CN108245500A - 王浆酸在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的用途 - Google Patents

王浆酸在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及王浆酸在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的用途。本发明基于建立的腺苷脱氨酶抑制剂筛选平台，证实王浆酸具有良好的腺苷脱氨酶抑制活性，因此能用于治疗腺苷脱氨酶活性升高的相关疾病，如系统性红斑狼疮、白血病、伤寒、糖尿病、肝病、肿瘤、兴奋毒性神经紊乱、神经退行性疾病、心肌缺血或高血压等。本发明进一步建立了系统性红斑狼疮动物模型，通过动物实验证实王浆酸具有确凿的治疗效果，与五味子提取物联用可以发挥协同作用。

Description

王浆酸在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的用途
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及王浆酸在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的用途，还涉及含有王浆酸与五味子提取物的药物组合物及所述的药物组合物在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的用途。
背景技术
腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase；Adenosine aminohydrolase；ADA；EC3.5.4.4)是一种与机体细胞免疫活性具有重要关系的巯基酶，每分子至少含2个活性巯基。它也是嘌呤核苷酸代谢的关键酶，能特异性催化腺嘌呤核苷或脱氧腺嘌呤核苷脱氨生成次黄嘌呤核苷或次黄嘌呤脱氧核苷，而后经核苷磷酸化酶催化生成次黄嘌呤，最终氧化成尿酸排出体外。
ADA广泛分布于人体的多组织中，尤其在肠系膜、肝、脾、肾及淋巴细胞中水平较高，以盲肠、脾中含量最多，又以淋巴细胞活性最高，在纤维细胞、羊水细胞、肝、肾、肺、骨骼肌中也有发现。血液中ADA主要存在于红、白细胞(淋巴细胞、粒细胞)中，其含量为血清中的40～70倍，T淋巴细胞比B淋巴细胞该酶活性更高。血清中的ADA主要来源于肝脏，90％以上的ADA存在于肝细胞浆水溶性部分，其余位于核内，与核酸代谢有关。
正常水平的ADA对机体胞内和胞外的核苷代谢起了很重要的作用。ADA活性的改变常引起病理学上的改变。在许多疾病中发现了ADA活性的升高，如白血病[1]、伤寒[2]、系统性红斑狼疮[3]、糖尿病[4]、肝病[5]、肿瘤等。特别是在许多癌症患者中，ADA的活性显著升高，如直肠癌[6]、乳腺癌[7]、肾脏腺癌[8]等。
多年前已经有人认为ADA抑制剂有助于治疗病毒引起的传染和一些类型的淋巴增殖紊乱。另外，ADA抑制剂可以调节B-或T-细胞中恶性肿瘤的免疫反应，还可以通过防止脱氨及伴随的钝化作用，来增强抗白血病和抗病毒的核苷(ara-A和3'-脱氧腺苷)的影响。
近来，对腺苷A受体拮抗剂的研究表明，内源性细胞外的腺苷对过多的刺激性氨基酸引起的刺激和侵占具有一定的保护作用。因此，有人提出通过特定的方式来提高内源性细胞外腺苷的水平，也就是说，通过使用ADA和腺苷激酶的抑制剂来减少腺苷的衰弱。这一途径最大的优点是内源性细胞外腺苷水平的提高受那些产生这类细胞最多的(如缺氧或缺血的组织)或受到过多刺激的位点的根本制约。有几个课题组已经研究了ADA和腺苷激酶对中枢神经系统中腺苷释放的影响。这些研究的结果表明，与刺激性氨基酸受体刺激相适应的内源性细胞外腺苷的形成水平在药理学上的提高，对于治疗兴奋毒性紊乱和神经退化具有重大的医学潜力。
腺苷的控制对一些心肌缺血的疾病具有保护作用，而且在心肌组织中的内源性腺苷也有保护作用。最近有报道说，腺苷脱氨酶可以通过内源性心肌腺苷的提高和ATP的保存，来减弱心肌缺血的伤害，并提高心肌收缩功能和新陈代谢功能的恢复。此外，人们还发现对ADA的抑制作用可以对老年人高血压提供有利的影响，因此，细胞外ADA抑制剂的使用可以对患有高血压病人的心脏具有保护作用。
王浆酸(10-羟基-2-癸烯酸，简称10-HDA)，是蜂王浆中一种重要的不饱和脂肪酸，在常温下为淡黄色或白色的针状晶体。1921年，德国科学家Lange首次在工蜂上颚腺中发现了10-HDA，Barker等在1957年首先报道了从蜂王浆中分离提取出10-HAD。10-HDA具有多种生理活性。
专利文献CN105536041A，公开日2016.05.04，公开了一种含王浆酸的抗菌生物敷料、制备方法及其用途，所述的抗菌生物敷料由如下重量百分比的成分组成：0.01～20％王浆酸，0.01～1％稳定剂，1～5％壳聚糖、海藻酸盐、聚乙烯醇或胶原蛋白，余量为基质；所述稳定剂为烷基三甲基铵盐、多烷基二甲基铵盐或甜菜碱型表面活性剂。该抗菌生物辅料可用于治疗感染性伤口、外科创伤、各种烧烫伤创伤等。
期刊文献《中药材》，2002，25(5):346-347，刊出的论文“10-羟基-2-癸烯酸治疗实验性高脂血症大鼠的药理研究”，报道了10-羟基-2-癸烯酸对治疗实验性高脂血症大鼠的药理作用。方法：通过喂养高脂食物建立高脂血动物模型，测定10-HAD对高脂血动物预防给药及治疗给药的作用。结果：10-HAD能够明显降低实验性高脂血症大鼠血液中甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、β-脂蛋白含量，同时升高高密度脂蛋白(HDL)含量，说明10-HDA对高脂血症具有良好的治疗作用。结论：10-HAD是蜂王浆治疗高脂血症中的功能因子。
但是目前关于王浆酸对腺苷脱氨酶活性的影响及其在治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病中的作用还未见报道。
参考文献：
[1]余莲,张兆嶙.白血病患者血清腺苷脱氨酶测定及临床意义[J].白血病,1999,8(5):292-293.
[2]施前锋,徐辉.血清腺苷脱氨酶在伤寒诊断中的意义[J].江西医学检验,2001,19(1):57.
[3]Nalini G,Hariprasad C,Chandrasekaran A N,et al.A comparative studyof serum deaminases in systemic rheumatic diseases[J].Rheumatology,1993,32(12):1118-1119.
[4]管茶英,周美霞,陈光.糖尿病患者血清腺苷脱氨酶测定的临床意义[J].临床检验杂志,2006,24(5):331.
[5]张军,常丽.肝病患者血清腺苷脱氨酶的检测分析[J].航空航天医药,2006,17(2):76.
[6]A,Canbolat O,Demirci S,et al.Activities of adenosinedeaminase and 5′-nucleotidase in cancerous and noncancerous human colorectaltissues[J].Medical Oncology,2000,17(4):319-324.
[7]Aghaei M,Karami-Tehrani F,Salami S,et al.Adenosine deaminaseactivity in the serum and malignant tumors of breast cancer:the assessment ofisoenzyme ADA1 and ADA2 activities[J].Clinical biochemistry,2005,38(10):887-891.
[8]Sufrin G,Tritsch G L,Mittelman A,et al.Adenosine deaminaseactivity in patients with renal adenocarcinoma[J].Cancer,1977,40(2):796-802.
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供王浆酸的新医药用途。
第一方面，本发明提供了王浆酸在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病。
进一步地，所述的腺苷脱氨酶活性升高的疾病为系统性红斑狼疮、白血病、伤寒、糖尿病、肝病、肿瘤、兴奋毒性神经紊乱、神经退行性疾病、心肌缺血或高血压等。
作为本发明的一个具体实施例，所述的腺苷脱氨酶活性升高的疾病为系统性红斑狼疮。
第二方面，本发明提供了一种药物组合物，所述的药物组合物其活性成分包含王浆酸和五味子提取物。
优选地，所述的五味子提取物制备方法为：取五味子中药材粉末，加入甲醇，密闭条件下超声提取，超声结束后，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液，氮吹干，得浸膏，即为所述的五味子提取物。
更优选地，所述的五味子提取物的制备方法具体为：取过40-70目筛的五味子中药材粉末，精密称定，加入甲醇，料液比为0.032-0.05g/ml；密闭条件下超声处理，功率240-260W，频率35-45kHz，时间为50-70min，放冷，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液；氮吹干，得浸膏。
优选地，所述的药物组合物还包含药用辅料。
优选地，所述的药物组合物为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂或口服液。
第三方面，本发明提供了所述的药物组合物在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的应用。
作为本发明的一个具体实施例，所述的腺苷脱氨酶活性升高的疾病为系统性红斑狼疮。
本发明优点在于：
1、本发明提供了王浆酸的新医药用途。基于本发明建立的腺苷脱氨酶抑制剂筛选平台，证实王浆酸具有良好的腺苷脱氨酶抑制活性，因此能用于治疗腺苷脱氨酶活性升高的相关疾病，如系统性红斑狼疮、白血病、伤寒、糖尿病、肝病、肿瘤、兴奋毒性神经紊乱、神经退行性疾病、心肌缺血或高血压等。本发明进一步建立了系统性红斑狼疮动物模型，通过动物实验证实了王浆酸具有确凿的治疗效果。
2、本发明提供了一种含有王浆酸和五味子提取物的药物组合物，两者联用，对于疾病的治疗可以发挥协同作用。
附图说明
附图1.产物肌苷和内标的色谱图。
附图2.酶浓度对肌苷生成量的影响。
附图3.底物腺苷对肌苷生成量的影响。
附图4.反应时间对肌苷生成量的影响。
附图5.反应温度对肌苷生成量的影响。
附图6.ADA酶促动力学曲线图。
附图7.不同浓度王浆酸对ADA酶活性的抑制率。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1ADA抑制剂的筛选
一、实验方法
1仪器与试剂
1.1仪器
涡旋仪(Votex-Genie 2，USA)，BT-25S电子分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。KQ-250DB数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。微量移液器(Eppendorf，USA)。Milli-Q纯水仪(Milli-Q，Millipore Co.，Billerica，MA，USA)。微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器有限公司)。
1.2试剂
腺苷脱氨酶(ADA)购于上海源叶生物科技有限公司。腺苷(AD)，肌苷(Hypoxanthine ribonucleoside)，矮壮素(内标，IS)，购买于Sigma-Aldrich(MO,USA)。王浆酸、克拉屈滨、EHNA和2’-脱氧助间霉素(2’-dC F)购于大连美仑生物技术有限公司。色谱级甲醇购于Fisher Co.(NJ,USA)。色谱级甲酸购于Tedia Inc.(OH,USA)。超纯水通过Milli-Q Academic System(Millipore,Billerica,MA)获得。其他试剂均为分析级。
五味子购于上海养和堂药业连锁经营有限公司。
1.3实验动物与样品收集
10只雄性SD大鼠(180～220g)购自北京维通利华实验动物有限公司(生产许可：SCXK(京)2016-0011)，饲养于上海中医药大学实验动物中心(使用许可：SYXK(沪)2014-0008)。从眼眶静脉丛取血肝素抗凝获得全血、非抗凝离心获得血清及血细胞。
2标准溶液及质控样品配制
取适量的肌苷，加超纯水溶解配制获得7.456mM的储存液；取适量的IS，加甲醇溶解配制获得6.326mM的储存液。使用初始流动相通过一系列稀释肌苷，获得8个系列浓度(0.020、0.049、0.122、0.305、0.764、1.909、4.772、11.930μM)标准工作液及低(0.020μM)、中(0.764μM)、高(11.930μM)质控(Quality control，QC)样品，使用甲醇稀释获得3.290μM的IS工作液，所有的溶液都储存于4℃，放置室温后使用。
3药材提取与样品制备
称取适量王浆酸加入DMSO配制获得100mM王浆酸母液，用纯水稀释配制获得系列含0.1％DMSO待测样品溶液。
取过60目筛的五味子药材粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液。取上清液重量的15％放入到10mL EP管中，氮吹干，再称重，获得浸膏的重量。称取适量浸膏加入1％DMSO溶解制备获得100mg生药/mL待测药材的母液。
4色谱条件
液相条件：色谱柱使用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm，i.d.1.8μm，Waters，USA)，柱温：40℃。流速：0.3mL/min，等度洗脱，流动相为0.1％甲酸水-甲醇(85％-15％)，进样体积为5μL。
质谱条件：使用Thermo Fisher Q-Exactive LC Orbitrap LC-MS/MS四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific，USA)配备HESI源作为分析检测的仪器。在正离子模式下采用全扫描(分辨率为70 000)，设定质荷比范围为m/z 50至750。质谱参数设置如下：鞘气(N2)流速：35arb；辅助气(N2)的流量流速：10arb；喷雾电压：2.00kV；毛细管温度：320℃；s-lens射频水平：50；辅助气加热器温度：300℃。
5方法学验证
5.1线性:通过测定0.020至11.930μM的8个不同浓度的肌苷，平行五份样品，标准曲线是通过产物与内标峰面积的比值与浓度作图获得的，产物肌苷峰面积与内标峰面积的比值作为y值，肌苷浓度作为x值进行线性回归。最低检测限与定量限分别为检测信噪比为3与10时标品的浓度。
5.2精密度:精密度是通过测定浓度分别为0.020,0.764,11.930μM的三个质控样品(n＝6)获得的，其中日内精密度是一天之内测定三次质控样品(QC)，日间精密度是连续三天测定三次质控样品，RSD通过等式：％RSD＝[standard deviation(SD)/Cobs]×100计算。所测得的高、中浓度QC样品的精密度RSD＜15％，低浓度QC样品的精密度RSD＜20％。
5.3准确度：准确性通过测定三个不同浓度的QC样品(0.020,0.764,11.930μM；n＝6)，通过标准曲线计算出测定的浓度。通过方程回收率(％)＝[Cobs/Cthe]×100计算回收率，Cobs为计算浓度，Cthe为理论浓度。准确度要求在85％-115％范围内。
5.4稳定性：室温稳定性即通过测定室温(25±2℃)放置4h的三个不同浓度的QC样品(n＝6)，测定稳定性通过测定于进样室或冰箱(4℃)放置24h的三个不同浓度的QC样品(n＝6)。
5.5基质效应：基质效应是通过比较含基质的(预处理甲醇沉淀蛋白)的溶剂配制的样品(B,n＝6)与初始流动相配制的样品(A,n＝6)，并通过mean value(B)/mean value(A)×100％计算获得，基质效应要求在85％至115％之间。
6腺苷脱氨酶活性测定
使用AD作为ADA活性实验的底物，测定大鼠血清、全血和血细胞中ADA活性。大鼠血清、全血和血细胞使用10mM PBS缓冲液(pH7.6)进行稀释并采用BCA法测定蛋白浓度。首先加入30μL的待测样品(20mg/mL蛋白浓度)，然后加入30μL底物(AD为3.742μM)，30℃反应，在反应5min及10min时立即用180μL含有3.290μM IS的冰甲醇(0℃)终止反应，平行3份，取反应终止液50μL，加入200μL水稀释混匀，至15000×g离心10min，取上清液进样检测。
7体外筛选ADA抑制剂实验
使用AD作为ADA活性实验的底物。采用优化好的条件，首先加入包括6μL的待测样品，然后加入34μL酶溶液(ADA为0.00736unit/mL)混合，放置10min，加入20μL底物(AD为3.742μM)，30℃反应20min，立即用180μL含有3.290μM IS的冰甲醇(0℃)终止反应，取出50μL，加入200μL水稀释混匀，用于分析。IC50值通过Prism 5软件计算。
使用UPLC-MS法对ADA酶动力学特征进行分析评价。使用6μL缓冲液替代待测样品，使用的底物浓度AD为(1.871-374.195μM)，平行三份。动力学参数：最大反应速率(Vmax)及米氏常数(Km)通过Eadie-Hofstee V versus V/S作图拟合获得。
二、实验结果
1色谱条件
在先前提到的UPLC条件下，使用HSS T3柱肌苷和内标能够达到基线分离，其保留时间分别为0.95和1.53min(见图1)。在本试验，为了改善各成分的色谱行为，如良好的峰对称性，高的检测灵敏性和适当的离子化，结合自身丰富的研究经验，我们考察了大量因素，包括不同的流动相(水，乙腈，甲醇)及流动相添加剂(乙酸铵，乙酸，甲酸)等因素，最终选择0.1％甲酸与甲醇作为流动相，流速为0.3mL/min，柱温40℃，检测时间仅为2min可用作准确的高通量筛选，并且在实验中AD和ADA用量也较低。
2方法学验证
对该方法的线性、选择性、精密度、准确度、基质效应及稳定性进行了评价。
肌苷的线性方程为y＝0.312x+0.00603，R2＝0.9951，肌苷的LOD(S/N＝3)为0.013μM，LOQ(S/N＝10)为0.02μM。日内和日间精密度、准确性、基质效应及稳定性的结果见表1，其中日内精密度在2.14％至7.17％内，日间精密度2.55％至8.99％间；三个水平质控样品的准确度分别为89.17±2.04、111.3±0.85、85.69±1.13，准确度都在85％-115％范围内，基质效应在101.64％至107.12％范围内，室温稳定性及储存稳定性都符合测定要求。
表1UPLC-MS法测定肌苷的方法学验证结果(mean±sd)
注：RT：室温。
3优化酶反应的酶浓度底物、酶浓度
酶反应的底物浓度、酶浓度及反应时间的优化，根据稳定状态动力学原理应选择产物生成呈线性变化的区域。发现在抗ADA实验中(见图2-4)，ADA的用量是0.00736unit/mL，底物腺苷的用量是3.742μM，反应时间是20min，产物肌苷的生成呈线性变化，因此选择反应中，ADA的用量是0.00736unit/mL，底物腺苷的用量是3.742μM。
4优化酶反应的温度
在反应温度30℃至40℃间对ADA没有影响(见图5)，故为了实验方便选择了30℃作为酶反应的实验温度。
5ADA反应的米氏常数
为计算获得酶动学参数，采用未加抑制剂组的反应，结果见图6，从图可以知道，ADA催化的反应符合米氏动力学。ADA的Km和Vmax分别为81.70±13.82μM和779.2±43.99μM/min/unit。
6大鼠血清、全血和血细胞中ADA活性
采用建立好的方法测得大鼠全血、血清及血细胞ADA活性分别为1.765±0.434unit/mg protein、0.450±0.101unit/mg protein和2.150±0.412unit/mgprotein。
7体外ADA抑制及筛选
采用建立好的方法测得不同浓度王浆酸对ADA酶活性抑制率见图7，计算获得其IC50为0.89±0.02μM，虽然活性不如EHNA(IC50：0.21±0.0026μM)和2’-dCF(IC50：0.053±0.011μM)，但显著优于克拉屈滨(IC50：16.00±0.52μM)。
采用建立好的方法测得五味子体外抑制ADA活性结果见表1，表明五味子对ADA具有显著的抑制作用。
表1.中药和化合物抑制腺苷脱氨酶活性
实施例2
(1)从SD大鼠眼眶静脉丛取血肝素抗凝获得全血、非抗凝离心获得血清及血细胞，使用pH7.5的11mM PBS缓冲液进行稀释并测定蛋白浓度，得到18mg/mL蛋白浓度的待测样品；向所述的待测样品中加入底物腺苷，腺苷终浓度为3.740μM，30℃反应22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液，加3.5倍体积的水稀释混匀，离心，得到反应终止液上清液。
(2)按照实施例1的方法，通过液相色谱串联质谱法测定反应终止液上清液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：42℃；流速：0.28mL/min；进样体积：4.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：34arb；辅助气N2的流量流速：11arb；喷雾电压：1.9kV；毛细管温度：330℃；s-lens射频水平：52；辅助气加热器温度：290℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，测得大鼠全血、血清及血细胞ADA活性分别为1.658±0.339unit/mg protein、0.429±0.095unit/mg protein和2.251±0.347unit/mgprotein。
实施例3
(1)从SD大鼠眼眶静脉丛取血肝素抗凝获得全血、非抗凝离心获得血清及血细胞，使用pH7.7的9mM PBS缓冲液进行稀释并测定蛋白浓度，得到22mg/mL蛋白浓度的待测样品；向所述的待测样品中加入底物腺苷，腺苷终浓度为3.750μM，40℃反应18min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液，加4.5倍体积的水稀释混匀，离心，得到反应终止液上清液。
(2)按照实施例1的方法，通过液相色谱串联质谱法测定反应终止液上清液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38℃；流速：0.32mL/min；进样体积：5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：36arb；辅助气N2的流量流速：9arb；喷雾电压：2.1kV；毛细管温度：310℃；s-lens射频水平：48；辅助气加热器温度：310℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，测得大鼠全血、血清及血细胞ADA活性分别为1.598±0.417unit/mg protein、0.472±0.102unit/mg protein和2.271±0.258unit/mgprotein。
实施例4
(1)取药材(柴胡)粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液。取上清液重量的15％放入到10mL EP管中，氮吹干，再称重，获得浸膏的重量。称取适量浸膏加入1％DMSO溶解制备获得100mg/mL待测药材的母液。加入腺苷脱氨酶溶液混合，腺苷脱氨酶终浓度为0.00732unit/mL，放置15min，加入底物腺苷，腺苷的终浓度为3.740μM，40℃反应18min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液用水稀释。
(2)按照实施例1的方法，液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：38℃；流速：0.32mL/min；进样体积：4.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：34arb；辅助气N2的流量流速：9arb；喷雾电压：2.1kV；毛细管温度：330℃；s-lens射频水平：48；辅助气加热器温度：310℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，进一步计算对腺苷脱氨酶的IC50。结果测得柴胡提取物对腺苷脱氨酶的IC50为2.24±0.05mg·mL-1。
实施例5
(1)取药材(五味子)粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液。取上清液重量的15％放入到10mL EP管中，氮吹干，再称重，获得浸膏的重量。称取适量浸膏加入1％DMSO溶解制备获得100mg/mL待测药材的母液。加入腺苷脱氨酶溶液混合，腺苷脱氨酶终浓度为0.00738unit/mL，放置5min，加入底物腺苷，腺苷的终浓度为3.750μM，35℃反应22min，立即用冰甲醇0℃条件下终止反应，取反应终止液用水稀释。
(2)按照实施例1的方法，液相色谱串联质谱法测定反应终止液中肌苷含量：
液相条件如下：色谱柱：1.8μm的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱；流动相：0.1％甲酸水-甲醇；洗脱程序：等度洗脱；柱温：42℃；流速：0.28mL/min；进样体积：5.5μL；
质谱条件如下：扫描模式：正离子模式；鞘气(N2)流速：36arb；辅助气N2的流量流速：11arb；喷雾电压：1.9kV；毛细管温度：310℃；s-lens射频水平：52；辅助气加热器温度：290℃。
(3)计算腺苷脱氨酶的活性，进一步计算对腺苷脱氨酶的IC50。结果测得五味子提取物对腺苷脱氨酶的IC50为0.051±0.002mg·mL-1。
实施例6
条件优化过程中，设置了大量的实验组。例如当流动相采用0.1％甲酸水-乙腈(70:30)，流速为0.3mL/min时，目标物质出峰时间延长，2min内无法完成检测，且峰型宽。当流动相采用0.1％甲酸水-乙腈(85:15)，流速为0.4mL/min时，目标物质出峰与内标物出峰时间重叠，质谱响应相互有一定影响。
实施例7王浆酸治疗系统性红斑狼疮的动物实验
1实验材料
8周龄Balb/c雌性和雄性小鼠，购自上海生物制品研究所实验动物部。自行交配得到F1代小鼠。
ds DNA ELISA试剂盒，购于Abcam公司。
2实验方法
2.1动物模型建立
取F0代Balb/c小鼠6只，雌雄各3只，收集胸腺、脾脏，分离淋巴细胞，刀豆蛋白活化48h，收集活化的淋巴细胞，0.3％戊二醛灭活，多点皮下注射灭活的Con A活化淋巴细胞至F1代小鼠体内，2×107/只。共造模8次，前四次每周一次，后四次隔一周加强一次，每次注射用Con A活化淋巴细胞均于造模前两天收集，按照上述方法注射。
2.2动物分组和给药
将建立的SLE模型小鼠随机分为四组，每组10只，分别为：
模型对照组：蒸馏水灌胃，5ml/d。
王浆酸组：王浆酸灌胃，剂量0.5mg/kg/d，体积5ml，使用蒸馏水配制。
五味子提取物组：取过60目筛的五味子药材粉末2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液。取上清液重量的15％放入到10mL EP管中，氮吹干，再称重，获得浸膏。浸膏使用蒸馏水溶解，灌胃给药，剂量50mg生药/kg/d，体积5ml。
王浆酸+五味子提取物组：王浆酸和如上方法制备的五味子提取物共同灌胃，剂量：(0.25mg王浆酸+25mg五味子生药)/kg/d，体积5ml，使用蒸馏水配制。
另设正常对照组，蒸馏水灌胃，5ml/d。
以上各组均于第8次造模后开始给药，连续给药两周，两周后测定指标。
2.3 24h尿蛋白质定量检测
于治疗的最后一天用代谢笼收集24h小鼠的尿液，考马斯亮蓝染色法测定尿液中蛋白质的量。
2.4外周血抗ds-DNA抗体的检测
治疗后取血，加入抗凝管中，其余血液加入促凝管中，制备血清。使用ds DNAELISA试剂盒测定。
2.5血清生化指标检测
治疗后取血，加入抗凝管中，其余血液加入促凝管中，制备血清。测定血液尿素氮和肌酐含量。
2.6统计学处理
采用SPSS13.0软件统计数据，各组间数据比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
3实验结果
3.1各组小鼠24h尿蛋白含量
各组小鼠24h尿蛋白含量检测结果见表2。进行组间比较，相比于正常对照组，模型对照组的24h尿蛋白含量显著升高，两者差异具有统计学意义(P＜0.01)，王浆酸组、五味子提取物组的24h尿蛋白相比于正常对照组也有所升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，王浆酸+五味子提取物组相比于正常对照组，24h尿蛋白含量的差异不显著，不具有统计学意义(P＞0.05)。相比于模型组，各用药组24h尿蛋白均显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
表2.各组小鼠24h尿蛋白含量
3.2各组小鼠血清抗ds-DNA抗体水平
各组小鼠血清抗ds-DNA抗体水平检测结果见表3。进行组间比较，相比于正常对照组，模型对照组的抗ds-DNA抗体浓度显著升高，两者差异具有统计学意义(P＜0.01)，王浆酸组、五味子提取物组的抗ds-DNA抗体浓度相比于正常对照组也有所升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，而王浆酸+五味子提取物组与正常对照组的抗ds-DNA抗体浓度之间的差异不具有统计学意义(P＞0.05)。相比于模型组，各用药组抗ds-DNA抗体浓度均显著下降，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
表3.各组小鼠血清抗ds-DNA抗体浓度
3.3各组小鼠血液生化指标水平
各组小鼠血液生化指标的检测结果见表4。进行组间比较，针对尿素氮，相比于正常对照组，模型对照组的尿素氮水平显著升高，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)，王浆酸组、五味子提取物组的尿素氮水平相比于正常对照组也有所升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，王浆酸+五味子提取物组和正常对照组的尿素氮含量的差异不具有统计学意义(P＞0.05)。相比于模型组，各用药组小鼠血液尿素氮含量均显著下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。针对肌酐，相比于正常对照组，模型对照组的肌酐水平显著升高，两者差异具有统计学意义(P＜0.05)，王浆酸组、五味子提取物组的肌酐水平相比于正常对照组也有所升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，王浆酸+五味子提取物组与正常对照组的肌酐含量之间的差异不具有统计学意义(P＞0.05)。相比于模型组，各用药组小鼠的血液肌酐含量均显著下降，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。
表4.各组小鼠血液生化指标
以上结果表明，王浆酸和五味子提取物均具有治疗系统性红斑狼疮的功效，两者联合治疗效果更加突出，具有一定的协同作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.王浆酸在制备药物中的应用，所述的药物用于治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的腺苷脱氨酶活性升高的疾病为系统性红斑狼疮、白血病、伤寒、糖尿病、肝病、肿瘤、兴奋毒性神经紊乱、神经退行性疾病、心肌缺血或高血压。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的腺苷脱氨酶活性升高的疾病为系统性红斑狼疮。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物其活性成分包含王浆酸和五味子提取物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的五味子提取物制备方法为：取五味子中药材粉末，加入甲醇，密闭条件下超声提取，超声结束后，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液，氮吹干，得浸膏，即为所述的五味子提取物。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述的五味子提取物的制备方法具体为：取过40-70目筛的五味子中药材粉末，精密称定，加入甲醇，料液比为0.032-0.05g/ml；密闭条件下超声处理，功率240-260W，频率35-45kHz，时间为50-70min，放冷，用甲醇补足减失的重量，离心取上清液；氮吹干，得浸膏。
7.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包含药用辅料。
8.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物为胶囊剂、颗粒剂、片剂、丸剂或口服液。
9.权利要求4-8任一所述的药物组合物在制备治疗腺苷脱氨酶活性升高的疾病药中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的腺苷脱氨酶活性升高的疾病为系统性红斑狼疮。
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