CN108208149B - 多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用，所述多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用。水果为水蜜桃、苹果、葡萄、石榴、杏或草莓。如上述的多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法，具体步骤如下：（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为1 mM‑10 mM的氨基胍盐酸盐水溶液；（2）在果实转色开始时喷施步骤（1）中的氨基胍盐酸盐水溶液，喷施方法为采用步骤（1）配制的溶液每隔4‑7天喷施一次，共喷施3‑5次。本发明通过抑制果实成熟过程中多胺分解代谢，利用果实自身多胺抑制乙烯合成，延缓果实成熟软化，延长贮藏保鲜时间，效果较好，且使用成本低。
Description
技术领域
本发明属于农产品贮藏与保鲜技术领域，具体涉及一种多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用及其使用方法。
背景技术
随着生活水平的提高，人们对各种水果的需求越来越旺盛。然而较多种类的水果比如桃、荔枝、葡萄、樱桃、草莓等虽然美味可口，但却非常不耐贮藏。因此人们开发了多种用于水果贮藏保鲜的化学保鲜剂。目前市场上使用最普遍的为乙烯受体抑制剂1-甲基环丙烯（1-MCP）。虽然1-MCP使用简单高效，但是需要密闭空间熏蒸处理，而且其对非呼吸跃变型果实保鲜效果并不明显。
目前有较多研究报道多胺处理在水果贮藏保鲜中的应用。马岳岳等（2017）报道了采后外源多胺处理对杏果黑斑病的控制效果及对贮藏品质的影响，结果显示采后多胺处理能显著抑制果实对黑斑病的扩展,有效提高果实的抗病性。多胺处理葡萄可以提高果实抗氧化能力、保持果实硬度和减少鲜重损失等从而延长贮藏时间及货架期（Harindra Champaet al., 2015; Mirdehghan et al., 2016）。但是，多胺价格比较昂贵，使用成本高。众多研究表明在果实发育初期多胺含量较高，而果实成熟过程中多胺含量逐渐降低（Malik etal., 2004;Agudelo-Romero et al., 2013）。因此本发明考虑从抑制果实多胺分解的角度实现延缓果实成熟软化、延长货架期的目的。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足之处，提供一种多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用及其使用方法，适用于水蜜桃、苹果、葡萄、石榴、草莓等水果的保鲜，采前使用氨基胍处理，可以明显延缓果实成熟软化，保持果实硬度。
本发明的目的是以下述方式实现的：
多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用，所述多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用。
所述水果为水蜜桃、苹果、葡萄、石榴、杏或草莓。
如上述的多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为1 mM-10 mM的氨基胍盐酸盐水溶液；
（2）在果实转色开始时喷施步骤（1）中的氨基胍盐酸盐水溶液，喷施方法为采用步骤（1）配制的溶液每隔4-7天喷施一次，共喷施3-5次。
步骤（1）中的氨基胍盐酸盐水溶液还添加有吐温20。
所述吐温20的浓度为0.4 mM-0.6 mM。
步骤（2）中喷施氨基胍盐酸盐溶液时要在清晨或者傍晚喷施，雨天不要喷施。
目前主要有乙烯信号抑制剂1-MCP和多胺和处理用于果蔬贮藏保鲜。
（1） 1-MCP 目前是市场上使用较多的保鲜剂， 但是其对呼吸跃变型果实效果较好， 而对于非呼吸跃变型果实效果不明显。
（2） 多胺处理用于果蔬采后贮藏保鲜的研究很多，对呼吸跃变型果实（桃，香蕉等） 和非呼吸跃变型果实（如草莓，葡萄等）贮藏保鲜效果较好，但是其使用成本高昂，目前理论研究较多，大范围使用较少。
本发明通过抑制果实成熟过程中多胺分解代谢，利用果实自身多胺抑制乙烯合成，延缓果实成熟软化，延长贮藏保鲜时间，效果较好，且使用成本低。
附图说明
图1是黄水蜜桃果实生长曲线。
图2是不同发育时期乙烯释放量测定，每个时期的柱状图由左至右依次为：Control、Spd、AG1、AG2和AG3；Control为吐温20水溶液的空白对照，Spd为亚精胺水溶液的正对照，AG1为浓度为1 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组，AG2为浓度为5 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组，AG3为浓度为10 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组。
图3是亚精胺和氨基胍处理下果实可溶性固形物含量变化，每个时期的柱状图由左至右依次为：Control、Spd、AG1、AG2和AG3；Control为吐温20水溶液的空白对照，Spd为亚精胺水溶液的正对照，AG1为浓度为1 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组，AG2为浓度为5mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组，AG3为浓度为10 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组。
图4是亚精胺和氨基胍处理下果实硬度变化，每个时期的柱状图由左至右依次为：Control、Spd、AG1、AG2和AG3；Control为吐温20水溶液的空白对照，Spd为亚精胺水溶液的正对照，AG1为浓度为1 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组，AG2为浓度为5 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组，AG3为浓度为10 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组。
图5是亚精胺和氨基胍处理下果实多胺含量变化，每个时期的柱状图由左至右依次为：Control、Spd和AG2；Control为吐温20水溶液的空白对照，Spd为亚精胺水溶液的正对照，AG2为浓度为5 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组。
图6是亚精胺和氨基胍处理下PpPAO1基因表达分析，每个时期的柱状图由左至右依次为：Control、Spd和AG2；Control为吐温20水溶液的空白对照，Spd为亚精胺水溶液的正对照，AG2为浓度为5 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组。
图7是亚精胺和氨基胍处理下桃果实生长素含量测定，三条折线由下到上依次为：Control、AG2和Spd；Control为吐温20水溶液的空白对照，Spd为亚精胺水溶液的正对照，AG2为浓度为5 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组。
图8是亚精胺和氨基胍处理下桃果实相关基因表达分析，每个时期的柱状图由左至右依次为：Control、Spd和AG2；Control为吐温20水溶液的空白对照，Spd为亚精胺水溶液的正对照，AG2为浓度为5 mM的氨基胍盐酸盐水溶液的实验组。
具体实施方式
mM是指毫摩尔每升。苹果、草莓为单S型果实，水蜜桃、葡萄、石榴为双S型果实，单S型果实（苹果、草莓）在成熟开始时喷施，双S型果实（水蜜桃、葡萄、石榴、杏）在第二次膨大期前喷施。
多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用，所述多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用。
所述水果为水蜜桃、苹果、葡萄、石榴、草莓或杏。
如上述的多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为1 mM-10 mM的氨基胍盐酸盐水溶液；
（2）在果实转色开始时喷施步骤（1）中的氨基胍盐酸盐水溶液，喷施方法为采用步骤（1）配制的溶液每隔4-7天喷施一次，共喷施3-5次。
步骤（1）中的氨基胍盐酸盐水溶液还添加有吐温20。
所述吐温20的浓度为0.4 mM-0.6 mM。
步骤（2）中喷施氨基胍盐酸盐溶液时要在清晨或者傍晚喷施，雨天不要喷施。
实施例1：
多胺分解抑制剂氨基胍在葡萄保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为3mM的氨基胍盐酸盐水溶液，并加入0.45mM的吐温20；
（2）在葡萄开始时，采用步骤（1）配制的溶液每隔5天喷施一次，共喷施3次。要在清晨或者傍晚喷施，雨天不要喷施。
实施例2：
多胺分解抑制剂氨基胍在石榴保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为5 mM的氨基胍盐酸盐水溶液，并加入0.5mM的吐温20；
（2）在石榴转色开始时，采用步骤（1）配制的溶液每隔6天喷施一次，共喷施4次。要在清晨或者傍晚喷施，雨天不要喷施。
实施例3：
多胺分解抑制剂氨基胍在苹果保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为7mM的氨基胍盐酸盐水溶液，并加入0.55mM的吐温20；
（2）在苹果转色开始时，采用步骤（1）配制的溶液每隔7天喷施一次，共喷施3次。要在清晨喷施，雨天不要喷施。
实施例4：
多胺分解抑制剂氨基胍在草莓保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为9mM的氨基胍盐酸盐水溶液，并加入0.4 mM的吐温20；
（2）在草莓转色开始时，采用步骤（1）配制的溶液每隔4天喷施一次，共喷施3次。要在傍晚喷施，雨天不要喷施。
实施例5：
多胺分解抑制剂氨基胍在水蜜桃保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为10mM的氨基胍盐酸盐水溶液，并加入0.6mM的吐温20；
（2）在水蜜桃采收前30天，即转色开始时，采用步骤（1）配制的溶液每隔7天喷施一次，共喷施4次。要在清晨喷施，雨天不要喷施。
实施例6：
多胺分解抑制剂氨基胍在杏保鲜中的使用方法，具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为1mM的氨基胍盐酸盐水溶液，并加入0.58mM的吐温20；
（2）在杏转色开始时，采用步骤（1）配制的溶液每隔5天喷施一次，共喷施5次。要在傍晚喷施，雨天不要喷施。
1. 桃果实生长曲线绘制
实验以5年生黄水蜜品种桃为试材，在其花后10天开始测定果实直径变化，每隔7天测定一次，直至果实采收，每次测定200个果实，并求出平均值。然后根据上述数据绘制桃果实生长曲线，同时计算果实直径增长曲线的二阶导数，即斜率。果实生长曲线和直径增长斜率见图1。其中S3时期后期果实开始着色逐渐成熟。S4时期果实已经成熟。由图可见黄水蜜桃果实生长呈现典型的双S曲线。
2. 多胺和氨基胍处理
2.1溶液配制
配制浓度梯度分别为1 mM、5 mM和10 mM（对应为AG1、AG2和AG3）的氨基胍溶液。具体方法为先将2.211 g氨基胍盐酸盐溶解于20 mL清水，配制成1M浓度的母液。随后分别在1L清水里加入1 mL、5 mL和10 mL的基胍盐酸盐母液，配制成1 mM、5 mM和10 mM的氨基胍盐酸盐溶液。同时配制浓度为2 mM亚精胺溶液作为正对照（Spd），具体配制方法为1 g亚精胺溶解于2 mL清水，配制成3.4425 M的母液，随后在1 L清水中加入0.25 mL亚精胺母液混匀即。为增加溶液附着性，1 L上述溶液中分别加入0.5 mL吐温20。采用清水并加入同样浓度的吐温20作空白对照（Control）。
2.2喷施处理
实验设置3次生物学重复，每个重复3株，为一个小区，小区随机排列。选取长势一致，且位置相同的果实进行处理，每个处理100个果实。在果实第二次膨大期开始时（S3时期），即成熟前30天开始喷施，采用上述溶液每隔7天喷施1次，共喷施4次。注意在清晨或者旁晚喷施，避免雨天喷施。
2.3指标测定
测定不同时期对照和处理下果实乙烯释放量，测定结果如图2所示。果实乙烯释放量测定采用岛津2010plus气相色谱仪。具体测定方法如下：桃成熟后采收并密封在体积为1L的密闭样品瓶内，环境温度约为20℃。密闭1小时后，用气密性气体进样针从样品瓶内取1mL气体从手动进样口进样分析。样品乙烯释放速率的分析使用气相色谱仪（GC；GC2010PLUS，Shimadzu, Japan）分析，检测器为氢火焰检测器（flame ionization detector，FID），色谱柱为GDX-502型填充色谱柱（兰化所），进样口（WBI）温度110℃，色谱柱温度60℃，检测器（FID）温度150℃，载气为氮气，载气流速40 mL/min。
由图2可见果实发育S3时期，处理和对照桃果实乙烯释放均处于极低水平，释放量小于0.01 μL.h-1Kg.FW-1，并且处理和对照以及不同处理之间并没有明显差别。说明此时桃果实还没有达到呼吸跃变。而在S3/S4时期，相较于S3时期桃乙烯释放量显著上升，上升幅度超过S3时期水平的200倍。说明此时果实已经开始进行呼吸跃变，开始成熟。但Spd和AG2处理下乙烯释放量仍显著低于对照和AG1处理，仅为对照水平的1/2。而对照、AG1和AG3处理乙烯释放量无明显区别。而在S4时期，对照果实乙烯释放量进一步显著升高，上升幅度超过S3时期的800倍，乙烯释放量接近8 μL.h-1Kg.FW-1。而Spd和AG处理下果实乙烯释放量仍显著低于对照水平。其中Spd处理下果实乙烯释放量仅为对照水平的1/10。而AG1和AG2处理果实乙烯释放量仅为对照水平的1/2和1/3，AG3处理下虽然乙烯释放量也显著低于对照，但效果远低于AG1和AG2处理。上述结果充分说明采用AG处理均能显著抑制桃乙烯合成，且AG2处理效果最好。
果实采收后当天观察果实成熟度表型，并测定果实硬度，可溶性固形物含量、乙烯释放量等生理指标。果实硬度测定采用兰泰FHT-05硬度计，可溶性固形物测定采用ATAGOPAL-1糖度计。同时在常温放置3天和7天后分别测定对照和处理条件下果实硬度变化。在采收当天和分别常温放置3天和7天后测定果实可溶性固形物含量，结果如图3。由图可见对照和处理果实在采收当天和放置3天、7天后可溶性固形物含量无明显变化，并且区明显区别，说明Spd和AG处理对桃果实可溶性固形物含量无显著影响。同样测定了不同处理下果实硬度变化（图4）。如图4可见，采收当天Spd和AG处理桃果实硬度显著高于对照。常温放置3天后，对照果实硬度明显降低，仅为0天硬度水平的60%。而Spd和AG处理桃果实硬度无明显变化。常温放置7天后，对照和处理果实硬度均有明显降低，其中对照果实硬度降到仅为0天硬度水平的1/5，而Spd和AG处理果实硬度虽有明显降低，但仍为0天果实硬度水平的1/2左右，且显著高于对照水平。由此可见Spd和AG处理均可明显延缓桃果实成熟，抑制乙烯合成，延缓常温下果实软化，保持果实较高硬度1周左右，并且AG2处理效果好于AG1。
2.4多胺、生长素含量测定及相关基因表达分析
为了进一步分析多胺和AG处理延缓果实成熟软化和乙烯合成的机理，对多胺含量、生长素含量、多胺分解代谢、乙烯合成、生长素合成和细胞壁降解相关基因表达进行分析。多胺提取方法参照Flores和Galston（1982），具体参见下段内容。含量测定采用Waterse2695高效液相色谱仪，具体洗脱程序见表1。选取AG处理中效果最好的AG2、Spd处理和对照进行生理数据测定和基因表达分析。首先测定了不同处理下自由态多胺包括腐胺（putrescine）、亚精胺(spermidine)和精胺(spermine)含量变化（图5）。由图5A可见在Spd和AG处理下，桃腐胺含量在不同时期均显著高于对照。而亚精胺和精胺含量同样显著高于对照（图5B、5C）。说明AG处理显著抑制了多胺分解，使桃成熟过程中多胺保持在较高水平。信息学比对分析发现桃基因组中有4个多胺氧化酶基因（PpPAO1-PpPAO4），其中PpPAO1基因为多胺分解代谢的关键基因，分析其基因表达变化发现该基因表达在果实成熟过程中明显升高，而Spd和AG处理下该基因表达虽有升高，但依然显著低于对照水平（图6），说明Spd和AG处理能够通过抑制多胺分解代谢关键基因PpPAO1表达水平从而抑制多胺分解。
多胺提取方法：（1）取0.3 g组织用液氮迅速磨成粉末，转移至2 mL离心管，加入1mL预冷的5%高氯酸（0.05 g/100 mL比例加入二硫苏糖醇，DTT），充分涡旋后于冰上浸提1h，注意避光。（2）4℃，12000 r/min离心15 min，取1 mL上清液于新的2 mL离心管，沉淀再加入1 mL 5%高氯酸，充分涡旋后于冰上浸提1 h。（3）4℃，12000 r/min离心15 min，取1 mL上清液与上次取出的上清液混合，4℃，12000 r/min离心5 min充分混匀。（4）吸取1 mL上清液加入10 mL离心管，然后在通风厨依次加入50 μL 1 M的1,6-己二胺（内标），1 mL 2 M的NaOH，10 μL苯甲酰氯。涡旋30 sec后于37℃水浴20 min。（5）水浴结束后加入2 mL饱和NaCl溶液，2 mL乙醚，混匀，8000 r/min离心5 min。（6）取1 mL乙醚相于新的1.5 mL离心管，于真空浓缩仪干燥30 min。干燥后加入500 μL色谱级甲醇（Fisher，美国）溶解，采用0.22 μm有机滤膜过滤，然后上样检测。
由于生长素含量与果实成熟密切相关，因此测定了Spd和AG处理下桃果实生长素含量（图7）。生长素由南京中鼎生物有限公司采用安捷伦1290高效液相色谱仪串联AB公司Qtrap6500质谱仪负责测定。由图7可见在S3-S4时期中，桃果实生长素含量呈现明显的上升趋势。具体来说，S3-S3/S4时期，生长素明显上升，而S3/S4-S4时期逐渐下降，但依然高于S3时期水平。Spd处理后果实在S3/S4和S4时期，生长素含量升高最为明显，且显著高于对照水平，而AG处理下虽然生长素水平低于Spd处理但依然显著高于对照水平。说明Spd和AG处理促进了桃果实生长素积累。
随后利用qRT-PCR技术分析了生长素合成关键基因PpYUUC10，乙烯合成关键基因PpACO和细胞壁降解关键酶多聚半乳糖醛酸酶基因PpPG的表达水平。所述Prupe.6G157500.1 CDS PpYUCCA10基因序列见SEQ ID NO 1，Prupe.6G006000.1 CDSPpACO基因序列见SEQ ID NO 2，Prupe.4G261800.1 CDSPpPG 基因序列见SEQ ID NO 3。qRT-PCR采用ABI 7500实时荧光定量仪。基因表达分析结果见图8。结果显示在桃成熟过程中生长素合成关键基因PpYUUC10表达水平显著升高，而Spd和AG处理下该基因表达水平在S3/S4时期显著高于对照水平，尤其是Spd处理下该基因表达水平最高（图8A）。在S4时期，对照和AG处理下PpYUUC10表达水平进一步升高，而Spd处理下PpYUUC10表达水平虽有所降低，但依然保持较高水平，该结果与图7生长素含量相一致。说明Spd和AG处理抑制了PpYUUC10表达水平。
乙烯合成关键基因PpACO表达分析结果显示桃成熟过程中该基因表达水平逐渐升高，与乙烯释放量逐渐升高的结果相一致，其中S3/S4时期Spd和AG处理下该基因表达水平略高于对照水平（图8B）。在S4时期，Spd和AG处理下PpACO基因表达水平显著低于对照，与该时期乙烯释放量相一致（图8B）。说明Spd和AG处理显著抑制了PpACO的表达水平。
为了解析果实硬度变化的原因，分析了细胞壁降解酶多聚半乳糖醛酸酶基因PpPG的表达水平（图8C）。在S3/S4时期，PpPG的表达水平显著升高，其中Spd和AG处理下该基因表达水平显著低于对照水平，仅为对照水平的1/5。而在S4时期该基因表达水平又显著降低，其中Spd和AG处理下该基因表达水平略高于对照。说明Spd和AG处理显著抑制了PpPG的表达水平。
本发明的目的是通过抑制果实成熟过程中自身多胺分解代谢，使果实维持较高多胺含量，达到抑制乙烯合成，延缓果实成熟软化，保持果实硬度和品质，延长贮藏保鲜时间和货架期的目的。本发明应用于农产品贮藏与保鲜领域。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，还可以作出若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南农业大学
<120> 多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的应用及其使用方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 675
<212> DNA
<213> 水蜜桃种
<400> 1
atggcggagg aggtgattct gatcatggag gatgagaata ataacaataa tagtaatagt 60
aataataata ttagtgtgtc ggtggtgata gtaggagctg gtccttctgg cattgctacc 120
tccgccttgc tcaattctct gtcagtttca aatcttgtgc ttgagaagga agactgttgt 180
gggtccctct ggaagaagcg gtcctacgac cgtctgaatc ttcacttggc aaagagcttc 240
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ttcattcgtt acctggacga gtacgtggcc aggttcaacg tgaaccctcg ctactgcaat 360
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Claims (5)
1.一种多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）利用氨基胍盐酸盐和水配制浓度为1 mM-10 mM的氨基胍盐酸盐水溶液；
（2）在果实转色开始时喷施步骤（1）中的氨基胍盐酸盐水溶液，喷施方法为采用步骤（1）配制的溶液每隔4-7天喷施一次，共喷施3-5次。
2.根据权利要求1所述的一种多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法：其特征在于：步骤（1）中的氨基胍盐酸盐水溶液还添加有吐温20。
3.根据权利要求2所述的一种多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法：其特征在于：所述吐温20的浓度为0.4 mM-0.6 mM。
4.根据权利要求1所述的一种多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法：其特征在于：步骤（2）中喷施氨基胍盐酸盐溶液时要在清晨或者傍晚喷施，雨天不要喷施。
5.根据权利要求1所述的一种多胺分解抑制剂氨基胍在水果保鲜中的使用方法，其特征在于：所述水果为水蜜桃、苹果、葡萄、石榴、杏或草莓。
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