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Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种蛙皮素、包含该蛙皮素的药物及其应用。所述蛙皮素的第3位的精氨酸为甲基化精氨酸。本发明所提供的甲基化修饰蛙皮素与蛙皮素相比，具有更强的促进神经元释放γ‑氨基丁酸的效果，并可显著增强蛙皮素对癫痫的治疗效果。

Description

一种蛙皮素、包含该蛙皮素的药物及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，涉及一种蛙皮素、包含该蛙皮素的药物及其应用。
背景技术
癫痫(Epilepsy)近十年来发病率逐年增加，据世界卫生组织2012年底统计，全球患者约5000万，现已成为仅次于脑血管病的第二大神经系统常见疾患。最新流行病学研究表明，癫痫的全世界平均发病率高达0.7％，这其中有近30％的患者无法通过传统药物或其他治疗手段使病情得以控制，进而发展成为“难治性癫痫”。有近一半癫痫患者的平均寿命仅为55岁，他们在生存质量明显下降的同时也给家庭和社会增加了大量的心理和经济负担，而以上情势在以我国为代表的发展中国家显得更为突出和严峻。以美国为例，每年新增的癫痫病患者达15万，年医疗花费保守估计高达40～70亿美元。而在我国，截至2010年已有癫痫患者逾900万人，其中因病致残150.7万，患者平均寿命仅为50.1岁，死亡率为12.2‰。尽管世界各国针对癫痫发病机制和治疗手段进行了长达数十年的实验室和临床研究，但迄今为止对其具体发生机理仍然不清楚，经典的抗癫痫药物治疗又往往带来耐药性和毒副作用等问题，因此从疾病机制研究入手，寻找更为安全、有效的治疗手段就显得尤为重要。
蛙皮素(Bombesin)是一种含14个氨基酸残基的生物活性多肽。研究发现它作为一种脑肠肽在哺乳动物体内广泛存在，并且通过G蛋白偶联受体在神经系统肿瘤、脑缺血再灌注损伤以及学习记忆功能形成中均发挥了重要作用。新近研究表明，在退行性神经系统疾病帕金森病(Parkinson's disease)和老年痴呆症(Alzheimer's disease)发病过程中蛙皮素表达量均明显改变。
在本发明申请人之前的研究中发现，蛙皮素可以有效降低大脑神经元的癫痫样放电活动，加之蛙皮素作为体内的内源性多肽使用更为安全，将为癫痫治疗的药物研究提供全新的视角和思路。然而现有技术中，蛙皮素对癫痫的直接治疗效果还不够明显，需要进一步的改良。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明研究了经过甲基化修饰的蛙皮素对癫痫的抑制作用，为探索癫痫抑制药物的新型有效“靶标”和分子提供了研究方向。
本发明涉及一种蛙皮素，所述蛙皮素的第3位的精氨酸为甲基化精氨酸。
蛙皮素(Bomsesin)作为一种多肽类物质，由十四个氨基酸残基构成，早在二十世纪七十年代就被意大利神经科学家Erspamer和Negri从三种不同的欧洲蟾蜍表皮分泌物中所发现。1972年该物质被实验室分离、提纯并通过化学方式人工合成，正式命名为“蛙皮素”，同时确定了Bombesin的氨基酸构成为：Pyr-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2。
本发明申请人在对蛙皮素研究时，意外的发现将蛙皮素的第3位的精氨酸进行甲基化修饰能够增强其促进神经元释放γ-氨基丁酸的效果，并可显著增强蛙皮素对癫痫的治疗效果。
现有技术中鲜有对非组蛋白甲基化多肽功能的研究，有观点认为甲基化增加了肽键的空间位阻、或者减少肽链分子内的氢键、或者增加与N-甲基化肽键相连的那个羰基的碱性，并且减小其极性，从而导致多肽药理学活性的改变。从本发明的实验数据中，申请人认为最可能与空间位阻有关，由于申请人之前的研究表明蛙皮素主要通过与胃泌素释放肽受体(BB2受体)结合导致GABA释放量的增多及神经元活性的改变，因而甲基化可能导致蛙皮素与BB2受体亲和力的改变，进而增加其对癫痫的治疗效果。
优选的，如上所述的蛙皮素，所述甲基化精氨酸为二甲基化修饰的精氨酸。
优选的，如上所述的蛙皮素，所述甲基化精氨酸为不对称二甲基化修饰的精氨酸。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于治疗癫痫的药物，其包括如上所述的蛙皮素并以其作为主要活性成分。
优选的，如上所述的药物，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
优选的，如上所述的药物，所述药物中，所述蛙皮素的浓度不低于0.25μg/μL。
优选的，如上所述的药物，所述药物中，所述蛙皮素的浓度为0.5μg/μL～1μg/μL。
如上所述的蛙皮素在用于制备预防、改善或治疗癫痫的药物组合物中的应用。
优选的，如上所述的应用，其特征在于，所述组合物用于：
延缓癫痫的形成；和/或
抑制癫痫持续状态；和/或
减弱癫痫发作引起的脑兴奋程度；和/或
增加脑内神经元抑制性神经递质GABA的释放。
优选的，如上所述的应用，其特征在于，所述脑内神经元具体为海马皮层神经元。
本发明的有益效果主要体现在，本发明首次发现了甲基化对蛙皮素治疗癫痫效果的影响，为探索新型癫痫药物、及以神经元兴奋性改变为基础的脑系疾病的新药筛选提供了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的一个实施例中，向大鼠海马内注射1μL美蓝以观察药物的扩散范围；Scale bar＝500μm；
图2为本发明的一个实施例中，脑内微量注射蛙皮素(A组)和不对称二甲基化修饰的蛙皮素(D组)对癫痫发作级别的影响；ANAVA，n＝10，*p＜0.05vs Vehicle；**p＜0.01vsVehicle；#p＜0.05vs A；
图3为本发明的一个实施例中，脑内微量注射蛙皮素(A组)和不对称二甲基化修饰的蛙皮素(D组)对全身发作的发生率的影响；ANAVA，n＝8～9，*p＜0.05vs Vehicle；**p＜0.01vs Vehicle；#p＜0.05vs A；
图4为本发明的一个实施例中，脑内微量注射蛙皮素(A组)和不对称二甲基化修饰的蛙皮素(D组)对癫痫持续状态的影响；ANAVA，n＝9，*p＜0.05vs Vehicle。
具体实施方式
本发明涉及一种蛙皮素，所述蛙皮素的第3位的精氨酸为甲基化精氨酸。
优选的，如上所述的蛙皮素，所述甲基化精氨酸为二甲基化修饰的精氨酸。
优选的，如上所述的蛙皮素，所述甲基化精氨酸为不对称二甲基化修饰的精氨酸。
根据本发明的一方面，本发明还涉及一种用于治疗癫痫的药物，其包括如上所述的蛙皮素并以其作为主要活性成分。
优选的，如上所述的药物，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
优选的，如上所述的药物，所述药物中，所述蛙皮素的浓度不低于0.25μg/μL。
优选的，如上所述的药物，所述药物中，所述蛙皮素的浓度为0.5μg/μL～1μg/μL。
如上所述的蛙皮素在用于制备预防、改善或治疗癫痫的药物组合物中的应用。
优选的，如上所述的应用，其特征在于，所述组合物用于：
延缓癫痫的形成；和/或
抑制癫痫持续状态；和/或
减弱癫痫发作引起的脑兴奋程度；和/或
增加脑内神经元抑制性神经递质GABA的释放。
优选的，如上所述的应用，其特征在于，所述脑内神经元具体为海马皮层神经元。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
一.体外实验验证甲基化修饰的蛙皮素对GABA分泌量的影响。
(1)实验材料：
实验动物：
试剂：PTZ(戊四唑)，pilocarpine(匹鲁卡品)购自美国Sigma公司；
蛙皮素、一甲基化修饰的蛙皮素、对称二甲基化修饰的蛙皮素以及不对称二甲基化修饰的蛙皮素由南京肽业生物科技有限公司合成；冻干的多肽粉末用1×PBS溶解后进行脑内微量注射。
实验方法：
新生大鼠海马神经细胞体外培养
将出生24h内的Wistar大鼠，用75％乙醇浸泡后，置超净工作台内，再用酒精棉球擦大鼠头部，用眼科剪沿鼠后颈剪开一头皮裂口，并沿矢状缝向前作一纵向剪口，用弯头镊掀开皮肤露出颅骨，沿颅缝作一同上的T字型剪口，用弯镊掀开颅骨使两侧大脑皮层完全暴露，用培养液洗去血液，钝性分离两测海马组织，并去除血管及脑膜，小心将海马组织置于培养皿的PBS液中，用眼科组织剪反复剪切，将海马组织剪成1mm左右的小块，用PBS液洗3次，将剪好的组织小块置于37℃0.25％胰蛋白酶消化液中消化3～5min，用尖端抛光的吹打管轻轻吹打，液体吹打均匀后，用含10％胎牛血清DMEM 7～8ml终止反应，用10ml完全培养基清洗两次，分别用200目和400目铜网依次过滤，过滤液置于玻璃离心管中1000rpm离心5min，弃上清，加入DMEM/F12完全培养基(含有15％胎牛血清，2％B27，20ng/ml EGF和20ng/ml bFGF)吹打均匀，使其成为细胞悬液。取少量细胞悬液用台盼蓝染色，于显微镜下观察活细胞数量，调整细胞密度为1×106/ml，置入37℃含5％CO2的培养箱中培养，24h后，用含阿糖胞普培养液替换原种植培养液，抑制神经胶质细胞生长。
将培养5d后的新生大鼠海马神经元分为五组，分别为Vehicle(溶剂对照组，使用等量的PBS处理)、蛙皮素处理组(A组)，一甲基化修饰的蛙皮素处理组(B组)、对称二甲基化修饰的蛙皮素处理组(C组)以及不对称二甲基化修饰的蛙皮素处理组(D组)。将后四组的多肽用1×PBS稀释为100ng/mL的浓度，分别向各组培养液中加入1×PBS或蛙皮素、各种甲基修饰的蛙皮素，按1ml培养液：10μL药剂的比例添加，每组重复4次；每天添加一次，每次处理30min后换液洗去药剂；连续处理3天。在第三天分别收集各组样品的细胞上清液，做好标记，离心后弃去沉淀，将所得上清液用于检测GABA的ELISA试剂盒检测体外培养的海马神经元上清液中GABA浓度变化。
表一刺激后海马神经元GABA分泌变化
Figure BDA0001594983690000071
Figure BDA0001594983690000081
*p＜0.05vs Vehicle；**p＜0.01vs Vehicle；#p＜0.05vs A；##p＜0.01vs A。
从上表可知，二甲基化比一甲基化对GABA分泌量的影响更大；C组与A组相比，虽然也具有显著性差异，但差异并没有D组明显。由于D组和C组的区别仅在于甲基化对称与否，因而甲基化对蛙皮素生理活性的影响可能与空间位阻的大小有关。
二.在海马皮层注射甲基化修饰的蛙皮素对癫痫治疗的影响。
以上结果显示蛙皮素能够诱导神经元GABA分泌量的增加，接下来我们通过脑内埋管微量注射蛙皮素(A组)和不对称二甲基化修饰的蛙皮素处理组(D组)的方法来验证甲基化修饰是否能够提升蛙皮素对癫痫易感性影响。
1.方法
1.1脑内埋管及微量定点注射
1.1.1脑内埋管
器械准备；止血钳×2，眼科镊子×2，剪刀一把，棉球适量，管子若干，骨科钻头。在第二天埋管之前将上述物品高压灭菌，然后放入恒温箱备用。
管子的制作：管子用6号针头磨制而成。管子的长度为13mm。管子中加内芯，防止堵塞。
埋管之前，用紫外照射手术室20分钟左右，实验台面用医用酒精擦干净。将雄性Wistar大鼠(250-280g)称重后用5％水合氯醛(0.75ml/100g)腹腔注射麻醉，大约3分钟左右大鼠昏迷后，将头上的毛剔除。将大鼠头部固定于脑立体定位仪，碘伏消毒头皮，剪开头皮，充分暴露颅骨表面，在显微镜下找到前囟点，以此为坐标零点并找到海马(hippocampus,HIP)在颅骨表面的定位：AP(前后)，-3.3mm；L(两侧)，±2mm；V(深度)，-3.4mm。在该位置钻孔后，把管子固定到夹持器上，在前囟点归零，然后再将带有套管的Z轴经孔下移直至目的脑区上方，插入指定深度。用棉花擦去血，用502涂在管子周围。如果管子不垂直可在此时扶正。待502干后，将牙托粉均匀涂在管子周围。待牙托粉干后，插入内芯，防止管子堵塞。剪掉死皮，碘伏擦洗暴露的皮肤，注射双抗防止感染。缝合头皮并将动物放回鼠笼，恢复一周后开始实验。
1.1.2微量定点注射
在大鼠清醒的状态下进行微量注射操作，用大鼠固定器将大鼠固定，注意大鼠呼吸顺畅。先用眼科镊将内芯轻轻取出，小心插入与PE管相连的28号微量注射针，微量注射针与微量注射泵相连，以每分钟0.5微升的速度进行注射。注射完毕后注射针原位停留两分钟待药物充分扩散后拔出。注射完毕后，将大鼠放回鼠笼。
1.2动物行为学评估
I根据文献和预实验结果，选用PTZ浓度为40mg/kg，pilocarpine200mg/kg，溶解于PBS，并与腹腔内注射。注射PTZ以后，大鼠单独放予透明玻璃笼子内，观察行为变化30min。癫痫发作严重程度根据文献分级：0级：无反应；1级：耳朵和面部抽动，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼；2级：肌阵挛，但无直立；3级：肌阵挛，双侧前肢抬起；4级：侧身倒地；5级：背部倒地，全身强直，阵挛发作：6级：死亡。
II、评估了两种老鼠在由PTZ诱发全身发作的发生率。
III、还评估了两种老鼠在由匹鲁卡品引起癫痫持续状态的发生率。
我们选择在PTZ和pilocarpine注射10min前向动物脑内进行蛙皮素(A组)和不对称二甲基化修饰的蛙皮素处理组(D组)的微量注射，注射量为每测1μL，药物浓度均为0.5μg/μL，用PBS溶解；Vehicle组注射等量的PBS。注射后进行癫痫发作级别、全身发作的发生率以及癫痫持续状态的发生率的评估。注射时的药物扩散范围如图1所示。评估结果分别如图2-4所示。从图中可知，在海马中无论是注射A组还是D组药物，均能有效降低癫痫发作级别、全身发作的发生率以及癫痫持续状态的发生率，但D组药物在降低癫痫发作级别、全身发作的发生率方面效果显著高于A组药物。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (7)

1.一种蛙皮素，其特征在于，所述蛙皮素的第3位的精氨酸为甲基化精氨酸；所述甲基化精氨酸为不对称二甲基化修饰的精氨酸。
2.一种用于治疗癫痫的药物，其包括权利要求1所述的蛙皮素并以其作为主要活性成分。
3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物还包含一种或多种药学上可接受的辅料。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述药物中，所述蛙皮素的浓度为0.5μg/μL～1μg/μL。
5.权利要求1所述的蛙皮素在用于制备改善或治疗癫痫的药物组合物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述组合物用于：
抑制癫痫持续状态；和/或
减弱癫痫发作引起的脑兴奋程度；和/或
增加脑内神经元抑制性神经递质GABA的释放。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述脑内神经元具体为海马皮层神经元。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Bombesin Facilitates GABAergic Transmission and Depresses Epileptiform Activity in the Entorhinal Cortex;Hao-peng Zhang;《HIPPOCAMPUS》;20130914(第24期);第21-31页 *
蛙皮素促进内嗅皮层神经元 GABA 释放在抑制癫痫样活动中的机制研究;张昊鹏;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20150115(第1期);第69页第2段，第70页第1段 *

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