CN108165495B - 一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂 - Google Patents

一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂，该稳定剂包括磷酸缓冲液、甘油、血清、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠，所述磷酸缓冲液、甘油、血清、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠按一定的配比形成混合液。本发明的一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂克服了现有的微生物低温保存稳定剂存在下，微生物经过低温冷藏后的存活率和菌体活性不高的缺陷的问题，使微生物经过较长时间冷藏后(2～8℃，1个月)的存活率大于90％，菌体活性基本保持不变。

Description

一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂
技术领域
本发明涉及微生物冷藏保存领域，尤其涉及一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂。
背景技术
微生物菌种是重要的生物资源，菌种保藏是最基础的微生物工作，通过控制条件使菌种处于暂时休眠状态，尽量不死亡，也不繁殖，以利于研究与应用。常用的细菌保藏方法有：冷藏法、隔绝空气保藏法、冷冻干燥法、沙土管保藏法、液氮超低温保藏法、低温冷冻保藏法等。冷藏法和隔绝空气保藏法适用相对较短时间内的菌种保藏，后四类方法适用于长时间保藏(一年以上)。
工业生产上，发酵工厂几乎每天需要接种，用冷藏法保藏的菌种损伤小，不用复活，相对比较方便。在药品生产和检验领域，也需要每天进行微生物的定量检测试验。如中国药典(2015年版)非无菌产品微生物限度检查法中规定：菌液用生理盐水稀释成一定浓度后涂平板，接种量为每个平板50-100cfu。菌液制备后若放于室温下，应在2小时内使用，若保存在2～8℃，可在24小时内使用。这样，检验单位必须每天进行菌液的稀释和准备，费时费力。寻找一种好的保藏方法，使稀释好的菌液在2～8℃冷藏下能在较长时间内使用，是相关生产和检验单位一直在探究的课题。
发明内容
为了克服现有的微生物低温保存稳定剂存在下，微生物经过低温冷藏后的存活率和菌体活性不高的缺陷的问题，本发明提供一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂，以使微生物经过较长时间冷藏后(2～8℃，1个月)的存活率大于90％，菌体活性基本保持不变。
本发明的一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂，该稳定剂包括磷酸缓冲液、甘油、血清、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠，所述磷酸缓冲液、甘油、血清、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠按一定的配比形成混合液。
进一步的，所述磷酸缓冲液的浓度为0.05～0.5mol/L，pH为6～8，所述磷酸缓冲液中添加所述甘油、血清、亚硫酸氢钠和亚硫酸钠，其中所述甘油的浓度为5～30％(v/v)，所述血清的浓度为2～10％(v/v)，所述亚硫酸钠的浓度为0.01～0.2％(w/v)，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～0.5％(w/v)。
进一步的，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1～0.3mol/L，pH为6.5～7.5，所述磷酸缓冲液中添加所述甘油、血清、亚硫酸氢钠和亚硫酸钠，其中所述甘油的浓度为7.5～20％(v/v)，所述血清的浓度为4～6％(v/v)，所述亚硫酸钠的浓度为0.25～0.1％(w/v)，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.1～0.3％(w/v)。
进一步的，所述稳定剂保存状态为固态的组合物，使用状态为液态的组合物。
本申请的用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂，具体是在磷酸缓冲液为基础液中添加有甘油、血清、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠。其中，磷酸缓冲液用于提供稳定的环境，使溶液的pH保持稳定；甘油用于自由扩散到细胞内，降低细胞内的水活度，抑制生化反应的进行；血清用于结合在微生物细胞表面，对微生物起到保护作用，亚硫酸钠和亚硫酸氢钠为还原性物质，用于降低水溶液中的溶解氧，降低氧化还原电位，避免自由基对细胞造成的损伤。
在上述稳定剂中保存微生物，微生物在2～8℃冷藏1个月后，检测到菌体的存活力和菌体数量没有显著的下降。
使用本发明提供的用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂，可以使得包括但不限于大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草杆菌、铜绿假单胞菌、啤酒酵母、白假丝酵母菌悬液在2～8℃冷藏1个月后，存活率仍达到95％以上。
本发明的一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂克服了现有的微生物低温保存稳定剂存在下，微生物经过低温冷藏后的存活率和菌体活性不高的缺陷的问题，使微生物经过较长时间冷藏后(2～8℃，1个月)的存活率大于90％，菌体活性基本保持不变。
附图说明
图1为本实施例1中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的冷藏试验结果示图；
图2为本实施例2中枯草杆菌和铜绿假单胞菌的冷藏试验结果示图；
图3为本实施例3中沙门氏菌和大肠杆菌的冷藏试验结果示图；
图4为本实施例4中啤酒酵母和白假丝酵母的冷藏试验结果示图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下所用方法皆按药典2015版微生物测定方法进行。
实施例1.大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的冷藏试验
稳定剂配方为：终浓度为5％甘油(v/v)、2％血清(v/v)、0.01％亚硫酸钠(w/v)、0.05％亚硫酸氢钠(w/v)溶于pH 6.0的0.05mol/L磷酸缓冲液中(先将磷酸二氢钠和磷酸氢二钾溶于少量水中，加入上述试剂后，再定容)，制成用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂。
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的冻干微球颗粒分别溶于5.5mL上述冷藏保存稳定液中(2～8℃)，使成500cfu/mL的菌悬液，吸取0.1mL涂布于胰酪胨大豆琼脂(TSA)平板上，共涂布5个平板；剩余的5mL菌悬液分装在8个瓶子中，每个瓶子分装0.55ml，密封后放置在冰箱的冷藏室中(2～8℃)，在保存1、3、5、10、15、20、25、30天后分别取出，用同样的方法涂平板。所有平板均在30～35℃恒温相中培养24小时后计数，计算平均值和标准差。结果见表1和图1。
表1大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的冷藏试验结果(cfu/mL)
Figure BDA0001605339740000031
实施例2.枯草杆菌和铜绿假单胞菌的冷藏试验
稳定剂配方为：终浓度为30％甘油(v/v)、10％血清(v/v)、0.20％亚硫酸钠(w/v)、0.50％亚硫酸氢钠(w/v)溶于pH 8.0的0.50mol/L磷酸缓冲液中(先将磷酸二氢钠和磷酸氢二钾溶于少量水中，加入上述试剂后，再定容)，制成用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂。
将枯草杆菌和铜绿假单胞菌的冻干微球颗粒分别溶于5.5mL上述冷藏保存稳定液中(2～8℃)，使成500cfu/mL的菌悬液，吸取0.1mL涂布于胰酪胨大豆琼脂(TSA)平板上，共涂布5个平板；剩余的5mL菌悬液分装在8个瓶子中，每个瓶子分装0.55ml，密封后放置在冰箱的冷藏室中(2～8℃)，在保存1、3、5、10、15、20、25、30天后分别取出，用同样的方法涂平板。所有平板均在30～35℃恒温相中培养24小时后计数，计算平均值和标准差。结果见表2和图2。
表2枯草杆菌和铜绿假单胞菌的冷藏试验结果(cfu/mL)
Figure BDA0001605339740000041
实施例3.沙门氏菌和大肠杆菌的冷藏试验
稳定剂配方为：终浓度为10％甘油(v/v)、4％血清(v/v)、0.1％亚硫酸钠(w/v)、0.10％亚硫酸氢钠(w/v)溶于pH 7.0的0.2mol/L磷酸缓冲液中(先将磷酸二氢钠和磷酸氢二钾溶于少量水中，加入上述试剂后，再定容)，制成用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂。
将沙门氏菌和大肠杆菌的冻干微球颗粒分别溶于5.5mL上述冷藏保存稳定液中(2～8℃)，使成500cfu/mL的菌悬液，吸取0.1mL涂布于胰酪胨大豆琼脂(TSA)平板上，共涂布5个平板；剩余的5mL菌悬液分装在8个瓶子中，每个瓶子分装0.55ml，密封后放置在冰箱的冷藏室中(2～8℃)，在保存1、3、5、10、15、20、25、30天后分别取出，用同样的方法涂平板。所有平板均在30～35℃恒温相中培养24小时后计数，计算平均值和标准差。结果见表3和图3。
表3沙门氏菌和大肠杆菌的冷藏试验结果(cfu/mL)
Figure BDA0001605339740000051
实施例4.啤酒酵母和白假丝酵母的冷藏试验
稳定剂配方为：终浓度为20％甘油(v/v)、6％血清(v/v)、0.25％亚硫酸钠(w/v)、0.30％亚硫酸氢钠(w/v)溶于pH 7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液中(先将磷酸二氢钠和磷酸氢二钾溶于少量水中，加入上述试剂后，再定容)，制成用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂。
将啤酒酵母和白假丝酵母的冻干微球颗粒分别溶于5.5mL上述冷藏保存稳定液中(2～8℃)，使成500cfu/mL的菌悬液，吸取0.1mL涂布于胰酪胨大豆琼脂(TSA)平板上，共涂布5个平板；剩余的5mL菌悬液分装在8个瓶子中，每个瓶子分装0.55ml，密封后放置在冰箱的冷藏室中(2～8℃)，在保存1、3、5、10、15、20、25、30天后分别取出，用同样的方法涂平板。所有平板均在20～25℃恒温相中培养72小时后计数，计算平均值和标准差。结果见表4和图4。
表4啤酒酵母和白假丝酵母的冷藏试验结果(cfu/mL)
Figure BDA0001605339740000052
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (2)

1.一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂，其特征在于，该稳定剂由磷酸缓冲液、甘油、血清、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠组成，所述磷酸缓冲液、甘油、血清、亚硫酸钠和亚硫酸氢钠按一定的配比形成混合液；于2-8℃下保存微生物菌种；
其中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.05～0.5mol/L，pH为6～8，所述磷酸缓冲液中添加所述甘油、血清、亚硫酸氢钠和亚硫酸钠，其中所述甘油的浓度为5～30％(v/v)，所述血清的浓度为2～10％(v/v)，所述亚硫酸钠的浓度为0.01～0.2％(w/v)，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.05～0.5％ (w/v)。
2.根据权利要求1所述的一种用于微生物菌种冷藏保存的稳定剂，其特征在于，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1～0.3mol/L，pH为6.5～7.5，所述磷酸缓冲液中添加所述甘油、血清、亚硫酸氢钠和亚硫酸钠，其中所述甘油的浓度为7.5～20％(v/v)，所述血清的浓度为4～6％(v/v)，所述亚硫酸钠的浓度为0.25～0.1％(w/v)，所述亚硫酸氢钠的浓度为0.1～0.3％(w/v)。
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