CN108239096A

CN108239096A - 一类杭白菊提取的化合物、其药物组合物及其在防治神经退行性疾病中的应用

Info

Publication number: CN108239096A
Application number: CN201611204095.4A
Authority: CN
Inventors: 张培成; 王晓良; 杨鹏飞; 彭英; 杨桠楠; 王珊; 冯子明; 姜建双
Original assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Current assignee: Institute of Materia Medica of CAMS
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2018-07-03
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN108239096B

Abstract

本发明涉及一类杭白菊中结构新颖的化合物及其制备方法以及该类化合物在制备预防和治疗神经退行性疾病药物中的应用，尤其是帕金森和阿尔兹海默症中的应用。经药理学试验证明，该类化合物能够有效抑制过氧化氢诱导的神经元损伤，同时具有较强的DPPH自由基清除能力，具有良好的抗帕金森和阿尔兹海默症作用，可以用于制备成防治帕金森和阿尔兹海默症的药物。

Description

一类杭白菊提取的化合物、其药物组合物及其在防治神经退行性疾病中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一类从中药杭白菊中分离得到的杭白菊化合物及其在防治神经退行性疾病中的应用。

背景技术

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常见的以运动功能紊乱为特征的神经系统退行性疾病，65岁以上人群的发病率为1％，我国大约有170万帕金森氏病患者。该病的发病率随着年龄的急剧上升，人口老龄化的加剧，发病人数还将呈现出逐年上升的趋势。PD严重危害着人类的健康，不仅给患者带来巨大的痛苦，而且给家庭和社会造成沉重的负担。目前对该病尚无有效的治疗方法，临床常用的左旋多巴替代疗法仅能够维持5年左右，随着疾病的进展，左旋多巴的药效逐渐减弱，并出现严重的毒副作用。因此探寻新的有效治疗方案迫在眉睫。

目前对于PD的病因及发病机制尚未完全明了；既往认为与遗传因素、环境因素、衰老、氧化应激、线粒体功能衰竭、钙超载等有关，是多种因素协同作用的结果；近来神经免疫炎症机制在PD中的作用受到普遍关注。已有大量研究发现，线粒体呼吸链复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮的摄入，可导致选择性的黑质纹状体神经退行性疾病和胞浆内突触核蛋白免疫阳性包涵体的出现，即产生明显的PD病理症状。另外，目前越来越多的证据表明，神经炎症、小胶质细胞的激活与帕金森病密切相关。小胶质细胞是中枢神经系统中的主要吞噬细胞，是神经炎症的主要参与者。在健康的脑中，静息状态的小胶质细胞发挥正常吞噬功能；当小胶质细胞被中度激活时，它能清除过多的神经毒素、死亡细胞及细胞碎片，维持中枢神经系统的稳态；当小胶质细胞被持续激活时，它可与MCP-1等化学因子结合，继而与神经元结合，在中枢神经系统的变性疾病中发挥重要作用。鉴于此，许多学者认为：抑制鱼藤酮神经毒性以及调控小胶质细胞减轻神经元的损伤，均为抗PD新药研发的可行性方向。

PD的主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的退化、凋亡，为此恢复多巴胺能神经元的功能，促进多巴胺的分泌就成为PD治疗的关键。中药以其毒副作用小、疗效持久、整体调节和协同效果好等优势，已成为近年来防治PD新药的研究热点。尽管这些中药的疗效评估、机制探讨仍基于实验室研究阶段，临床研究尚未提供确定性的结论，但大量的数据已奠定了一定的理论基础，为进一步遴选抗PD新药夯实了基础。

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)是一种起病隐袭的进行性发展的神经系统退行性疾病，具有年龄相关性，严重影响老年人的生活质量，俗称老年痴呆。主要表现为渐进性记忆障碍，认知功能障碍，人格改变以及语言障碍等神经精神症状。近年来，关于AD发生机制的研究突飞猛进，其发病机制复杂多样，由多种因素共同作用导致。常见的因素有β-淀粉样蛋白异常沉积，Tau蛋白过度磷酸化，氧化应激，炎性反应等。其中氧化应激与AD，PD，肌萎缩侧索硬化症等多种神经变性疾病的发病密切相关，在阿尔茨海默病中的作用尤为明显。在氧化应激中，发挥主要作用的是过量的活性氧自由基和活性氮自由基。AD患者脑内可显示出过氧化表现，通过检测发现其脑中具有典型的氧化应激标记物，如在AD发病的早期，神经细胞内未形成NFTs时，即可观察到8-羟化脱氧鸟苷的增高，而8-羟化脱氧鸟苷是敏感的DNA氧化操作标志物，这说明氧化应激与AD有明确的相关性。也有研究表明氧化应激可以引起神经元内Aβ的沉积，当Aβ沉积到一定程度就可以以神经元产生损伤作用，并可引发进一步的氧化应激。另外，氧化应激也可以加快Tau蛋白的聚合。因此，抑制过氧化氢导致的神经元细胞损伤具有良好的防阿尔茨海默病的作用。

氧化应激是细胞氧化-抗氧化失衡而导致的应激损伤状态，是神经元损伤的机制之一。大量的研究显示氧化应激在阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森(Parkinson’s disease，PD)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(Amyotropic lateral sclerosis,ALS)、缺血性脑卒中等神经退行性疾病的发生中起着重要作用。在AD病人，氧化应激可引起DNA损伤、脂质过氧化和神经元死亡。因此，抑制氧化应激引起的神经元死亡是AD、PD、ALS和脑缺血等神经退行性疾病的有效治疗靶点。

杭白菊为菊科菊属植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序，亦名小汤黄、小白菊，与毫菊、滁菊、贡菊并称为中国驰名的四大名菊。它性微寒，味苦、甘，归肺、肝经，具有散风清热、平肝明目、清热解毒之功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒。杭白菊主产于浙江桐乡，是卫生部首批批准的药食同源的道地药材之一，也是浙江省传统中药材“浙八味”之一。现代药理学表明，杭白菊具有心血管保护，降血脂、降血压、降血糖，抗氧化，抗癌，神经保护，肝保护等作用。

申请者研究发现，从杭白菊中分离得到了一类结构新颖的化合物——Chrysanthemumic acid A～C，化学结构如下，经药理学实验证明该类化合物能够有效抑制过氧化氢导致的神经元细胞损伤，具有良好的防治帕金森和阿尔兹海默症作用，有效剂量可达10μmol/l。目前，尚未见有将中药杭白菊用于治疗帕金森和阿尔兹海默症的研究报道，也未见具有神经元细胞保护作用的杭白菊化合物单体的制备方法专利文献。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一类杭白菊化合物，及其制备方法和药物组合物和在制备或治疗神经退行性疾病药物中的应用。

为解决本发明的技术问题，本发明提供了如下技术方案：

本发明技术方案的第一方面是提供了一类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，该类化合物的结构如下：

上述的药学上可接受的盐选自化合物和无机酸、有机酸成的盐。所述的有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、辛酸、己二酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、苯乙酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸，所述的无机酸包括盐酸，磷酸，硫酸，氢溴酸。

其中化合物1-3分别是从杭白菊中分离提取得到的，本发明所述的Chrysanthemumic acid A为化合物1，Chrysanthemumic acid B为化合物2，Chrysanthemumic acid C为化合物3，三个化合物基本骨架结构新颖，未有文献和专利报道该类型化合物

本发明技术方案的第二方面是提供第一方面所述化合物的制备方法，其制备方法如下：杭白菊药材80％乙醇回流提取，浓缩后浸膏通过有机溶剂萃取、大孔吸附树脂层析、凝胶柱层析、反相硅胶柱层析及制备型HPLC分离纯化，得到上述化合物Chrysanthemumicacid A～C，经UV、IR、NMR、MS及CD等谱学手段分析鉴定其结构，为一类苯乙醇苷黄酮加合物，目前未有该类物质报道。

本发明技术方案的第三方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包括本发明第一方面所述化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。所述的药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液或混悬剂。

本发明技术方案的第四方面是提供本发明第一方面所述化合物在制备预防或/和治疗神经退行性疾病药物中的应用。所述的神经退行性疾病包括帕金森、阿尔兹海默症、脑卒中。所述的帕金森、阿尔兹海默症或脑卒中选自神经元损伤、神经炎症相关的帕金森、阿尔兹海默症或脑卒中。

有益技术效果：

1、本发明的一类杭白菊新化合物具有明显的防治神经退行性疾病的作用，尤其是帕金森和阿尔兹海默症作用，其一，对SH-SY5Y细胞过氧化氢损伤具有明显的保护作用；其二，具有较强的清除DPPH自由基的作用；其三，具有较强的总抗氧化能力。

2、本发明的一类杭白菊新化合物结构新颖，未有文献报道，具有进一步开发成防治帕金森和阿尔兹海默症药物的潜力。

具体实施方式

下面的实施例及药理活性实验用于进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例杭白菊单体化合物Chrysanthemumic acid A～C(化合物1-3)的制备及鉴定10kg杭白菊药材经70％乙醇回流提取3次，每次2小时，提取液浓缩后使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取3次，正丁醇部位回收溶剂，使用蒸馏水分散溶解，上清液通过D101型大孔吸附树脂，使用乙醇/水溶剂系统洗脱，收集70％乙醇洗脱部分，回收溶剂后经凝胶柱层析、反相硅胶柱层析反复纯化得到上述化合物Chrysanthemumic acid A(55mg)，Chrysanthemumic acid B(35mg)，Chrysanthemumic acid C(67mg)，经UV、IR、NMR、MS及CD等谱学手段分析鉴定其结构，为一类绿原酸类衍生物。

上述新化合物的波谱信息及核磁信号归属如下：

Chrysanthemumic acid A(1):White amorphous power；(c 0.09,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)331(3.89),293(3.79)nm；ECD(c 3.1×10^-4,MeOH)λ_max(Δε)214(29.0),249(-0.85),285(1.9),346(2.4)nm；IR(KBr)ν_max3390,1694,1631,1605,1523,1447,1375,1275,980,814cm^-1；¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ：2.20-2.23(2H,m,H₂-2),5.64(1H,m,H-3),5.01(1H,dd,J＝3.0,10.0Hz,H-4),4.32(1H,m,H-5),2.01-2.12(2H,m,H₂-6),7.06(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),6.79(1H,d,J＝8.0Hz,H-5'),6.97(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6'),7.60(1H,d,J＝16.0Hz,H-7'),6.27(1H,d,J＝16.0Hz,H-8'),6.61(1H,d,J＝2.0Hz,H-2”),6.60(1H,d,J＝8.0Hz,H-5”),6.49(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6”),3.69(1H,d,J＝7.5Hz,H-7”),3.19(1H,dd,J＝1.5,7.5Hz,H-8”),4.63(1H,m,H-10”),6.17(1H,dd,J＝1.0,10.0Hz,H-12”),6.81(1H,d,J＝10.0Hz,H-13”),3.66(1H,d,J＝12.5Hz,H_α-15”),3.76(1H,d,J＝12.5Hz,H_β-15”).¹³C NMR(CD₃OD,125MH_Z)δ：76.3(C-1),39.6(C-2),70.0(C-3),76.0(C-4),69.7(C-5),38.2(C-6),176.9(C-7),127.7(C-1'),115.2(C-2'),146.8(C-3'),149.7(C-4'),116.4(C-5'),123.2(C-6'),147.9(C-7'),114.6(C-8'),168.3(C-9'),127.7(C-1”),116.3(C-2”),146.1(C-3”),146.3(C-4”),116.3(C-5”),121.5(C-6”),53.4(C-7”),53.6(C-8”),172.8(C-9”),84.3(C-10”),196.7(C-11”),128.5(C-12”),155.2(C-13”),88.2(C-14”),63.9(C-15”).HRESIMS m/z 665.1477[M+Na]⁺(calcd.for 665.1477,C₃₁H₃₀NaO₁₅).

Chrysanthemumic acid B(2):White amorphous power；(c 0.1,MeOH),UV(MeOH)λ_max(logε)332(4.05),295(3.94)nm；ECD(c 3.1×10^-4,MeOH)λ_max(Δε)214(-35.0),250(1.5),299(-2.6),338(-2.9)；IR(KBr)ν_max3387,1694,1605,1523,1447,1270,1044,980,813cm^-1；¹H NMR(CD₃OD,500MH_Z)δ：2.17-2.23(2H,m,H₂-2),5.66(1H,m,H-3),4.86(1H,dd,J＝3.0,9.5Hz,H-4),4.29(1H,m,H-5),2.04-2.16(2H,m,H₂-6),7.07(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),6.80(1H,d,J＝8.0Hz,H-5'),6.97(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6'),7.58(1H,d,J＝16.0Hz,H-7'),6.25(1H,d,J＝16.0Hz,H-8'),6.58(1H,d,J＝2.0Hz,H-2”),6.57(1H,d,J＝8.0Hz,H-5”),6.45(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6”),3.59(1H,d,J＝7.5Hz,H-7”),3.22(1H,dd,J＝1.5,7.5Hz,H-8”),4.77(1H,m,H-10”),6.18(1H,dd,J＝1.0,10.0Hz,H-12”),6.79(1H,d,J＝10.0Hz,H-13”),3.58(1H,d,J＝12.5Hz,H_α-15”),3.73(1H,d,J＝12.5Hz,H_β-15”)；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ：76.4(C-1),39.5(C-2),69.8(C-3),76.6(C-4),69.5(C-5),38.1(C-6),175.5(C-7),127.7(C-1'),115.3(C-2'),146.8(C-3'), 149.7(C-4'),116.5(C-5'),123.3(C-6'),147.9(C-7'),114.7(C-8'),168.3(C-9'),127.8(C-1”),116.3(C-2”),146.1(C-3”),146.3(C-4”),116.2(C-5”),121.6(C-6”),53.9(C-7”),53.3(C-8”),173.0(C-9”),84.7(C-10”),196.7(C-11”),128.6(C-12”),155.3(C-13”),88.3(C-14”),64.0(C-15”)；HRESIMS m/z665.1477[M+Na]⁺(calcd.for 665.1477,C₃₁H₃₀NaO₁₅).

Chrysanthemumic acid C(3):White amorphous power；(C 0.08,MeOH),UV(MeOH)λ_max(logε)330(4.01),295(3.92)nm；ECD(c 2.1×10^-4,MeOH)λ_max(Δε)214(37.0),250(-1.3),285(2.1),348(3.0)nm；IR(KBr)ν_max3389,1692,1605,1523,1447,1379,1275,1122,1043,980,813cm^-1；¹H NMR(CD₃OD,500MHz)δ：2.04(1H,dd,J＝10.0,14.5Hz,H_α-2),2.10(1H,dd,J＝4.0,14.5Hz,H_β-2),4.22(1H,m,H-3),4.96(1H,dd,J＝3.0,8.5Hz,H-4),5.55(1H,m,H-5),1.99(1H,dd,J＝4.0,14.5Hz,H_α-6),2.26(1H,dd,J＝3.5,14.5Hz,H_β-6),7.05(1H,d,J＝2.0Hz,H-2'),6.79(1H,d,J＝8.0Hz,H-5'),6.95(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6'),7.48(1H,d,J＝16.0Hz,H-7'),6.14(1H,d,J＝16.0Hz,H-8'),6.65(1H,d,J＝2.0Hz,H-2”),6.61(1H,d,J＝8.0Hz,H-5”),6.53(1H,dd,J＝2.0,8.0Hz,H-6”),3.75(1H,d,J＝7.5Hz,H-7”),3.29(1H,dd,J＝1.5,7.5Hz,H-8”),4.83(1H,m,H-10”),6.19(1H,dd,J＝1.0,10.0Hz,H-12”),6.80(1H,d,J＝10.0Hz,H-13”),3.82(1H,d,J＝12.5Hz,H_α-15”),3.72(1H,d,J＝12.5Hz,H_β-15”)；¹³C NMR(CD₃OD,125MHz)δ：75.1(C-1),41.6(C-2),65.7(C-3),77.3(C-4),69.7(C-5),36.9(C-6),178.2(C-7),127.9(C-1'),115.3(C-2'),146.7(C-3'),149.3(C-4'),116.5(C-5'),123.2(C-6'),147.4(C-7'),115.2(C-8'),168.3(C-9'),128.0(C-1”),116.6(C-2”),146.0(C-3”),146.3(C-4”),116.3(C-5”),121.6(C-6”),53.6(C-7”),53.2(C-8”),173.5(C-9”),84.3(C-10”),196.9(C-11”),128.6(C-12”),155.6(C-13”),88.3(C-14”),63.9(C-15”).HRESIMS m/z 643.1657[M+H]⁺(calcd.for 643.1657,C₃₁H₃₁O₁₅).

药理实验

实验例1杭白菊化合物Chrysanthemumic acid A～C对SH-SY5Y细胞过氧化氢损伤的保护作用

SH-SY5Y细胞在含有10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青、链霉素的DMEM培养基于5％的CO₂，37℃培养箱中进行培养。待细胞80％融合后进行传代，以1×10⁴个/mL的密度，每孔100μL接种于96孔板,过夜。分别给予10μM的Chrysanthemumic acid A(1)、Chrysanthemumic acid B(2)、Chrysanthemumic acid C(3)处理，4h后更换为100μL含H₂O₂的新鲜溶液，继续孵育24h。之后每孔加入10μL MTT(5mg/mL)，继续孵育4h。采用翻转法将96孔板中的培养基弃去，每孔加入溶解液DMSO 150μL，37℃震荡15min使结晶充分溶解，在酶标仪上以570nm检测每孔的OD值，每组3个复孔，每个实验重复3次。

结果见表1。如表1，过氧化氢可明显减少SH-SY5Y细胞存活率，而10μM化合物Chrysanthemumic acid A～C对过氧化氢所导致的SH-SY5Y细胞损伤均有很好的改善作用，可改善70-90％，

表1：化合物1-3对SH-SY5Y细胞过氧化氢损伤的保护作用结果

实验例2杭白菊单体化合物Chrysanthemumic acid A～C(化合物1-3)清除DPPH自由基的能力

将10μL的2×10^-4M化合物样品加入96孔板中，再加入190μL的200μmol/L的DPPH的无水乙醇溶液，37℃避光反应30分钟，在517nm处测定吸光值。清除自由基能力用Sc(％)＝(1-A样/A对照)×100％。其中对照为不加样品的溶液在反应后的吸光度值。

如表2，化合物Chrysanthemumic acid A～C均具有较强的清除DPPH自由基的作用，其中化合物Chrysanthemumic acid A对自由基的清除能力强于阳性对照药Vitamin C.

表2：化合物清除DPPH自由基的能力结果

实验例3杭白菊单体化合物Chrysanthemumic acid A～C(化合物1-3)总抗氧化能力测定(ABTS法和FRAP法)

ABTS法：96孔板的每个检测孔中加入200μL ABTS工作液。空白对照孔中加入10μLDMSO溶液；把10mM Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM，标准曲线检测孔内加入10μL各种浓度的Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10μL浓度为1mM的各种样品。轻轻混匀。室温孵育2-6分钟后测定A734。如果测定A734有困难，也可以在725-745nm范围内进行测定。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力，用Trolox Equivalent AntioxidantCapacity(TEAC)来表示，即相同浓度情况下，其它物质的抗氧化能力和Trolox相比的倍数。

FRAP：96孔板的每个检测孔中加入180μL FRAP工作液。空白对照孔中加入5μLDMSO溶液；把10mM Trolox标准溶液稀释成0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mM，标准曲线检测孔内加入10微升各种浓度的Trolox标准溶液；样品检测孔内加入10μL浓度为1mM的各种样品。轻轻混匀。37℃孵育3-5分钟后测定A593。如果测定A593有困难，也可以在585-605nm范围内进行测定。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力，用Trolox EquivalentAntioxidant Capacity(TEAC)来表示，即相同浓度情况下，其它物质的抗氧化能力和Trolox相比的倍数。

如表3，FRAP法中，Chrysanthemumic acid A～C的抗氧化能力均强于阳性对照Trolox，而ABTS法中，仅有Chrysanthemumic acid B抗氧化能力强于阳性对照Trolox。

表3：化合物的总抗氧化能力检测(ABTS法和FRAP法)结果

由实施例1-3中结果可知，在SH-SY5Y细胞过氧化氢损伤模型中，Chrysanthemumicacid A～C均表现出较强的保护作用。对于DPPH自由基清除实验，Chrysanthemumic acid A的自由基清除能力强于阳性对照Vitamin C。对于总抗氧化能力检测，FRAP法中，Chrysanthemumic acid A～C的抗氧化能力均强于阳性对照Trolox，而ABTS法中，Chrysanthemumic acid B抗氧化能力强于阳性对照Trolox。上述结果提示Chrysanthemumic acid A～C均有较强的抗氧化能力，有潜力开发成为治疗氧化损伤引起的相关疾病，如脑缺血、阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症等神经退行性疾病。

Claims

1.一类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，该类化合物的结构如下：

2.根据权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的药学上可接受的盐选自化合物和无机酸、有机酸成的盐。

3.根据权利要求2的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的有机酸包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、辛酸、己二酸、乙二酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、酒石酸、苯甲酸、苯乙酸、邻苯二甲酸、对苯二甲酸，所述的无机酸包括盐酸，磷酸，硫酸，氢溴酸。

4.权利要求1的化合物的制备方法，其特征在于，所述的制备方法如下：杭白菊药材80％乙醇回流提取，浓缩后浸膏通过有机溶剂萃取、大孔吸附树脂层析、凝胶柱层析、反相硅胶柱层析及制备型HPLC分离纯化，得到化合物1-3。

5.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括权利要求1-3任一项的化合物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体或赋形剂。

6.根据权利要求5的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、口服液或混悬剂。

7.权利要求1-3任一项所述的化合物在制备预防或/和治疗神经退行性疾病药物中的应用。

8.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述的神经退行性疾病包括帕金森、阿尔兹海默症、脑卒中。

9.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的帕金森、阿尔兹海默症或脑卒中选自神经元损伤、神经炎症相关的帕金森、阿尔兹海默症或脑卒中。