CN108192830A - 一种能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株s2-16及其应用 - Google Patents

一种能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株s2-16及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一株能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2‑16及其应用。一株能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2‑16，其分类学命名为Colletotrichum acutatum S2‑16，于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017789。本发明的菌株S2‑16的粗提物能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，能够抗氧化清除自由基，DPPH清除率达到77.7％。

Description

一种能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16及其应用
技术领域
本发明属于微生物应用技术领域，尤其涉及一种能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16及其应用。
背景技术
绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)是植物体有氧呼吸过程中经过莽草酸及苯丙氨酸途径产生的重要的次生代谢物，广泛存在于高等双子叶植物和蕨类植物中。它是由咖啡酸(Caffeic acid)和奎宁酸(Quinic acid)脱水缩合成3-O- 咖啡酰奎宁酸(3-O-caffeoylquinic acid)，分子式为C6H18O9，属于多酚有机酸。绿原酸的药效功能突出，主要涉及抗氧化清除自由基，显著提高谷胱甘肽还原酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性；抑菌、抗肿瘤，明显抑制肿瘤细胞(MCF-7)增殖，细胞停滞于G0/G1期。此外，绿原酸还是一种新型高效抗氧化剂，且抗氧化稳定性强、增香保色效果明显。因此，在食品行业中已部分取代了人工合成的抗氧化剂及防腐剂。由于绿原酸具有光化学活性，易发生光降解反应，紫外吸收能力强，较多应用在化妆品防晒领域。
其中，绿原酸对多种微生物都有明显的抑制或杀灭作用，是多种抗菌药物的重要组成成分，如绿原酸对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有抗菌活性。 Feng Yan等人考察了绿原酸在体内、体外的抗氧化作用，结果表明绿原酸对 D－半乳糖(D-galactosee)所诱导的慢性肝、肾损伤有保护作用，这种保护作用是由于其具有抗氧化和抗炎活性；研究表明，绿原酸类化合物对多种病毒具有抑制或杀死作用；此外，通过病毒、细胞和动物实验发现二咖啡酰奎尼酸及咖啡酰奎尼酸衍生物对乙型肝炎病毒及逆转录病毒抗原的表达、DNA的复制有良好的抑制作用，从而有望开发成治疗乙型肝炎及逆转录病毒等相关疾病的药物。鉴于绿原酸类物质具有较好的疗效性及应用性。
绿原酸类物质具有较强的抗氧化性，其含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，可以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，保护组织免受氧化作用的损伤，还可以有效地抑制脂质过氧化，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用。国内外研究表明，绿原酸是一种有效新型天然酸性抗氧化剂，具有较强的抗氧化能力，对超氧化物歧化酶和过氧化氨酶的酶活水平产生一定的影响，并且其抗氧化能力远远强于对羟基苯甲酸、咖啡酸、阿魏酸、丁香酸、生育酚等。
鉴于绿原酸在医药保健、食品保鲜、日用化工等方面具有的广泛应用价值，市场对于绿原酸的需求量越来越大，而目前主要从杜仲、金银花等药用植物中提取获得。由于植物中绿原酸含量受植物种类、组织、生产季节、外界环境等条件的影响。所以，绿原酸的生产受到限制性因素较多，产量不稳定。因此，利用药用植物-微生物之间的互作关系，筛选微生物用于次生代谢产物绿原酸的生产及其重要。
基于这几点，本发明利用特殊的筛选方法筛选到一株产绿原酸的菌株 S2-16，利用液质联用仪(LC-MS)准确定量，通过抑菌及抗氧化实验证明其效果显著。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一株能生长分泌次生代谢物－绿原酸的菌株 S2-16及其应用，该菌株的粗提物在抗氧化及抑菌方面效果较好。
本发明提供的技术方案如下：
一株能生长分泌次生代谢物－绿原酸的菌株S2-16，其分类学命名为尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum S2-16，于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017789。
本发明的菌株S2-16能够分泌产生次生代谢物-绿原酸(Chlorogenic acid，CGA)，可以将NH4Cl2作为氮源进行生长，同时将其分解，并提高绿原酸产量。
本发明的菌株S2-16的粗提物能够抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，该菌株的粗提物能够抗氧化清除自由基。
本发明还提供了所述的尖孢炭疽菌S2-16的粗提物在产生次生代谢物中的应用。
本发明还提供了所述的尖孢炭疽菌S2-16的粗提物在抑菌及抗氧化中的应用。
本发明还提供了所述的尖孢炭疽菌S2-16的粗提物在制备抑菌制剂中的应用。
本发明还提供了所述的尖孢炭疽菌S2-16的粗提物在制备抗氧化制剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的菌株S2-16是从广西药用植物园采集植物样本－山茶花中进行筛选分离，得到具有生产次生代谢物的微生物，检测结果表明该菌是一株能够分泌产生次生代谢物－绿原酸的植物内生菌，分类命名为尖孢炭疽菌Colletotrichum acutatum S2-16。
(2)本发明的尖孢炭疽菌S2-16产生的次生代谢物-绿原酸，其粗提物的抑菌效果显著，基本符合文献中对绿原酸的研究结果。
(3)本发明提供的尖孢炭疽菌S2-16，后期研究过程中利用发酵手段扩大培养提高绿原酸产量，并将其应用到抑菌剂或抗氧化剂等方向。
附图说明
图1为尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)在含[Al3+]＝0.75 mmol/L的PDA固态培养基上的菌落形态；
图2为尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的显微镜观察；
图3为尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的电泳图；
图4为尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的薄层色谱(TLC) 分析；
图5为绿原酸标准品与S2-16的高效液相色谱(HPLC)分析；
图6为绿原酸(CGA)的二级质谱图(MS/MS spectras)；
图7为绿原酸标准品与S2-16的液质联用色谱(UPLC-MS)分析；
图8为尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)抑菌圈；
图9为尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)抗氧化分析；
图10为绿原酸的标准曲线(HPLC)；
图11为绿原酸的标准曲线(UPLC)。
保藏信息说明
Colletotrichum acutatum S2-16，其保藏编号为CCTCC NO：M 2017789，保藏日期为2017年12月14日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(简称 CCTCC，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072)。
具体实施方式
以下实施例以便更好的理解本发明，并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的分离和鉴定
1、尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的分离
尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的分离包括取样，初筛和复筛三个步骤，具体如下：
1.1取样
为了分离产生绿原酸的菌株，在广西大学(N22°50'28.41"，E108°17'9.00") 和广西药用植物园(E108°19'，N22°51')收集新鲜植物叶片。将样品逐个装入样品袋中，于4℃冰箱保存。
1.2初筛
采用组织块法，取植物叶片用无菌水清洗，无菌滤纸擦拭干净于超净工作台中放置，在75％酒精中消毒60～90s数次，用无菌水冲洗多次，再在5％次氯酸钠溶液中表面消毒30s，消毒处理后的样品用无菌剪刀剪切至1×1cm 大小方块，将其分别接种到改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)的平板上 (参见表1)，于恒温培养箱中培养。培养期间，观察培养基颜色变化，如有菌落将培养基染成紫红色，则初步认为该菌株可能是产生绿原酸的菌株。
表1 培养基配制
选取将培养基染成紫红色的菌落，在改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基连续划线分离，传三代之后，再次在改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行三点培养，确定产绿原酸的稳定性，选取产绿原酸较为稳定的菌株，按1:1比例加入 50％甘油于-80℃保藏。
1.3复筛
将改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基初筛的各菌株用接种环分别接种到改良马铃薯葡萄糖水培养基中，28℃，140rpm，培养5d；再各取菌液1mL接种到装有100mL的改良马铃薯葡萄糖水培养基的三角瓶中，设置三个重复摇瓶，不接种任何菌设为对照，28℃，140rpm，培养5d；观察各菌株液体培养颜色变化，并取各菌株样品测定发酵液中绿原酸的含量，从中筛选出产绿原酸能力较强的菌株。
2、尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的鉴定
对上述分离纯化得到的纯培养菌株进行显微镜观察，描述其生物学形态。使用CWBIO NuClean PlantGen DNA试剂盒提取真菌DNA。
2.1该菌株在改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培养5d，菌株形态：圆形或近圆形、菌落边缘整齐、菌落正面白色，背面紫红色、菌落成绒毛状、表面呈放射状形态(图1)。显微镜观察，乳酸酚棉蓝染色后，孢子及菌丝体染成蓝色，且菌丝体呈现长杆状(图2)。
2.2利用引物ITS1和ITS4进行扩增18S rDNA，引物序列如下：
ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’；
ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
PCR扩增条件为94℃2min，94℃30s、55℃30s、72℃60s，30个循环，72℃2min。
对PCR扩增产物进行测序，测序结果如SEQ.ID.NO.1所示。S2-16菌株的18S rDNA序列的扩增长度为584bp(图3)，已提交GenBank数据库注册序列号(GenBank accessionno.MG553373)，经同源性比对，其与 Colletotrichum acutatum MAFF 306282(GenBankaccession no.AB042300.1)具有99％的高度相似性，结合S2-16菌株形态学和显微镜观察等特性，菌株鉴定为Colletotrichum acutatum菌属的一个菌株，即尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)，将其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 2017789。
实施例2：尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)产绿原酸的定性分析
1.1尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的浸提及薄层色谱 (TLC)的定性
选取菌株摇床发酵培养5d左右，调节发酵液的pH至4.0～5.0，以保持绿原酸的稳定性。首先，利用细胞破碎仪破碎细胞超声破碎30min，以释放细胞内容物；然后，离心取上清液1mL，按照1：1比例加入75％乙醇静置5h，用旋转蒸发仪45℃真空浓缩30min左右，以加快液质转化从而加快提取效率；最后，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，每次取乙酸乙酯层真空浓缩至几乎干，加入色谱甲醇完全溶解，用0.22μm有机滤膜过滤，除去样品中的不溶物制备成待测样品溶液。
将制备的待测样品溶液利用薄层层析法初步定性。取硅胶薄层板数块，贮于干燥器中备用；绿原酸分子中含有羧基和邻二酚羟基，具有强极酸性，调整展开剂配比，按照乙酸乙酯：水：甲酸：甲苯80:10:9:5比例配置好展开剂，倒入长方形层析缸中，盖好，来回振荡后放置于通风橱中，用微量注射器取1.0mg/mL绿原酸溶液和待测样品溶液3μL点样于同一硅胶薄层板上，将其放于层析缸中展开，若展开剂的前沿达到硅胶薄层板上沿约2cm时取出薄层板，自然晾干其表面的展开剂溶液，用显色剂(1％FeCl3:1％ K3[Fe(CN)6]1:1混合液)喷雾显色，至斑点清晰。观察出现的蓝色斑点(图4) 并进行测量和计算斑点的Rf值(表2)，用于定性分析。
表2 产绿原酸菌株发酵液的比移值Rf
1.2尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)粗提物的高效液相色谱(HPLC)准确定性
样品按照绿原酸浸提方法制备成待测样品溶液。
HPLC：色谱柱：Waters C18column(250mm×4.6mm，5μm)；流动相： 0.5％甲酸：乙腈(90：10，V/V)；流速：1.0mL/min；检测波长：327nm；柱温：35℃；进样量：10μL。按照以上方法进行HPLC测定，准确制作绿原酸标准品标准曲线(图10)，样品按照上述浸提方法浸提绿原酸，制备成待测样品溶液，进行高效液相色谱法测定(图5a)。
标准曲线的绘制，分别吸取1mg/mL的绿原酸标准溶液储藏液0、100、 200、400、500、600、800μL于2mL比色管中，分别加入NaOH调节pH，甲醇定容至1mL。静置5～10mim后，即得0，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6，0.8 μg/mL绿原酸标准溶液，与待测溶液同时在高效液相色谱仪测定峰面积，读出数值。以测得峰面积S为纵坐标，保留时间Time为横坐标，在Excel中绘制成标准曲线(图11)。
高效液相色谱法测定结果表明，绿原酸标准品保留时间为13.3761min，样品S2-16保留时间为13.2578min；样品保留时间与绿原酸标准品保留时间基本一致，故样品可能产生绿原酸。为避免高效液相色谱仪因环境、操作、流动相等因素产生较大误差及假阳性情况，本发明在样品测定结束，重新加标(加入一定量绿原酸标准品)测定，样品加标高效液相色谱总图(图5b)，进一步说明样品产生绿原酸，以便后续研究。
实施例3：尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)粗提物产绿原酸的定量分析
1.1尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的液质联用(UPLC－ MS)定性及定量
样品按照绿原酸浸提方法制备成待测样品溶液。
使用配备有二元溶剂输送系统，自动取样器和PDA检测器的Agilent Co 系统进行UPLC。在Agilent色谱柱(ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱； 2.1mm×50mm，1.8μm；AgilentCorporation，Santa Clara，California，United States)上进行色谱分析。流动相由(A)0.5％乙酸水溶液和(B)乙腈组成。如下优化UPLC洗脱条件：90％A和10％B(0～5min)，75％A和25％B(5～ 6min)，以及90％A和10％B(6～9min)；流速为0.3ml min-1；柱和自动采样器设置为25℃和1μL。UPLC/MS分析使用电喷雾电离源(ESI)进行。质谱校准和分辨率调整是在MS实验之前使用甲酸在UPLC上进行的。在分析中，锁定M S模式应用于实验，使用真正的CGA(353.08493)实时校准分子量。ESI在负离子模式下以4kV的喷雾电压运行。最佳的MS参数如下：毛细管电压4kV(ESI+)或3kV(ESI-)；喷嘴电压0V；喷雾电压4kV，采用氮气作为雾化气体，压力约为2.8×105Pa，氮气为去溶剂，鞘液流量为600L h-1，鞘液流量为12L min-1。脱溶剂气体被加热到300℃，鞘气的温度被设定为360℃。使用高纯度的氮作为碰撞气体。
采用MRM模型，UPLC-MS分析菌株S2-16的提取物。为了从菌株发酵的粗提取物中鉴定CGA，研究了CGA以确定MS/MS碎裂模式。由于产生了大量负性[M-H]-离子，在m/z352.98493处(理论值353.08493)检测到 CGA的母离子(图6)。根据建立的MRM模型，通过UPLC-MS测定CGA 的方法对S2-16粗提物进行定量分析(图7)。
UPLC-MS分析表明，CGA保留时间为1.71min(表3，图7)，并建立了CGA的标准曲线来计算样品中CGA的含量(图8)。S2-16粗提物的保留时间几乎接近于CGA标准品的保留时间，且S2-16粗提物的产量为23.39 mg L-1(表3)。
表3 S2-16粗提物中绿原酸的产量
实施例4：尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)粗提物的抑菌作用
1.1待测材料灭菌
将实验用的培养皿、镊子、培养基、水、EP管及三角瓶等用保鲜膜包好，滤纸用打孔器打成4mm的纸片，分装于洁净干燥的培养皿中，置于高压灭菌锅内，121℃下湿热灭菌20min，备用。
1.2活化微生物
在无菌条件下用划线法将供试菌种(枯草芽孢杆菌、大肠杆菌)移接入相应的固体培养基上，放入培养箱中，于37℃下培养24h，备用。
1.3S2-16粗提物对不同微生物抑菌效果测定
用移液枪吸取上述枯草芽孢杆菌、大肠杆菌菌悬液100μL(OD600＝0.8)于无菌平皿中，然后均匀涂布在经高压灭菌后的培养基上。用无菌镊子将灭菌后的滤纸片放入S2-16粗提物中浸泡30min后取出，无菌条件下干燥使其溶剂挥发。待培养基冷凝后，将含S2-16粗提物的滤纸片贴于平板上，各设3个重复，并以75％乙醇作为阴性对照，绿原酸标准品作为阳性对照。放入培养箱中，37℃培养48h。实时观察抑菌情况，测定抑菌圈直径，取其平均值；计算抑菌率。
抑菌率(％)＝(M1–M0)/(M0–0.5)×100％
其中，M0为75％乙醇抑菌圈直径，M1为样品抑菌圈直径。
表4 S2-16粗提物对大肠杆菌抑菌圈的变化
表5 不同样品对大肠杆菌的抑菌能力
表6 S2-16粗提物对枯草芽孢杆菌抑菌圈的变化
表7 不同样品对枯草芽孢杆菌的抑菌能力
抑菌效果表明，S2-16粗提物对大肠杆菌的抑制作用较为显著，24h后抑菌圈可达12±0.07mm(表4)，相对于绿原酸标准品来说，S2-16粗提物抑菌效果明显(表5)；而S2-16粗提物对枯草芽孢杆菌的抑制作用，24h后抑菌圈可达8.8±0.027mm(表6)，与针对大肠杆菌的实验结果并不完全相同，但具有相似性(表7)。
实施例5：尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)粗提物的抗氧化作用
采用DPPH法测定S2-16粗提物对DPPH自由基的清除作用。将绿原酸用甲醇配制成1.0mg mL-1的母液，锡箔纸包裹避光备用；0.1mmol L-1 DPPH溶液用无水乙醇配制，锡箔纸包裹避光备用。准确吸取2mL新配制的0.1mmol L-1DPPH溶液到EP管中，滴加1mL 95％乙醇混合均匀，锡箔纸包裹后于室温暗反应30min，测定A0；S2-16粗提物8000rpm离心取上清液制备样品液，2mL DPPH溶液滴加样品液及95％乙醇混合均匀，锡箔纸包裹后于室温暗反应30min，测定A，以绿原酸标准品溶液作为阳性对照，在517nm处用酶标仪测定反应液的吸光度。样品液对DPPH清除率的计算公式为：
SA(％)＝[(A0-A)/A0]×100％
其中，A0为空白对照吸光度，A为样品溶液的吸光度。
表8 样品液对DPPH清除率
如表8所示，绿原酸标准品对DPPH清除率46.0％，S2-16粗提物样品液对DPPH清除率77.7％(表8)，因此，尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)的抗氧化作用较强(图9)。
绿原酸对非细胞体系产生的羟自由基和DDDP自由基均有明显的清除作用，可能是因为绿原酸本身的酚羟基结构极易与自由基反应，提供质子和电子使其失去反应活性，故具有显著的抗氧化特性。绿原酸除了部分破坏细菌细胞膜外，还可降低细菌细胞壁的刚度，协同杀菌。
综上检测表明，尖孢炭疽菌S2-16(Colletotrichum acutatum)粗提物的抗氧化效果显著。能够抑制植物体周围病原菌的生长，进而降低由于环境胁迫所导致植物体的损伤，从而提高其抗病能力及抗环境应激能力；尤其是还能够促进植物生长。因此，由于上述作用所具有的抑菌和抗氧化的共性，所以该菌可以作为广泛的抑菌剂或抗氧化剂应用于植物生长当中。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 广西大学
<120> 一种能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16及其应用
<130> ZYWS
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 584
<212> DNA
<213> Colletotrichum acutatum
<400> 1
tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ctgagttacc gctctataac cctttgtgaa 60
cgtacctaac cgttgcttcg gcgggcaggg gaagcctctc gcgggcctcc cctcccggcg 120
ccggccccca ccacggggac ggggcgcccg ccggaggaaa ccaaactcta tttacacgac 180
gtctcttctg agtggcacaa gcaaataatt aaaactttta acaacggatc tcttggttct 240
ggcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa 300
tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgctc gccagcattc tggcgagcat gcctgttcga 360
gcgtcatttc aaccctcaag caccgcttgg ttttggggcc ccacggccga cgtgggccct 420
taaaggtagt ggcggaccct cccggagcct cctttgcgta gtaactaacg tctcgcactg 480
ggatccggag ggactcttgc cgttaaaccc ccaaattctt tacaggttga cctcggatca 540
ggtaggaata cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agga 584

Claims (5)

1.一株能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16，其特征在于，其分类学命名为Colletotrichum acutatum S2-16，于2017年12月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2017789。
2.根据权利要求1所述的能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16的粗提物在产生次生代谢物中的应用。
3.根据权利要求1所述的能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16的粗提物在抑菌及抗氧化中的应用。
4.根据权利要求1所述的能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16的粗提物在制备抑菌制剂中的应用。
5.根据权利要求1所述的能生长分泌次生代谢物绿原酸的菌株S2-16的粗提物在制备抗氧化制剂中的应用。
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