CN108186652A - 缝隙连接细胞间通迅抑制剂甘珀酸在制备预防和治疗肝细胞癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物领域，基于对CAF与HCC细胞间缝隙连接的认识，为肝癌治疗提供了一种新的途径，具体是通过抑制CAF与HCC间的缝隙连接细胞通讯作用(GJIC)来抑制CAF细胞的激活，最终实现抑制肿瘤的发生与发展。本发明提供了缝隙连接细胞间通迅(GJIC)抑制剂的新的制药用途，具体是抑制CAF细胞激活，从而抑制肿瘤的发生与发展，所述GJIC抑制剂为甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)。

Description

缝隙连接细胞间通迅抑制剂甘珀酸在制备预防和治疗肝细胞 癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种药物新用途，具体涉及缝隙连接抑制剂CBX在制备抑制肿瘤相关成纤维细胞活化药物和制备预防和治疗肝细胞癌药物中的应用。

背景技术

原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤，数十年来在诊断、治疗的预后等各方面的进展十分有限，其主要原因是对这些肿瘤发生发展的确切分子机制所知有限，难以设计针对性的方案，因此寻找致病相关分子是阐明肝癌发病机制的关键，具有十分重要的意义。肝癌复发的重要因素之一是其肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞不断增殖分化，成为肿瘤细胞疯狂生长的源泉；同时，肿瘤干细胞具有干细胞的转移性，使肿瘤在机体内蔓延；另外，肿瘤干细胞具有对化疗药物不敏感的特性，易逃避凋亡而生存。多柔比星常规用作晚期HCC药物，其疗效差，约15-20％应答率。肝癌复发或转移在患者中相当普遍，患者在术后5年的存活率为30％至40％。HCC患者呈现药物抵抗和不良的预后，对常规化疗剂出现耐药现象，如顺铂(CIS)，氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素(DOX)。重要的是，近年来研究表明肝癌对化疗或放疗不敏感，主要表现为肿瘤起始细胞(Tumor initiating cells)或癌症干细胞样/干细胞(Cancer stem-like/stem cells)的存在，这些细胞往往可进展成新的肿瘤形成。在过去十年的研究中，影响肝癌的耐药性的细胞信号通路有STAT3信号通路(Signal transducer and activator of transcription3)、NOTCH信号通路、Hedgehog信号通路、TGF-β信号通路(Transforming growth factor-beta)等，这些信号通路与肝癌细胞的自我更新、分化和存活有着密切关系。从而，阻断肝癌干细胞的重要信号通路或信号泉源能有效地提高化疗效果，进而提升整个肝癌的治疗效果。

肿瘤相关成纤维细胞(Cancer associated fibroblasts，CAF)是肿瘤微环境中最主要的宿主细胞之一，它通过细胞-细胞间直接接触、可溶性因子的分泌和对细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的修饰对该体系的平衡起着重要的调控作用。CAF拥有波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的共同表达，代表着CAF处于激活状态。在肿瘤组织中，CAF分布于肿瘤侵袭前沿、肿瘤-间质界面或肿瘤间质中靠近肿瘤血管内皮细胞并包绕着癌巢。在多种肿瘤组织均可发现有CAF的存在与激活，如乳腺癌、肺癌、口腔舌鳞状细胞癌、前列腺癌、肝癌等组织。

CAF在肿瘤的发生发展中起着重要作用。CAF参与肿瘤细胞外基质的合成、沉积和重构，并能分泌可溶性的旁分泌信号刺激邻近上皮细胞增殖和恶性转化，抑制上皮细胞死亡，改变上皮细胞之间的黏附力，并能诱导肿瘤免疫逃逸，从而促进肿瘤发生发展。如过度表达TGF-β或HGF的CAF能够诱导正常人乳腺上皮癌变；前列腺癌来源的CAF能促进具有癌变潜能的前列腺上皮细胞的癌变，而正常组织的纤维母细胞无此作用。另外，CAF也能促进肿瘤侵袭转移，发生EMT现象。还有，最近研究发现CAF能诱使肿瘤细胞拥有更强的肿瘤干细胞类似特征，如乳腺癌组织来源的CAF可分泌CCL2趋化因子增强乳腺癌干细胞的自我更新能力；前列腺癌来源的CAF通过分泌Annexin A1因子能明显地增强肿瘤干细胞的更新与增殖能力。本课题组前期研究工作发现肝癌组织来源的CAF会诱使肿瘤细胞出现肿瘤干细胞类似特征，如自我更新能力和化疗药物耐敏性能力的增强。但其作用机制尚不清楚。另外，CAF细胞与正常的肝组织来源的成纤维细胞(Normal liver fibroblasts，NLF)相比，差异性的蛋白表达研究报道尚不清楚。

肿瘤细胞与间质细胞的相互通讯作用已成为了肿瘤发展的重要特点之一。细胞间的相互作用有直接和间接两种。近年来大部分研究工作都是集中在间接作用方式，CAF细胞通过分泌细胞因子和趋化因子等作用于肿瘤细胞。而常常忽略了直接作用方式，肿瘤细胞与肿瘤微环境各成员一般是以缝隙连接方式直接相互作用。缝隙连接(Gap junction)是细胞间的一种通讯方式，由缝隙连接蛋白(Connexin，Cx)构成。相邻细胞间通过间隙连接蛋白介导的缝隙连接细胞间通迅(Gap junction intercellular communication，GJIC)进行着细胞间信号的传递，调控细胞的增殖、分化等生理过程。GJIC的异常可以导致多种病变，肿瘤细胞间及其与周围细胞间常见缝隙连接的异常或缺失，这同样是肿瘤形成的一个重要原因。缝隙连接蛋白表达缺陷与多种肿瘤的发生、发展及转移密切相关，许多肿瘤如神经胶质瘤、肺癌、乳腺癌、大肠癌、肝癌、前列腺癌、卵巢癌等均显示Cx43表达减少或缺失，GJIC功能下降或丧失。Cx43是Cx家族中的一员，因分子量43kDa而得名。研究分析18例神经胶质瘤组织中Cx43的表达水平中发现在所有的正常脑组织有Cx43的高水平表达，而在神经胶质瘤组织的Cx43表在则非常低甚至缺失。检测32例乳腺癌标本Cx43的表达，结果提示Cx43在乳腺癌组织中表达缺失。研究结果证实Cx43在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。但是，GJIC对于CAF细胞的活化的研究尚没有直接报道。研究报道活化后的正常成纤维细胞表现出GJIC能力上调和其相关Cx43蛋白也明显增高。进而，通过抑制CAF细胞的GJIC作用有望可能成为抑制CAF细胞活化的重要方式之一。

原发性肝细胞癌的恶性程度极高、预后极差，数十年来在诊断、治疗的预后等各方面的进展十分有限，因此急需寻找一种新的更为有效的治疗方法提高肿瘤治疗过程中的靶向治疗效果。

发明内容

鉴于CAF在调节肿瘤的生物学行为方面有重要作用，它有可能为各种肿瘤的病理诊断、预后判定和生物治疗提供一个有前景的靶目标。如前期研究工作表明CAF在肝癌组织的活跃程度反映着肝癌患者的生存质量，CAF大量激活的患者5年生存率低。这预示着CAF的激活状态则可以成为肿瘤的病理诊断、预后判定和生物治疗效果的重要标志物。我们前期研究工作表明构成肿瘤微环境中主要成员的CAF细胞可促使肝癌细胞的生长与增殖，并使肝癌细胞对铂类化疗药物产生耐药，和发生肿瘤细胞的EMT现象。另外，肝癌细胞与CAF共培养后会诱使肿瘤细胞出现肿瘤干细胞类似特征，如自我更新能力和化疗药物耐敏性能力的增强，但其作用机制尚不清楚。

大部分研究认为CAF诱使肿瘤细胞出现肿瘤干细胞类似特征是因为CAF分泌特定的细胞因子而产生，但本发明第一次发现CAF与HCC细胞存在细胞间的直接相互作用，具体是缝隙连接细胞通讯(GJIC)，这种缝隙连接细胞通讯可促使肿瘤细胞的自我更新能力得以维持，达到促进肿瘤的发生与发展，具体体现在：(1)缝隙连接细胞通讯(GJIC)在CAF细胞中异常激活；(2)抑制缝隙连接细胞通讯(GJIC)使LX2细胞失活，且减弱LX2细胞增强HCC细胞的成球能力的作用，表现为下调成纤维细胞激活生物标志物Collagen I和α-SMA的表达；(3)缝隙连接细胞通讯阻断剂甘珀酸(Carbenoxolone，CBX)能有效地减弱CAF增强HCC细胞成球能力的现象，CBX同样也能减弱TGFβ因子促使LX2细胞激活，下调Collagen I，α-SMA和IL6的表达。随着CBX浓度增加明显地更能抑制CAF细胞的生长增殖。CAF与HCC细胞共培养后能增强HCC细胞的成球能力，而CBX能明显地逆转了这一现象。

基于第一次发现CAF与HCC细胞存在细胞间的直接相互作用，本发明提供一种抑制CAF与HCC之间的缝隙连接细胞间通迅(GJIC)来抑制CAF细胞激活的方法，由于CAF参与肿瘤细胞外基质的合成、沉积和重构，并能分泌可溶性的旁分泌信号刺激邻近上皮细胞增殖和恶性转化，抑制上皮细胞死亡，改变上皮细胞之间的黏附力，并能诱导肿瘤免疫逃逸，从而促进肿瘤发生发展，抑制CAF细胞的激活可以实现对肿瘤发生与发展的抑制，从而本发明提供一种预防和治疗肿瘤方法，优选预防和治疗肝细胞癌。

所述抑制CAF与HCC之间的缝隙连接细胞间通迅(GJIC)是通过GJIC抑制剂来实现的，所述GJIC抑制剂为甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)。

本发明进一步提供一种预防和治疗肿瘤的药物组合物，其包含缝隙连接细胞间通迅(GJIC)抑制剂，所述肿瘤优选为肝细胞癌，所述抑制剂优选为甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)首次发现CAF与HCC之间存在缝隙连接细胞通讯作用(GJIC)，基于对CAF与HCC细胞间缝隙连接的认识，提出GJIC可成为肿瘤治疗过程靶向CAF细胞的重要靶点。

(2)本发明为肝癌治疗提供了一种新的途径，具体是通过抑制CAF与HCC间的缝隙连接细胞通讯作用(GJIC)来抑制CAF细胞的激活，最终实现抑制肿瘤的发生与发展，所述GJIC抑制剂为甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)。

(3)本发明提供了缝隙连接细胞间通迅(GJIC)抑制剂的新的制药用途，具体是抑制CAF细胞激活，从而抑制肿瘤的发生与发展，所述GJIC抑制剂为甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)。

附图说明

图1：CAF细胞与HCC细胞直接共培养后增强HCC细胞的成球形成能力。A：通过慢病毒感染方法构建带有dTomato荧光蛋白的HCC细胞稳定株Hep 3B/dTomato和MHCC 97L/dTomato，HCC细胞稳定株经过流式检测确定。B、C：HCC细胞稳定株与CAF细胞直接共培养3天后，取HCC细胞系进行成球实验测定。结果表明直接共培养方式能明显地增强HCC细胞的成球能力。D：通过慢病毒感染方法构建带有荧光蛋白的HCC细胞稳定株MHCC 97L/GFP和与CAF细胞同源的星形细胞稳定株LX2/dTomato.稳定株细胞均经过流式检测确定。E：荧光显微镜观察MHCC 97L/GFP和LX2/dTomato以比例1：1共培养3天后的细胞形态图。发现MHCC-97L/GFP呈现克隆生长，LX2/dtomato呈现蜂窝式生长，具有典型的规律性。结果表明该两种细胞可能存在着直接相互作用方式。

图2：缝隙连接细胞通讯作用(GJIC)在CAF细胞中异常激活，而HCC细胞是低活性的。A、B：在MHCC 97L/GFP和LX2/dTomato共培养体系中添加缝隙连接细胞通讯阻断剂甘珀酸(Carbenoxolone,CBX)，流式结果发现CBX能打破两种细胞的生长平衡，预示着缝隙连接细胞通讯作用可能存在于两者细胞中，并对细胞的活性功能有影响作用。C、D：利用划痕标记染料示踪技术结果表明在LX2，NLF(Normal liver fibroblast,正常肝纤维细胞)和CAF细胞有明显的缝隙连接细胞通讯作用，CAF细胞的活性表现最强。而HCC细胞的细胞通讯作用异常低。这些实验结果暗示着缝隙连接细胞通讯作用对于CAF细胞的激活可能存在着影响作用。

图3：CBX下调Cx43蛋白表达进而抑制LX2细胞激活。A：Western blotting实验检测CAF细胞内Cx43和成纤维细胞活化标志物Collagen I和α-SMA蛋白表达。B：RT-PCR实验检测CAF细胞内Cx43和成纤维细胞活化标志物COLA1和IL-6基因表达情况。结果表明活化后的CAF细胞中Cx43,Collagen I和α-SMA表达较高。C、D：Western blotting实验检测不同处理后LX2细胞内Cx43和成纤维细胞活化标志物Collagen I和α-SMA蛋白表达。E：RT-PCR实验检测不同处理后LX2细胞内Cx43和成纤维细胞活化标志物COLA1和IL-6基因表达情况。通过对LX2细胞进行干扰Cx43蛋白表达，能有效地抑制LX2细胞中成纤维细胞激活的标志物Collagen I和α-SMA。通过添加缝隙连接细胞通讯阻断剂CBX也能明显地抑制细胞中成纤维细胞激活的标志物Collagen I和α-SMA。另外，CBX同样也能减弱TGFβ因子促使LX2细胞激活，下调Collagen I，α-SMA和IL6的表达。

图4：缝隙连接细胞通讯阻断剂CBX有效地减弱CAF增强HCC细胞成球形成能力。A：Western blotting实验检测CAF细胞内Cx43和成纤维细胞活化标志物Collagen I和α-SMA蛋白表达。B：RT-PCR实验检测CAF细胞内Cx43和成纤维细胞活化标志物COLA1和IL-6基因表达情况。通过添加缝隙连接细胞通讯阻断剂CBX能明显地抑制CAF细胞中成纤维细胞激活的标志物Collagen I，α-SMA和IL6。C：CBX抑制剂处理CAF细胞的生长曲线。CBX随着浓度增加明显地更能抑制CAF细胞的生长增殖。D、E：在HCC细胞和CAF共培养体系中添加CBX处理3天后，取HCC细胞进行细胞成球形成实验。CAF与HCC细胞共培养后能增强HCC细胞的成球能力，而CBX能明显地逆转了这一现象。结果表明CBX能有效地减弱CAF增强HCC细胞增殖能力。

具体实施方法

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实验方法

1.慢病毒包装与收集

构建相关的慢病毒高表达载体(pLVX)或ShRNA慢病毒表达载体(pLKO)，转染前使293FT细胞种1～2×10⁶于60mm培养皿，使生长密度达到80％左右方可进行转染。用脂质体介导的方法将重组慢病毒载体和pMD-G、pPax2载体共转染293FT包装细胞，质粒比例为8：5：3，总量为6μg。将转染后的293FT细胞置于5％CO2，37℃培养箱培养。转染后48h、72h后分别收集各自的病毒液，0.45μm滤器过滤后混匀，4℃保存。若病毒感染滴度不够的时候，应当考虑浓缩。将病毒液置于200kd超滤管，采取4 000rpm 10min离心进行浓缩。浓缩后病毒液可置于-80℃保存。

2.稳定细胞株的筛选与构建

稳定细胞株的构建包括细胞的病毒感染、药物筛选或流式细胞术分选和其鉴定。

靶细胞的病毒感染：感染前将细胞低密度传至培养皿中，每孔添加1～3mL病毒液，同时加入聚凝胺(Polyberne)使其终浓度为至8μg/ml，感染4～6h后去除病毒液，加入新鲜培养基继续培养，感染24～36h后在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。若发现有GFP阳性细胞，细胞继续培养，传2～5代后利用流式细胞术分析GFP阳性细胞的比率。

药物筛选：针对慢病毒载体上的筛选抗性进行相应的药物筛选，如添加嘌呤霉素(1～2μg/ml)进行筛选，最后用Western blot法鉴定。

流式细胞术分选：将阳性的稳定细胞株于多色荧光流式细胞仪(MoFlo XDP细胞分选流式仪)(美国Beckman公司)进行GFP阳性细胞的分选。筛选过程中应当防止外源的污染，添加抗生素，如100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素。

稳定细胞株的构建：利用Western blotting检测目标蛋白表达水平及其下游蛋白的表达水平。

3.Western blot检测蛋白表达水平

收集细胞，用细胞裂解液(20mM Tris pH7.5、150mM NaCl、0.25％NP40、2.5mMsodium pyprophosphate、1mM EGTA、1mM EDTA、1mMβ-glycerophosphate、1mM Na3VO4、1mMPMSF、1μg/ml leupeptin)提取细胞总蛋白。用考马斯亮蓝法进行蛋白定量后，按40μg上样，10％～12％SDS-PAGE进行电泳，将蛋白转移至硝酸纤维素膜(10V 50min)，一抗孵育，4℃过夜，1：5 000稀释的HRP标记的抗鼠或兔IgG为二抗，孵育1h，用TBST清洗3次10min，用X线片于暗示中曝光。以β-actin或GAPDH作为内参对照。

4.MTT方法检测稳定细胞株增殖情况

将不同的稳定细胞株分别在96孔板中种入10 000个细胞，每组设5个复孔，共培养7天，分别在特定的时间点进行MTT检测，检测前每孔加入20μL MTT溶液(5mg/ml)，继续孵育4h，弃上清液，然后每孔加入150μL DMSO溶解沉淀，置于摇床使紫色结晶物全部溶解，最后于490nm波长的酶标仪测定吸光度(OD值)。

5.RT-PCR

收集目的细胞，应用Trizol试剂提取细胞总RNA，核酸蛋白分析仪检测含量。1μg总RNA按cDNA第一链逆转录试剂盒说明逆转录为cDNA。合成相关的引用，如Gli、β-catenin和Notch1等，采用Real time PCR法进行定量实验，以Hprt或GAPDH作为内参对照。PCR的操作过程严格遵守试剂盒说明书进行。

6.CAF的提取和纯化及肝癌细胞的培养

a.CAF的提取和纯化：①新鲜组织的切取：手术前事先准备好相关原代提取手术器械，包括组织剪、培养皿、离心管等，灭菌备用。术中记录患者疾病相关信息，以备以后查询。在标本离体后，观察肿瘤的大小、位置，无菌操作切取大小约2×2×2cm的肿瘤组织。对于软性的组织应尽量切取较多为宜，而触感坚硬的组织略小即可。此外，应在短时间内切取组织并将之置于生理盐水内，冰盒内低温取回实验室。除肝癌患者的标本外，另外选择肝血管瘤患者标本一例用于阴性对照，方法同上。②组织的消化：无菌条件下用组织剪剪碎组织，如组织较坚韧，则适当延长剪碎的时间，直至将大块组织剪成大小约1mm³的组织微粒。用含有透明质酸酶、I型胶原酶的代组织细胞消化液在37℃的恒温摇床内、以45次/分钟的振动频率消化组织，时间约6至10小时。时间到达后用PBS漂洗终止消化。取12ml消化液于50ml离心管，加入30ml PBS溶液，吹匀，400G转速离心8分钟弃去浑浊留上清，重复两次。最后，用含双抗的1640+10％FBS常规培养基12ml重悬混匀，并置于75cm²培养瓶培养2天。③细胞的纯化和上清提取：原代细胞经过2天后，弃去培养瓶中的液体，并用PBS洗去残留的组织碎粒，重新加入1640+10％FBS常规培养基继续培养，则至80％左右密度后按常规贴壁细胞传代方法进行传代培养。一般经过3至4次传代可得到高度纯化的肝癌相关成纤维细胞(CAF)。

b.肝癌细胞的培养：常规传代培养：选择人肝癌细胞系MHHC 97L和Hep 3B肝癌细胞系(本中心留种保存)，用DMEM+10％FBS的培养基，待细胞生长到90％密度时进行1:5传代。

7.肿瘤细胞成球实验

将肝癌细胞接种于低黏附的6孔培养板中，用含EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、B27添加剂、LIF(leukemia inhibitory factor,10ng/ml)、LG(L-glutamine,2mmol/l)和肝素40U/ml的DMEM-F12培养基，在37℃、5％CO2孵箱中培养，7～10天能形成细胞球。显微镜下随即10个视野观察细胞，计数细胞球数，统计分析。

8.数据的统计与分析

计量数据用均数±标准差表示。运用参数统计和非参数统计方法进行T检验。两独立样本间比较采用Student’s t检验。多组间计量资料应用单因素方差分析(one-wayanalysis of variance,ANOVA)，多个样本均数间两两比较采用LSD-t检验。若P<0.05，则表明该实验数据具有显著性差异，具有统计学意义。*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

实施例

实施例1CAF增强HCC细胞的干性能力(成球能力)

构建稳定表达dtomato蛋白的肝癌细胞系，用来建立肝癌细胞系与CAF共培养体系。将HCC细胞系与CAF CM或CAF直接共培养后3天，取HCC细胞系进行成球实验测定，结果如图1所示，结果表明两种方式均能明显地增强HCC细胞系的成球能力，肝癌细胞系经过CAF条件性培养基(Condition Media，CM)处理后，明显地表现为克隆形成能力明显增强，约有一倍的增强。免疫印迹实验表明，CAF CM主要是通过上调HCC细胞系中STAT3信号通路。进而说明CAF介导的HCC细胞干性能力的增强与STAT3信号通路的活化有直接相关性。

实施例2GJIC在CAF细胞中异常激活，而HCC细胞是低活性的

因CAF细胞的重要来源是肝星状细胞，所以我们将利用肝星状细胞系LX2加以研究。将LX2/dtomato细胞与MHCC-97L/GFP细胞以1：1比例直接共培养3天后，结果如图2所示，发现MHCC-97L/GFP呈现克隆生长，LX2/dtomato呈现蜂窝式生长，具有典型的规律性。另外，我们通过添加缝隙连接细胞通讯阻断剂甘珀酸(Carbenoxolone，CBX)于共培养体系中，流式结果发现CBX能打破两种细胞的生长平衡，预示着缝隙连接细胞通讯作用可能存在于两者细胞中，并对细胞的活性功能有影响作用。利用划痕标记染料示踪技术结果表明在LX2，NLF(Normal liver fibroblast，正常肝纤维细胞)和CAF细胞有明显的缝隙连接细胞通讯作用，CAF细胞的活性表现最强。而HCC细胞的细胞通讯作用异常低。这些实验结果暗示着缝隙连接细胞通讯作用对于CAF细胞的激活可能存在着影响作用。

实施例3抑制GJIC使LX2细胞失活，且减弱LX2细胞增强HCC细胞的干性能力的作用。

如图3所示。Western blotting和RT-PCR结果表明CAF细胞表达较高的纤维细胞激活的标志物C43、Collagen I和α-SMA随着传代代数变多，NLF和CAF的成纤维细胞激活的标志物均表达上调。添加Collagen I在细胞板上能明显地增强HCC细胞的克隆形成能力。这些预示着纤维细胞激活与HCC细胞干性能力增强有着相关性。

通过CBX处理或shRNA技术下调Cx43蛋白表达，能有效地抑制LX2细胞中成纤维细胞激活的标志物Collagen I和α-SMA。通过添加缝隙连接细胞通讯阻断剂CBX也能明显地抑制细胞中成纤维细胞激活的标志物Collagen I和α-SMA。另外，CBX同样也能减弱TGFβ因子促使LX2细胞激活，下调Collagen I、α-SMA和IL6的表达。CBX随着浓度增加明显地更能抑制LX2细胞的生长增殖。最后，LX2与肝癌细胞系MHCC-97L细胞共培养后能增强HCC细胞的成球能力，而CBX能明显地逆转了这一现象。这些结果说明了肝癌相关成纤维的激活可能是由于GJIC作用引起，靶向GJIC可能抑制肝癌相关成纤维的激活。

实施例4缝隙连接细胞通讯阻断剂CBX有效地减弱CAF增强HCC细胞干性能力的现象。

如图4所示。通过添加缝隙连接细胞通讯阻断剂CBX能明显地抑制CAF细胞中成纤维细胞激活的标志物Collagen I，α-SMA和IL6。CBX随着浓度增加明显地更能抑制CAF细胞的生长增殖。CAF与HCC细胞共培养后能增强HCC细胞的成球能力，而CBX能明显地逆转了这一现象。流式检测分析得到CBX能有效地逆转CAF上调HCC细胞的CD133和CD90表达的现象。这些说明缝隙连接细胞通讯阻断剂CBX有效地减弱CAF增强HCC细胞干性能力的现象。

Claims (7)

1.一种缝隙连接细胞通讯作用(GJIC)抑制剂，所述抑制剂为甘珀酸。

2.缝隙连接细胞通讯作用(GJIC)抑制剂在制备抑制肿瘤相关成纤维细胞(CAF)活化的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，所述抑制剂为甘珀酸。

4.根据权利要求2或3所述的用途，所述肿瘤为肝细胞癌。

5.缝隙连接细胞通讯作用(GJIC)抑制剂在制备治疗肿瘤的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述的用途，所述抑制剂为甘珀酸。

7.根据权利要求5或6所述的用途，所述肿瘤为肝细胞癌。