CN108160700A - 一种促进土壤中硝酸盐还原的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，本发明研究显示电压处理之后从阴极到阳极产生了一个电势梯度，使得硝酸盐还原微生物富集，并显著了加强了硝酸盐异化还原成铵和反硝化的过程，终产物为NH4 +和N2。在电压处理下以N2O、N2以及铵根的形式增加的氮含量和以硝酸盐损失的氮含量是相当的。这些结果证实了电势可以通过反硝化以及DNRA加强了土壤中的硝酸盐还原过程。本发明提出了一种有针对性以及环境友好型的技术，以增强作物根部下的微生物硝酸盐还原，从而减少硝酸盐淋失的风险。

Description

一种促进土壤中硝酸盐还原的方法
技术领域
本发明涉及一种促进土壤中硝酸盐还原的方法。
背景技术
一般认为，土壤中氮素发生淋溶损失的主要原因在于，一是土壤中具有以移动性的氮素累积，主要为硝态氮：二是水分的流动。因此在水分管理充分的条件下，控制土壤硝态氮的含量成为控制氮素淋溶损失的主要因素。目前，控制土壤氮素损失的方式主要是在土壤中添加硝化抑制剂，抑制土壤中硝化作用，从而减少硝态氮含量。但硝化抑制剂均为化学物质，容易造成二次污染。
通过加强次土层(除了表层土以下的土壤统称为次土层)硝酸盐还原是一种有效减少地下水硝酸盐污染的方式，但电子供体的缺乏限制了次土层硝酸盐还原。之前的研究表明土壤污泥中的微生物菌株和原生菌群可以使用电子进行硝酸盐还原。迄今为止，仍然缺少电势如何影响土柱中硝酸盐还原的信息。这类信息对于进一步发展原位条件下底土层硝酸盐移除的技术是必不可少的。
发明内容
为了解决上述存在的问题，本申请建立了一种有针对性引入电势的处理方法，从而促进底土中硝酸盐的还原，增强作物根部以下土壤的微生物硝酸盐还原，从而减少硝酸盐淋失的风险。
本发明的目的之一在于提供一种促进土壤中硝酸盐还原的方法。
本发明的另一目的在于提供一种富集土壤中反硝化微生物的方法。
本发明的再一目的在于提供一种促进土壤中硝酸盐异化还原成铵的方法。
本发明的又一目的在于提供一种富集土壤中能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
进一步的，上述电极插入土壤中的深度为2.5cm以上。
进一步的，上述所述土壤样品中含有反硝化微生物和/或能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
一种富集土壤中还原硝酸盐的微生物的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
进一步的，上述电极插入土壤中的深度为2.5cm以上。
进一步的，所述还原硝酸盐的微生物包括反硝化微生物和能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
更进一步的，所述还原硝酸盐的微生物包括Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Alcaligenaceae、Planctomycetaceae、Pseudomonadaceae、Rhodospirillaceae、Comamonadaceae、Ruminococcaceae、Crenarchaeotic Group SCG、Alphaproteobacteria、Comamonadaceae、Mobillitalea、Alcaligenes、Pseudomonas、Azospirillum、Comamonas。
一种提高土壤中反硝化功能基因拷贝数丰度的方法，在含有反硝化微生物的土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
进一步的，所述反硝化功能基因包括基因nirK，nirS和nosZ。
一种促进土壤中硝酸盐异化还原成铵的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
进一步的，所述土壤中含有能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
一种富集土壤中能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
进一步的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
进一步的，所述能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物包括Pseudomonas sps、Citrobacter sp。
本发明的有益效果是：
(1)本发明探索了土壤中电势是怎样去影响硝酸盐还原过程以及其影响的程度，结果发现电压处理之后从阴极到阳极产生了一个电势梯度，使得硝酸盐还原微生物富集，并显著了加强了硝酸盐异化还原成铵和反硝化的过程，终产物为NH4 +和N2。在电压处理下以N2O、N2以及铵根的形式增加的氮含量和以硝酸盐损失的氮含量是相当的。这些结果证实了土壤中的电势可以通过反硝化、DNRA加强硝酸盐还原过程。
(2)本发明方法是一种有针对性以及环境友好型的技术，能够增强作物根部下的微生物硝酸盐还原，从而减少硝酸盐淋失的风险。
附图说明
图1为土壤在-0.5V电势处理下NO3 -(a)、NO2 -(b)、N2O(c)、N2(d)、NH4 +(e)含量以及电流(f)的动态变化图，n＝3；
图2为在施加电压情况下N2O(a)、NH4 +(b)、电势(c)和pH(d)的空间分布(n＝3)；
图3为在施加电压情况下反硝化基因(nirK,nirS and nosZ)(a)、硝酸盐还原微生物纲(b)、科(c)、属(d)的相对丰度(n＝3)，图a柱型图中的不同字母ax、bx、ay表示具有显著差异(P<0.05)；
图4为不同处理组土壤的二维扫描电化学显微镜图(SECM)，(a)、(b)分别为-0.5V电势处理组、对照组的SECM图。
具体实施方式
一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
优选的，上述电极插入土壤中的深度为2.5cm以上。
优选的，上述所述土壤样品中含有反硝化微生物和/或能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
一种富集土壤中还原硝酸盐的微生物的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
优选的，上述电极插入土壤中的深度为2.5cm以上。
优选的，所述还原硝酸盐的微生物包括反硝化微生物和能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
更优选的，所述还原硝酸盐的微生物包括Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Alcaligenaceae、Planctomycetaceae、Pseudomonadaceae、Rhodospirillaceae、Comamonadaceae、Ruminococcaceae、Crenarchaeotic Group SCG、Alphaproteobacteria、Comamonadaceae、Mobillitalea、Alcaligenes、Pseudomonas、Azospirillum、Comamonas。
一种提高土壤中反硝化功能基因拷贝数丰度的方法，在含有反硝化微生物的土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
优选的，所述反硝化功能基因包括基因nirK，nirS和nosZ。
一种促进土壤中硝酸盐异化还原成铵的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
优选的，所述土壤中含有能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
一种富集土壤中能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物的方法，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
优选的，上述阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3～6cm。
优选的，所述能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物包括Pseudomonas sps、Citrobacter sp。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种去除土壤中硝酸盐的方法
本次研究采用土壤采集于中国科学院栾城试验站长时间施加氮肥试验的地区(37.90°北纬,114.67°东经,海拔50m)关于这个站点以及原位实验的细节材料在之前的研究中已经提及。利用Geoprobe在试验区3-3.4m土壤深度采集了5个完整的底土土柱(0.4m长，直径为43mm)。然后，在使用之前将这些底土土柱混合并置于4℃下保存。土壤粘粒粒、粉粒以及砂粒含量分别为7.3％，79.8％以及12.3％。土壤有机质含量、pH、硝酸盐以及可溶解性有机碳浓度分别为1.9g kg-1、7.9、31.3mg kg-1NO3 -—N、4.1mg kg-1。
(1)将采集的底土土芯(底土土芯为代表根部以下区域，用于研究促进作物根部以下微生物的硝酸盐还原)，土芯深度为3.0-3.4米，混合并置于4℃条件下保存以供未来适用。将采集的66份50g原位底土(烘干重量相当，未过筛)被加入150ml玻璃反应器中。每个反应器中加入10mL 25mM硝酸盐溶液，混匀。
(2)将一块石墨板阳极、一块石墨板阴极(2×3×4cm)以及一个饱和甘汞电极(SCE)插入进上步混匀后的土壤中，深度为2.5cm，阴极和阳极之间的距离为3.5cm。
(3)用橡胶塞和旋转盖将玻璃反应器密封，将三根细金属线插进每个反应器的隔膜中并连接阴极、阳极以及参比电极(甘汞电极SCE)。反应器连续五次交替进行抽气(0.1kpa)置换为高纯度的氦气(99.9999％，120KPa)过程(根部以下土壤含氧量极低，几乎为厌氧条件，为了模拟该情况，故使用惰性气体氦气将瓶中的含有氧气的空气置换)。在最后一次充满氦气之后将顶空空气调节为101.3Kpa(该压强调为了保持反应器内压强和空气压强一致)。在准备好的反应器中随机挑选33个，将每个反应器上的三根铁线和多通道恒电位仪进行连接。阴极施加-0.5v的电势(-0.5v处理组)，剩下的33个反应器不与电位仪连接(CK处理组)。
(4)所有的反应器均放置于30℃处理观察70h，在处理开始的0,5,10,25,30,35,50,55,60以及70h的时间点上，在-0.5v处理组和CK处理组中分别随机选取3个反应器。利用自动采样分析系统对反应器的顶空进行取样测定N2O以及N2浓度。然后，对土壤中的NH4 +，NO3 -以及NO2 -含量进行分析。在70h的时间点剩下的三个反应器用来测定以下指标：微生物群落结构的空间分布；nirK、nirS以及nosZ基因的丰度；溶解N2O以及NH4 +含量；从阴极到阳极方向上的微生物导电性分泌物浓度。
相应指标的测定方法
1.土壤中NH4 +,NO3 -,和NO2 -含量的测定方法
在顶空气体中的N2O和N2浓度被测定之后，利用1M KCl对土中的矿物质氮进行浸提，并分别用靛酚蓝比色法、双波长分光光度法以及亚硝酸盐分光光度比色法对其中的NH4 +,NO3 -，以及NO2 -进行测定。
2.测定NH4 +、可溶性N2O浓度、pH、微生物群落结构以及反硝化基因丰度从阴极到阳极土壤方向上的空间分布的方法
在培育的最后，用N2O微电极和pH微电极分别对土壤从阴极到阳极方向上的可溶解性N2O浓度和pH的空间分布进行测定。将微传感器插入土壤1cm的深度，通过传感器追踪软件在电脑上对数据进行记录。
在对溶解性N2O浓度以及pH进行测定之后，将阳极和阴极之间的土壤分为三个部分(距离阴极0-1,1-2,2-3cm).然后，每块再一分为二：一部分用KCl浸提，通过靛酚蓝比色法测定NH4 +浓度；另一部分用来提取DNA并对微生物群落结构以及nirK,nirS和nosZ基因拷贝数进行测定。
反应器中剩下的土壤拿来冷冻干燥，通过扫描电化学显微镜(SECM)对导电化合物丰度进行定性测量。关于SECM的理论细节已经在之前的研究中提及。将冷冻干燥的土样沉积在碳双面导电带上。与参考电极(饱和甘汞电极)相比探头电位偏差0.2V左右，电解质是100mM K3Fe(CN)6和0.1M NaOH混合溶液；以20μm/s的扫描速度进行。
总细菌DNA是利用Soil DNA Kit试剂盒进行提取，然后进行测序检测。在用NanoDrop对提取的DNA进行质量和数量检查之后被分为两部分。一部分所提取的DNA通过16S rRNA基因测序分析微生物群落结构，另一本分则用来测定nirK，nirS和nosZ基因丰度。
为了进行微生物群落结构分析，用515f/806r引物：515f:5'-GTG CCA GCM GCCGCG GTA A-3'(SEQ ID NO：1)、806r:5'-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3(SEQ ID NO：2)对提取的DNA进行扩增。微生物群落结构分析在之前的研究中已经详细介绍过。nirK，nirS和nosZ基因丰度则是分别通过引物进行定量，细节在Liu等人的研究中已经介绍过。
结果：
一、土壤经电势处理前后NO3 -、NO2 -、NH4 +、N2O、N2的含量变化
相较于未处理组，-0.5V电势处理显著增加了土壤中的铵根离子、N2以及N2O浓度，但是降低了硝酸盐浓度(图1)。由于生成亚硝酸盐、N2、N2O以及铵根离子而损失的氮量(191.4μmol N/瓶)和在施加电压情况下损失的硝态氮量(175.0μmol N/瓶)数量相当(表1)。这些结果证实了电势能够通过反硝化以及DNRA过程显著地加强土壤NO3 -还原。在-0.5v处理组终产物中由NO3 --N还原成的N2-N、NH4 +-N、NO2 --N、N2O-N分别占总NO3 -N的百分比为70％、23.9％、6％、0.4％(表1)，表明大部分的硝酸盐都被还原成为了对环境友好型低危害的形式。
表1土壤在施加电势处理前与处理前与处理70h后反应器中NO3 -、NO2 -、NH4 +、N2O、N2平均含量的变化情况(n＝3)
注：-0.5V：表示土壤用-0.5V电势处理，CK:表示土壤未用电势处理；％表示由NO3 --N还原成的NO2 --N、NH4 +-N、N2O-N、N2-N分别占总NO3 -N的百分比。
二、土壤经电势处理后N2O、NH4 +、电势和pH的空间分布
土壤经电势处理后，从阴极到阳极方向上，电势逐渐降低(图2)，表明电子的微生物可利用性下降。电子供体的可利用性显著影响硝酸盐还原的终产物，本发明发现，根据从阳极到阴极方向上溶解性N2O的升高以及铵根离子浓度的下降趋势现象表明阳极附近的硝酸盐更趋向于还原成N2O，而阴极附近的硝酸盐则更有可能还原为铵根离子(图2)。
三、土壤经电势处理后反硝化基因、硝酸盐还原微生物相对丰度的变化
-0.5v处理也显著增加了经典硝酸盐还原微生物的相关丰度，包括反硝化微生物和能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物，如Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria(图3-(b))，如Alcaligenaceae、Planctomycetaceae、Pseudomonadaceae、Rhodospirillaceae、Comamonadaceae、Ruminococcaceae、Crenarchaeotic Group SCG(图3-(c))，如Alphaproteobacteria、Comamonadaceae、Mobillitalea、Alcaligenes、Pseudomonas、Azospirillum、Comamonas(图3-(d))。
电势还显著地增加了反硝化基因nirK,nirS and nosZ基因拷贝数，见图3-(a)。在阴极到阳极方向上，nosZ拷贝数的数量明显降低，这也是溶解性N2O浓度上升的主要原因。
扫描电化学显微镜(SECM)对导电化合物丰度进行定性测量检测的结果还表明电势处理能够增强电活性硝酸盐还原微生物的生长情况，从而诱导其分泌出导电化合物(图4)。
综上所述，相较均质土壤泥浆，土壤环境具有明显较低的电导率。本发明在土壤环境中施加一个电压处理，可以使得阴极向阳极的方向产生一个电势梯度，土壤中的从阴极到阳极的电势梯度有希望造成硝酸盐还原途径以及终产物的多样性。电势处理可以增强土壤环境中的硝酸盐还原，使得阴极附近主要发生DNRA过程，能够发生DNRA反应的微生物得到显著富集；而阳极附近则主要是反硝化过程，反硝化微生物得到显著富集。上文中对有电压施加处理的土壤在阴极到阳极的方向上以及未处理土壤实时动态监测土壤N2O、N2产生以及硝酸盐、亚硝酸盐以及铵根浓度，还有微生物群落结构的空间差异、反硝化基因的丰度以及可溶解性N2O和NH4 +浓度的检测数据证实了这一结论。
上述结果表明通过施加电势使土壤从阴极到阳极的方向上产生一段电压梯度。在这个电压梯度下硝酸盐还原微生物被富集，终产物主要为N2和铵根离子。这些结果表明电势处理是一种对于植物根基区域硝酸盐还原以及防止地下水硝酸盐污染方面具有针对性的环境友好型的技术。
实施例2一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，
将阴极电极、阳极电极分别插入土壤样品中，电极插入土壤中的深度为3cm，阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为3cm，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.3V电势，在该电势条件下对土壤进行处理即可。
实施例3一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，
将阴极电极、阳极电极分别插入土壤样品中，电极插入土壤中的深度为4cm，阴极电极、阳极电极在土壤中的距离为6cm，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7V电势，在该电势条件下对土壤进行处理即可。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，其特征在于，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述土壤样品中含有反硝化微生物和/或能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
4.一种富集土壤中还原硝酸盐的微生物的方法，其特征在于，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述还原硝酸盐的微生物包括反硝化微生物和能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述还原硝酸盐的微生物包括Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria、Alphaproteobacteria、Alcaligenaceae、Planctomycetaceae、Pseudomonadaceae、Rhodospirillaceae、Comamonadaceae、Ruminococcaceae、Crenarchaeotic Group SCG、Alphaproteobacteria、Comamonadaceae、Mobillitalea、Alcaligenes、Pseudomonas、Azospirillum、Comamonas。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，施加电势的方法为：将阴极电极、阳极电极分别插入土壤中，在电压作用下，使阴阳电极之间产生-0.7～-0.3V电势。
8.一种提高土壤中反硝化功能基因拷贝数丰度的方法，其特征在于，在含有反硝化微生物的土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势。
9.一种促进土壤中硝酸盐异化还原成铵的方法，其特征在于，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势，所述土壤中含有能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
10.一种富集土壤中能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物的方法，其特征在于，在土壤样品中施加-0.7～-0.3V电势，所述土壤中含有能够将硝酸盐异化还原成铵的微生物。
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