID NO.4所示)。
融入PCAMBIA1305.1载体中(图9)，将该基因进行Crispr-Cas9，利用农杆菌介导法转化水稻品种日本晴得到58株转基因苗，其中34株为阳性转基因苗。34株阳性转基因苗中通过测序发现有5株敲除纯和突变体，全部表现为白化表型(图11)。
Crispr-Cas9引物：
Crispr-BH6-F:GGCATAGTCTAGTGGGTCTGTT
Crispr-BH6-R:AAACAACAGACCCACTAGACTA。
用HindIII和BamHI对pCUbi1390空载体(图10)进行双酶切，并且扩增BH6的5’端2Kb启动子和BH6全长3207bp的CDS。将启动子和CDS序列与双酶切后的pCUbi1390载体进行融合。利用农杆菌介导法转化bh6杂合亲本中。得到14株阳性转基因苗，通过测序发现其中有8株为bh6基因型，表现为正常绿色表型(图12)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种高育种价值的水稻叶色突变基因及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3207
<212> DNA
<213> 粳稻品种宁粳4号(Ningjing 4)
<400> 1
atggcgggtt tggctccccc tcccctcctc ctcctccccc tctcctcctc actctctcct 60
gccgccgcct cccaccaccc aacctccccc ccttctcgca cacgccgacg acgccgcctg 120
ctatccgccg tggcgtctgc cgacggtgat gctccctccc cagtctctgt ctccgcctcc 180
gccgccacca aggggccttc ctcctcctcc gtgctcacct tccagcaggc catccagcgc 240
ctccaggact actgggcctc agtggggtgt gccgtcatgc agtgcagcaa tacagaggtt 300
ggagcaggga ccatgaatcc cttgacattc ctcagggttt taggccccga gccatggaac 360
gttgcttatg tggagccaag tataagaccc gacgacagcc gctatgggga caatcctaat 420
aggcttcagc gtcatactca atttcaggta attttgaagc ctgaccctgg aaattcacaa 480
gacctctttc tgcacagcct ttcagcacta ggtatcaatg tccgtgaaca tgacatccgt 540
tttgttgaag acaactggga gagtccagtt cttggtgcgt ggggattagg ctgggaggtt 600
tggatggatg gcatggaaat aacacagttc acatattttc agcagtcagg aagccttcca 660
ttgctgcctg tttctgttga gataacatat ggacttgaac gcatcctcat gtctcttcag 720
ggtgtagatc atttcaagaa tatacaatac actaaaggaa ttacatatgg agaactattc 780
cttgagaatg agaaagagat gagtgcatat tatttggagc atgcaaatgt tgataacatt 840
caaaagcatt ttgatgattt tgaagaagag gctcgctctt tattatcact ttggcttcct 900
attcctgcgt acgatcatgt tctgaaggcc tctcatgctt ttaatatttt agattctaga 960
ggctttgttg gtgtaaccga gcgtgcaaga tattttggtc gcatgcggag tcttgctcgc 1020
cagtgtgctc agctttgggt gaaaacaaga gagaacctcg gttatccttt gggcacttat 1080
caagagtcta atcttatcta tcctcatgtc tctgaaaagc ctagtagaaa gggagttgtc 1140
ggacagccac gagcatttgt tcttgaaata ggaacagaag agttgccacc tcatgatgtg 1200
atagaagcaa ccaaacagct ggagaaatct ttaattcaaa tattggagaa acgaagactg 1260
agccatggga aagtacgctc ttatgggaca ccaaggagat tagcggttgt tgttgaaaat 1320
cttaatatga agcaaatgga ggaagagatt gaactacgtg gtccacctgt tgcaaaggca 1380
tttgaccaag aaggaagacc cactaaggct gctgaaggat tttgtcgaaa gaataatgtc 1440
ctgatagata gtctatatag aagaactgat ggtaaaacag aatatatcta cgctcgggtc 1500
aaagagtctg cacgttttgc tgatgaggta ctaactgaag atctaccgac tattatatct 1560
ggtatttcat ttcccaagtc tatgcgctgg aactccaata ttgtgtttag caggccaata 1620
cgctggatct ttgcccttca tggggatctc attgtgccat tttgctttgc tggcatatca 1680
agtgggaatc agtcgtgtgg ccttcgtaac tcctccttgg ctaactttaa ggtggaagct 1740
gcagaattat atttacacac cctggagaaa gctgggatcc tgattgatat gcaggagcgc 1800
aaacaacgaa tcttgcatga ctctagtata ttggctgagg gtgttggcgg tgatatcatt 1860
gcacctgata gcttggtgca ggaggttatc aatcttgtgg aggcgccgat gcccattatt 1920
ggtcgatacg atgtttcctt cttagcactt ccaaaggatg tattaataac ggttatgcag 1980
aaacaccaga aatatttccc tgtaacctcc aagaccatgg gcaatctgct accatgtttc 2040
ataactgttg ccaatggtgc cattaaggaa gaagtagtcc gcaaagggaa tgaagctgta 2100
ctcagggcac ggtatgagga tgctaaattc ttttataaga tggatacgca gaagaaactt 2160
tctgaattcc gagatcagct cagcagcatt ctctttcatg aaagacttgg taccatgctt 2220
gacaaaatga aacgtgttga gaacactgtt gcagaagtgg ccctccttct cggaattaat 2280
gagaaaatga tcccagcaat caaagatgca gctgcattgg ctatgtcaga tcttgccact 2340
aatattgtta ctgaatttac ttcacttgct ggaattatgg cacggcatta tgctttgaga 2400
gatggccttt cagaacagat tgcagaagcc ctatttgaga taacacttcc aaggttctct 2460
ggtgatgtgt tcccaaaaac agatcctggc atagtccttg cagtcactga cagattggat 2520
agtctagtgg gtctgtttgg agctggatgc caaccaagtt ctacaaatga tccatttggg 2580
ctaaggagaa tttcctatgg attggttcaa atattggttg agaacaagaa gaactttgac 2640
ctcacgaagg ccttgacctt agtggcagag gagcagccaa taacaataga tagtggtgtt 2700
atagatgagg tagtacaatt tgtcacgcgg agattggagc aacttttggt ggatgaagga 2760
attaattgcg agatagtccg ttcagtgctt atagagcgtg caaactgccc ttatctagca 2820
tcacaaacag caattgaaat ggaagcattt tcaagaactg aagatttccc aaaaattgtc 2880
gaagcgtact caaggcccgc gagaataata cgtggaaaag aaattgggtc tgctttagag 2940
gttgatgcaa gtgtatttga gaaagacgaa gaaagagctt tgtggagtgc ctacttggag 3000
gttgcggata agattcatcc tggtgttgac ataaaagcct ttgcggacgc ttctctggaa 3060
ctgctgcaac ccctagaaga tttctttaca aatgtttttg tcatggcgga agacgagaga 3120
gttcgtaaca atcggcttgc actgctaacg aaggttgcga gtctgccaaa gggaattgcc 3180
gacctgtcag ttttaccagg gttttag 3207
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 粳稻品种宁粳4号(Ningjing 4)
<400> 2
tagtctagtg ggtctgtt 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcatagtct agtgggtctg tt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacaacaga cccactagac ta 22

Claims (10)

1.一种高育种价值的水稻叶色突变体，其特征在于为甘氨酰tRNA合成酶基因ORF16在第1346个碱基处由T到A的单碱基突变。
2.一种高育种价值的水稻叶色突变体基因OsBH6，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述突变体或权利要求2所述突变体基因OsBH6在水稻育种中的应用。
4.权利要求1所述突变体或权利要求2所述突变体基因OsBH6在水稻白花幼苗基因检测中的应用。
5.一种高育种价值的水稻叶色突变体基因OsBH6的特异性基因片段，其cDNA序列如SEQID NO.2所示。
6.权利要求5所述的特异性基因片段在水稻育种中的应用。
7.权利要求5所述的特异性基因片段在水稻白花幼苗基因检测中的应用。
8.权利要求5所述特异性基因片段的特异性引物：SEQ ID NO.3/如SEQ ID NO.4。
9.权利要求8所述的特异性引物在水稻育种中的应用。
10.权利要求8所述的特异性引物在水稻白花幼苗基因检测中的应用。
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王卓然: "水稻叶色白化基因BH6的图位克隆", 《南京农业大学硕士学位论文》 *

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