CN108254343B - 一种检测探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测探针及其制备方法和应用，所述检测探针包括结合有石墨烯量子点的探针A和结合有金纳米颗粒的探针B，所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；由于石墨烯量子点在390nm波长的激发光照射时，其在450nm波长位置有强烈的荧光信号，本发明通过利用DNA核苷酸链的相互作用将石墨烯离子点和金纳米材料吸附在一起，导致石墨烯量子点的荧光信号猝灭，由于铅离子对石墨烯量子点上的核苷酸链具有剪切作用而导致石墨烯量子点与金纳米颗粒发生分离，致使石墨烯量子点上的荧光信号恢复，通过荧光信号强度检测铅离子的浓度；本发明提供的检测探针用于检测铅离子浓度，高效简洁，具有广阔的应用前景。

Description

一种检测探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种检测探针及其制备方法和应用。
背景技术
重金属离子对人体和环境的危害越来越受到人们的关注和研究，特别是铅离子，它能导致人的大脑记忆力减退，情绪不稳定，心血管疾病，幼儿的肌肉瘫痪。铅离子不仅存在于植物和动物体内，并且它还存在于我们的环境中，它是一种不可降解的物质。美国环保局指出人类饮用水中最大铅离子含量为15μg/L或72nM。
量子点(Quantum Dot)是由有限数目的原子构成，属于准零维材料，即在三个维度上尺寸均呈现纳米级别，外观恰似球形物或者类球形，其内部电子在各个方向的运动均会受到限制，因此量子限域效应非常明显。石墨烯量子点(Graphene Quantum Dots)一般是横向尺寸在100nm以下，纵向尺寸可以在几个纳米以下，具有一层、两层或者几层的石墨烯结构，也就是特殊的非常小的石墨烯碎片。它的特性来源于石墨烯以及碳点，表现出生物低毒性、优异的水溶性、化学惰性、稳定的光致发光、良好的表面修饰。
荧光共振能量转移是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。
CN102586429A公开了一种铅离子荧光DNA探针，包括17E脱氧核酶以及底物链杂交组成的双链，底物链末端以FAM荧光素修饰。本发明还公开了一种利用探针进行铅离子浓度的荧光测定方法，以铅离子荧光DNA探针作为铅离子的识别元件，以底物链末端修饰的FAM荧光素作为荧光信号分子，以纳米金胶作为荧光猝灭剂，利用FAM荧光素与铅离子荧光DNA探针单双链结合时的荧光信号差异，对待测样品中的铅离子浓度进行荧光检测。CN104406962A公开了一种用于快速检测水样中铅离子的试剂盒及其使用方法，适用于水样中铅离子的快速检测。用于快速检测水样中铅离子的试剂盒包括如下成分：掩蔽剂、显色剂1、显色剂2、缓冲剂、试管、胶头滴管以及标准pH试纸，使用时通过反应液是否产生沉淀来检测水样中铅离子残留。
综上所述，目前铅离子检测方法主要有电化学方法、比色法、阳极溶出伏安法等。虽然这些方法的灵敏度可以达到要求，但是他们通常需要昂贵的仪器设备、复杂的操作过程，这就导致了他们不能被广泛的应用于生活中。
因此，研发一种简单快捷，能够广泛应用于生活中的铅离子检测产品及方法具有广阔的应用前景和市场价值。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测探针及其制备方法和应用，所述检测探针能够高效便捷地检测铅离子浓度，易于操作，便于推广应用，不需要昂贵的设备和仪器。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种检测探针，所述探针包括结合有石墨烯量子点的探针A和结合有金纳米颗粒的探针B；
所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
SEQ ID NO:1为
3’-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC-5’。
所述探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
SEQ ID NO:2为
5’-CGATAACTCACTATrAGGAAGAGATG-3’。
在本发明中，发明人充分研究检测铅离子浓度的现有技术，理清各种方法的优缺点，在广泛调查铅离子的性质特点后，结合荧光共振能量转移的原理，创造性地使用DNA核苷酸链将量子点和金纳米颗粒结合起来发生荧光共振能量转移现象，铅离子会嵌入探针A的U型环中，同时对探针B的“rA”位置进行剪切，从而导致探针B发生断裂。并发挥铅离子剪切特定核苷酸的功能，以此切断荧光共振现象，能够高效简洁地检测铅离子浓度，便于推广。
本发明基于通过DNA片段将荧光氧化石墨烯量子点和金纳米颗粒连接在一起后对铅离子进行检测，由于氧化石墨烯量子点在390nm波长的激发光照射时，其在450nm波长位置有强烈的荧光信号。当氧化石墨烯量子点通过碱基互补配对的方式与金纳米颗粒连接在一起时，在激发光照射时，石墨烯的荧光信号转移到金纳米颗粒上，同时，荧光信号发生猝灭。然而，若有铅离子加入时，铅离子能够将DNA切断，之后，石墨烯量子点与金纳米颗粒分离，并且恢复荧光信号，通过其荧光信号的强弱变化检测出溶液中铅离子浓度。
优选地，所述探针A通过氨基与表面羧基化的石墨烯量子点结合。
优选地，所述探针B通过巯基与金纳米颗粒结合。
巯基修饰后的DNA核苷酸链为：
5’-/3ThioMC3-D/CGATAACTCACTATrAGGAAGAGATG-3’。
氨基修饰后的DNA核苷酸链为：
3’-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC/5AmMC6/-5。
优选地，所述金纳米颗粒的直径为7-13nm，例如可以是7nm、8nm、9nm、10nm、11nm、12nm或13nm，优选为8-11nm。
优选地，所述石墨烯量子点的直径为3-7nm，例如可以是3nm、4nm、5nm、6nm或7nm，优选为4-6nm。
第二方面，本发明提供一种制备如第一方面所述检测探针的方法，包括如下步骤：
(1)将金纳米颗粒与带有巯基的探针B混合，加入NaCl、NaHPO4，静止后离心去除上层清液；
(2)将石墨烯量子点与带有氨基的探针A混合，加入EDC溶液，混匀后静止。
本发明中，所述EDC溶液为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，在酰胺合成中用作羧基的活化试剂，也用于活化磷酸酯基团、蛋白质与核酸的交联和免疫偶联物的制备。
优选地，步骤(1)所述金纳米颗粒与带有巯基的探针B的混合浓度比例为1:(180-220)，例如可以是1:180、1:190、1:200、1:210或1:220，优选为1:(190-210)。
优选地，步骤(1)所述NaCl的浓度为0.05-0.2M，例如可以是0.05M、0.08M、0.1M、0.15M或0.2M，优选为0.08-0.15M。
优选地，步骤(1)所述NaHPO4的浓度为3-7mM，例如可以是3mM、4mM、5mM、6mM或7mM，优选为4-6mM。
优选地，步骤(1)所述静置的时间为13-18h，例如可以是13h、14h、15h、16h或17h，优选为15-17h。
步骤(2)所述石墨烯量子点与带有氨基的探针A的混合浓度比例为1:(180-220)，例如可以是1:180、1:190、1:200、1:210或1:220，优选为1:(190-210)。
优选地，步骤(2)所述EDC溶液的浓度为25-29mM，例如可以是25mM、26mM、27mM、28mM或29mM，优选为26-28mM。
优选地，步骤(2)所述混匀的时间为1-4min，例如可以是1min、2min、3min或4min，优选为2-3min。
优选地，步骤(2)所述静止的时间为0.5-2h，例如可以是0.5h、0.8h、1h、1.2h、1.5h或2h，优选为0.8-1.2h。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的探针用于检测铅离子浓度。
第四方面，本发明提供一种检测铅离子浓度的方法，所述方法为：将探针A和探针B置于波长为370-420nm，例如可以是370nm、380nm、390nm、400nm或410nm，优选为380-410nm的激发光照射下加入铅离子，进行光谱信号检测。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的检测探针用于检测铅离子浓度，发挥荧光共振能量转移的敏感性，能够高效便捷地检测铅离子浓度，易于操作，便于推广应用，不需要昂贵的设备和仪器，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中纳米材料物质的透射电镜图，其中，11为金纳米颗粒，31为荧光石墨烯量子点；
图2为本发明的核苷酸链结合配对示意图，其中，21为带有巯基的核苷酸链，41为带氨基的核苷酸链；
图3为本发明核苷酸链在铅离子存在的条件下变化示意图，其中，22为带巯基的核苷酸链，42为带氨基的核苷酸链，5为待检测的铅离子；
图4为本发明的检测体系示意图，其中，1为金纳米颗粒，2为带有巯基的核苷酸链，3为石墨烯量子点，4为带有氨基的核苷酸链；
图5为本发明中的荧光结果图，其中，图5(A)是不同浓度铅离子检测过程的荧光光谱图，图5(B)为不同浓度铅离子检测过程的荧光强度变化图；
图6为本发明中对不同重金属离子检测过程中的荧光信号强度对比图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例1
将直径为10nm的金纳米颗粒1与带有巯基的核苷酸链2以1:200浓度比混合，加入0.1M NaCl、5mM NaHPO4，静止16h，之后10000rpm离心10min，去除上层清液；
将直径为5nm的石墨烯量子点3与带有氨基的核苷酸链4与以1:200浓度比混合，加入27mM EDC溶液，混匀2min后静止1h；
巯基修饰后的DNA核苷酸链为：
5’-/3ThioMC3-D/CGATAACTCACTATrAGGAAGAGATG-3’；
氨基修饰后的DNA核苷酸链为：
3’-TGAGTGATAAAGCTGGCCGAGCCTCTTCTCTAC/5AmMC6/-5’；
其中，纳米材料物质(金纳米颗粒和石墨烯量子点)的投射电镜图如图1所示；
将上述都结合核苷酸链的石墨烯量子点与金纳米颗粒置于荧光光谱仪上，在390nm激发光照射下进行光谱信号检测结合后的核苷酸，核苷酸结合配对示意图如图2所示，铅离子会嵌入探针A的U型环中，同时对探针B的“rA”位置进行剪切，从而导致探针B发生断裂；
然后加入不同浓度的铅离子，核苷酸链在铅离子存在的条件下变化示意图如图3所示，检测信号强度，检测体系示意图如图4所示；
对不同浓度的铅离子检测过程的荧光光谱图和荧光强度变化图如图5(A)-图5(B)所示；
由图5(A)-图5(B)可知，本发明提供的探针A和探针B能够有效检测铅离子浓度，呈现出线性相关的结果。
实施例2
将不同金属离子加入实施例1中的检测体系中，检测荧光信号强度，荧光强度对比图如图6所示；
由图6可知，本发明提供的探针能特异性检测铅离子浓度，对其他金属离子不敏感，无检测功能。
实施例3
将直径为7nm的金纳米颗粒1与带有巯基的核苷酸链2以1:180浓度比混合，加入0.05M NaCl、3mM NaHPO4，静止13h，之后10000rpm离心10min，去除上层清液；
将直径为3nm的石墨烯量子点3与带有氨基的核苷酸链4与以1:180浓度比混合，加入25mM EDC溶液，混匀1min后静止0.5h；将上述都结合核苷酸链的石墨烯量子点与金纳米颗粒置于荧光光谱仪上，在370nm激发光照射下进行光谱信号检测结合后的核苷酸，然后加入不同浓度的铅离子，结果同实施例1和实施例2相似，在此不再赘述。
实施例4
将直径为13nm的金纳米颗粒1与带有巯基的核苷酸链2以1:220浓度比混合，加入0.2M NaCl、7mM NaHPO4，静止18h，之后10000rpm离心10min，去除上层清液；
将直径为7nm的石墨烯量子点3与带有氨基的核苷酸链4与以1:220浓度比混合，加入29mM EDC溶液，混匀4min后静止1.2h；
将上述都结合核苷酸链的石墨烯量子点与金纳米颗粒置于荧光光谱仪上，在390nm激发光照射下进行光谱信号检测结合后的核苷酸，然后加入不同浓度的铅离子，结果同实施例1和实施例2相似，在此不再赘述。
综上所述，本发明将NDA核苷酸链的碱基互补配对原理与石墨烯量子点和金纳米颗粒的荧光共振能量转移现象相结合，制备得到的探针能够敏感检测铅离子浓度，操作简便，高效简洁，不需要昂贵的设备和仪器，具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (24)

1.一种检测探针，其特征在于，所述探针包括结合有石墨烯量子点的探针A和结合有金纳米颗粒的探针B；
所述探针A的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述探针B的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述金纳米颗粒的直径为7-13nm，所述石墨烯量子点的直径为3-7nm。
2.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述探针A通过氨基与表面羧基化的石墨烯量子点结合；所述探针B通过巯基与金纳米颗粒结合。
3.根据权利要求1或2所述的检测探针，其特征在于，所述金纳米颗粒的直径为8-11nm。
4.根据权利要求3所述的检测探针，其特征在于，所述石墨烯量子点的直径为4-6nm。
5.一种制备如权利要求1-4中任一项所述检测探针的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将金纳米颗粒与带有巯基的探针B混合，加入NaCl、NaHPO4，静置后离心去除上层清液；
(2)将石墨烯量子点与带有氨基的探针A混合，加入EDC溶液，混匀后静止。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述金纳米颗粒与带有巯基的探针B的混合浓度比例为1:(180-220)。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述金纳米颗粒与带有巯基的探针B的混合浓度比例为1:(190-210)。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述NaCl的浓度为0.05-0.2M。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述NaCl的浓度为0.08-0.15M。
10.根据权利要求5或9所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述NaHPO4的浓度为3-7mM。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述NaHPO4的浓度为4-6mM。
12.根据权利要求5或11所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述静置的时间为13-18h。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述静置的时间为15-17h。
14.根据权利要求5或13所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述石墨烯量子点与带有氨基的探针A的混合浓度比例为1:(180-220)。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述石墨烯量子点与带有氨基的探针A的混合浓度比例为1:(190-210)。
16.根据权利要求5或15所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述EDC溶液的浓度为25-29mM。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述EDC溶液的浓度为26-28mM。
18.根据权利要求5或17所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述混匀的时间为1-4min。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述混匀的时间为2-3min。
20.根据权利要求5或19所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述静止的时间为0.5-2h。
21.根据权利要求20所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述静止的时间为0.8-1.2h。
22.一种如权利要求1-4中任一项所述的探针用于检测铅离子浓度。
23.一种检测铅离子浓度的方法，其特征在于，所述方法为：将权利要求1所述的探针A和探针B置于波长为370-420nm的激发光照射下加入铅离子，进行光谱信号检测。
24.根据权利要求23所述的检测铅离子浓度的方法，其特征在于，所述方法为：将探针A和探针B置于波长为380-410nm的激发光照射下加入铅离子，进行光谱信号检测。
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