CN108175874A - 基于静电纺丝纱线和水凝胶的复合支架材料及其制备方法 - Google Patents

基于静电纺丝纱线和水凝胶的复合支架材料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种基于静电纺丝纱线和水凝胶的复合支架材料及其制备方法。该复合支架材料的制备方法，包括如下步骤：配制I型胶原蛋白溶液；提供静电纺丝纱线，将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中，然后待所述I型胶原溶液成凝胶后，得复合支架材料。该制备方法得到的复合支架材料，静电纺丝纱线可增强I型胶原蛋白的凝胶支架的力学性能，使其从结构、组成和功能上具备仿生天然组织，而I型胶原蛋白的凝胶又可以提高静电纺丝纱线的生物学性能，支持间充质干细胞正常生长；两者协同作用，得到的复合支架材料可广泛应用于组织工程领域。

Description

基于静电纺丝纱线和水凝胶的复合支架材料及其制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种复合支架材料及其制备方法。
背景技术
创伤、炎症、肿瘤和自然退化等造成软骨缺损后，人的自身修复能力有限，特别是关节软骨，损伤后不能自行愈合。随着社会人口老龄化的加剧，相关的问题越来越突出。据统计，仅在美国2008年就有2千万相关的软骨缺损病例，到2020年，这个数据会翻一番。目前临床上对软骨缺损常用的治疗方法主要有微骨折术、自体软骨细胞移植和人工关节置换等。这些修复方法有诸多缺陷，比如软骨纤维化、康复时间长、免疫反应和疾病传染和长期效果不理想等。
组织工程的兴起为软骨修复的研究提供了新的方向。组织工程软骨从组成和结构上仿生天然软骨组织，为软骨再生提供一个稳定的三维空间支架,并保持足够的孔隙率,供细胞在其中进行物质交换、生长代谢、引导组织再生。基于对软骨修复的重视，研究者开展了软骨支架的研究。然而，软骨支架还存在以下两个问题：(1)支架植入体内后与周围组织整合较差，需要缝合或者用生物胶粘合封闭；(2)支架上的种子细胞的增殖和分化能力较差，植入体内后，难以达到长期修复效果。因此，制备具有较高组织整合度和维持生长因子活性的多功能支架具有广泛的应用前景和重要的现实意义。
在人体中，组织/细胞生长在ECM(细胞外基质)包裹的三维环境中。与二维的支架相比，三维多孔的支架模仿人体组织的微环境，为细胞的生长、迁移、增殖和分化提供支撑。纳米纤维在自然界中有重要的作用，是细胞外基质的重要成分。动物体内广泛存在着胶原蛋白纳米纤维；在植物中主要是纤维素纳米纤维。纳米纤维在动植物体内具有特殊的作用，其单向结构可以使力沿着纤维轴向转移。此外，纳米纤维组成的网状结构具有很高的孔隙率，能够使生物活性分子或者各种生长因子较快的浸入其内部，有利于营养的传输和代谢物的排出。纳米纤维的比表面积也相对较大，能为细胞提供较多的粘附位点，并且为活性分子等提供更多的合适结合位点。所以，制备纳米纤维支架以仿生细胞外基质是近年来组织工程中的一个研究热点。
多根纳米纤维组成单根纱线，它的微米级尺寸有利于控制支架的最终结构和形态。目前，纱线支架有三维纱线支架、膜状纱线支架等，这些支架具备较高的孔隙率和较大的孔径尺寸。纱线在组织工程中的应用包括肌腱组织工程、软骨组织工程、神经组织工程、脂肪组织工程和骨组织工程等。在之前的研究中，我们采用水循环系统作为接收装置的同时，外接一个滚动的转轴作为接收装置，制备了膜状纱线支架。
水凝胶是介于固体和液体之间的一种高分子网络体系，在软组织工程应用中常被用来作为细胞或者生长因子的载体。它的交联结构使其具备三维多孔的结构，有利于氧气进入、营养物质的传输和代谢物的排出。以天然或者合成材料为基的水凝胶通过合理的设计和制备可以仿生天然细胞外基质，具有良好的生物相容性，较低的炎症反应，有利于组织的再生。硫酸软骨素(CS)是软骨组织中多糖的重要成分，口服或者注射用于预防治疗关节炎。它所带的负电荷制备成水凝胶后能够与生长因子结合，保持生长因子活性和功能。此外，通过高碘酸盐的氧化可以制备成水凝胶粘合剂，其醛基可以与组织中的氨基通过席夫碱反应，使水凝胶与组织整合。
研究者结合纳米纤维与水凝胶结合的有点，制备出的支架虽然力学性能和生物相容性较好，但是纳米纤维膜的孔径尺寸过小，组织再生过程中细胞难以长入纤维/水凝胶复合支架内。此外，复合支架植入动物模型体内后，与周围组织难以整合，需要通过缝合或者粘合剂封闭。采用喷溅法和静电纺丝法制备的支架成型后，纳米纤维膜存在明显的分层结构。把纳米纤维膜与水凝胶直接混合，支架成型后纤维膜在支架中分布不均。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种基于静电纺丝纱线和水凝胶的复合支架材料及其制备方法，旨在解决现有静电纺丝纱线膜生物相容性较差和天然材料水凝胶力学性能较差的技术问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明一方面提供一种复合支架材料的制备方法，包括如下步骤：
配制I型胶原蛋白溶液；
提供静电纺丝纱线，将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中，然后待所述I型胶原蛋白溶液成凝胶后，得复合支架材料。
本发明另一方面提供一种复合支架材料，所述复合支架材料由本发明的上述制备方法制得。
本发明提供的复合支架材料的制备方法，将I型胶原蛋白溶液浸润在静电纺丝纱线中，待溶液成凝胶后，得到一种兼具力学性能和生物学性能的复合支架材料。该制备方法从仿生软骨天然细胞外基质的角度出发，采用不同支架成型技术，取长补短，制备性能优良的复合材料支架。天然I型胶原蛋白水凝胶和静电纺丝纱线具有仿生天然组织细胞外基质的性能，静电纺丝纱线可增强I型胶原蛋白的水凝胶支架的力学性能，使其从结构、组成和功能上具备仿生天然组织，I型胶原蛋白的水凝胶又可以提高静电纺丝纱线的生物学性能，支持间充质干细胞正常生长；两者协同作用，得到的复合支架材料可广泛应用于组织工程领域。
附图说明
图1为本发明实施例1中制备的静电纺丝P(LLA-CL)纱线膜结果图；其中，A为光镜图；B为电镜图；
图2为本发明实施例2中制备的Col-I水凝胶结果图；其中，A为Col-I水凝胶的光镜图；B为Col-I水凝胶的光学显微镜图；C为Col-I水凝胶冷冻干燥后的电镜图；
图3为本发明实施例3中制备的P(LLA-CL)/Col-I复合支架结果图；其中A为打孔器所获取圆片状静电纺丝P(LLA-CL)纱线膜；B为静电纺丝P(LLA-CL)纱线膜复合Col-I水凝胶后得到P(LLA-CL)/Col-I复合支架光镜图；C为P(LLA-CL)/Col-I复合支架冷冻干燥后的电镜图；D为骨髓间充质干细胞在P(LLA-CL)/Col-I复合支架中培养14天后的共聚焦显微镜图。
具体实施方式
为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一方面，本发明实施例提供了一种复合支架材料的制备方法，包括如下步骤：
S01：配制I型胶原蛋白溶液；
S02：提供静电纺丝纱线，将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中，然后待所述I型胶原蛋白溶液成凝胶后，得复合支架材料。
本发明实施例提供的复合支架材料的制备方法，将I型胶原蛋白(即Col-I)溶液浸润在静电纺丝纱线中，待溶液成凝胶后，得到一种兼具力学性能和生物学性能的复合支架材料。该制备方法从仿生软骨天然细胞外基质的角度出发，采用不同支架成型技术，取长补短，制备性能优良的复合材料支架。天然I型胶原蛋白水凝胶和静电纺丝纱线具有仿生天然组织细胞外基质的性能，静电纺丝纱线可增强I型胶原蛋白的水凝胶支架的力学性能，使其从结构、组成和功能上具备仿生天然组织，I型胶原蛋白的水凝胶又可以提高静电纺丝纱线的生物学性能，支持间充质干细胞正常生长；两者协同作用，得到的复合支架材料可广泛应用于组织工程领域。
进一步地，在上述步骤S01中，所述配制I型胶原蛋白溶液的步骤包括：提供I型胶原蛋白的酸溶液，向所述提供I型胶原蛋白的酸溶液中加入PBS缓冲液和碱液，得所述I型胶原蛋白溶液。具体一实施例中，I型胶原蛋白的酸溶液即为I型胶原蛋白的HCl溶液(0.01MHCl pH＝2.0)，I型胶原蛋白溶液的配制步骤可以为：向0.8mL浓度为3mg/mL的I型胶原蛋白的HCl溶液中加入0.1mL的浓度为10倍的PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)和0.1mL过滤消毒的0.1N NaOH混合，即可得到pH值在7.0(如pH＝0.68～0.72)左右的I型胶原蛋白溶液。
更进一步地，所述配制I型胶原蛋白溶液的步骤在无菌、且温度为0-4℃的条件下进行。更进一步地，所述I型胶原蛋白溶液中，I型胶原蛋白的浓度为2-3mg/mL。
进一步地，在步骤S02中，所述静电纺丝纱线的材料选自P(LLA-CL)(即聚乳酸-己内酯共聚物)纳米纤维、PLGA(即聚乳酸-羟基乙酸共聚物)纳米纤维和PLLA(即聚左旋乳酸)纳米纤维中的任意一种；更进一步地，所述静电纺丝纱线为厚度为0.5-1mm的薄膜。具体地，所述静电纺丝纱线如P(LLA-CL)，可以是不同形状：可以是方形的补片，可以是不规则形状的补片，可根据需要进行相应剪裁。
进一步地，在步骤S02中，在将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中之前，还包括将所述静电纺丝纱线依次经过酒精消毒和PBS缓冲液清洗的步骤。
更进一步地，在步骤S02中，将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中的步骤包括：将所述I型胶原蛋白溶液滴加入所述静电纺丝纱线中。该滴加方式可以使I型胶原蛋白溶液均匀分散在所述静电纺丝纱线中。更进一步地，滴加后，所述I型胶原蛋白溶液成凝胶的条件为：温度35-38℃，时间1-3h。该条件下静置，I型胶原蛋白溶液变成凝胶状态。
另一方面，本发明实施例还提供了一种复合支架材料，所述复合支架材料由本发明实施例的上述制备方法制得。
该复合支架材料中，静电纺丝纱线可增强I型胶原蛋白水凝胶支架的力学性能，使其从结构、组成和功能上具备仿生天然组织，I型胶原蛋白水凝胶又可以提高静电纺丝纱线的生物学性能，支持间充质干细胞正常生长；两者协同作用，得到的复合支架材料可广泛应用于组织工程领域。
本发明先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对发明进行进一步详细描述，下面结合具体实施例进行详细说明。
实施例1
静电纺丝P(LLA-CL)纱线膜的制备：
配置质量百分比为10％的P(LLA-CL)六氟异丙醇纺丝溶液，以静电纺丝仪和动态液体为接收装置制备静电纺丝P(LLA-CL)纱线膜，在电压为15KV，距离为14cm，推进泵推进速率为1mL/h的参数下进行制备。所制备的纱线膜放入冷冻干燥机中，冷冻干燥72h去除溶剂和水分，得到静电纺丝P(LLA-CL)纱线膜产品，结果如图1所示。
实施例2
I型胶原蛋白(Col-I)溶液的制备：
在0℃、且无菌的条件下，往0.8mL浓度为3mg/mL的I型胶原蛋白的酸溶液(0.01MHCl pH＝2.0)中加入0.1mL的浓度为10倍的PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)，然后再加入0.1mL过滤消毒的0.1N NaOH，用移液枪将混合溶液轻轻混匀，避免气泡产生，得到pH值在7.0左右的Col-I溶液(如图2A和B所示)；将上述溶液放置在35-38℃下1-3h后，得Col-I水凝胶；将Col-I水凝胶冷冻干燥，结果显示该Col-I作为支架具有很好的孔径网状结构(如图3C所示)。
实施例3
P(LLA-CL)/Col-I复合支架材料的制备：
用打孔器在实施例1制备的厚度为0.5-1mm的静电纺丝P(LLA-CL)纱线膜上获直径为0.6mm的圆片状支架(如图3A所示)，放入24孔板中，用70％酒精消毒，PBS缓冲液洗三遍后，滴加1mL实施例2配制好的pH值在7.0左右的Col-I溶液，小心的用移液枪滴加，避免气泡的产生。把滴加有Col-I溶液的P(LLA-CL)纱线膜放入37℃环境下静置2h后，Col-I溶液成凝胶，得到P(LLA-CL)/COL复合支架(如图3B所示)。
最后，为对复合支架进行电镜表征，将P(LLA-CL)/Col-I复合支架冷冻干燥处理，得到干燥后的电镜图(如图3C所示)。
在无菌条件下，将P(LLA-CL)/Col-I复合支架放入24孔板中。每个孔中加入10000个骨髓间充质细胞，再加入适量的培养基(培养基的配方为：DMEM、10％胎牛血清、1％双抗)，放入37℃、5％二氧化碳的恒温培养箱内培养，每培养两天换一次液，培养时间为14d。最后得到的骨髓间充质干细胞在P(LLA-CL)/Col-I复合支架培养14天后的共聚焦显微镜图，如图3D所示。从图3D可以看出，本实施例制备的P(LLA-CL)/Col-I复合支架具有良好的生物学性能，可支持间充质干细胞正常生长。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合支架材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
配制I型胶原蛋白溶液；
提供静电纺丝纱线，将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中，然后待所述I型胶原蛋白溶液成凝胶后，得复合支架材料。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述配制碱性I型胶原蛋白水凝胶的步骤包括：
提供I型胶原蛋白的酸溶液，向所述I型胶原蛋白的酸溶液中加入PBS缓冲液和碱液，得所述I型胶原蛋白溶液。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述配制I型胶原蛋白溶液的步骤在无菌、且温度为0-4℃的条件下进行。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述I型胶原蛋白溶液中，I型胶原蛋白的浓度为2-3mg/mL。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述I型胶原蛋白的酸溶液为I型胶原蛋白的HCl溶液。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静电纺丝纱线的材料选自P(LLA-CL)纳米纤维、PLGA纳米纤维和PLLA纳米纤维中的任意一种；和/或
所述静电纺丝纱线为厚度为0.5-1mm的薄膜。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中之前，还包括将所述静电纺丝纱线依次经过酒精消毒和PBS缓冲液清洗的步骤。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述静电纺丝纱线置于所述I型胶原蛋白溶液中的步骤包括：将所述I型胶原蛋白溶液滴加入所述静电纺丝纱线中。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述I型胶原蛋白溶液成凝胶的条件为：温度35-38℃，时间1-3h。
10.一种复合支架材料，其特征在于，所述复合支架材料由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得。
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