CN108152095A - 菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品及其制备方法，属于分析化学技术领域。将含有α‑六六六、β‑六六六、γ‑六六六、δ‑六六六的农药喷施到菠菜叶片上，采集叶片，经均质匀浆，真空冷冻干燥，过筛装瓶封装，得到含有四种六六六农药的菠菜标准样品。该方法制得的标准样品为实物标准样品，均匀稳定，无防腐剂及抗氧化剂，易保存，使用方便，水化后净化方法与日常分析样品相同，可用于六六六类农药残留测试项目的能力验证、检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量控制与考核。

Description

菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品及其制备方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，涉及一种农药残留的自然基体标准样品的制备，具体地说，涉及一种菠菜中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六残留基体冻干粉标准样品及其制备方法与应用。

背景技术

六六六(六氯环己烷)为有机氯广谱杀虫剂，六氯环己烷有8种同分异构体，分别称为α、β、γ、δ、ε、η、θ和ξ，具有胃毒、触杀和熏蒸三种作用方式。效力强而持久，属高残留农药品种。由于六六六用途广泛、制造容易、价格便宜，20世纪50-60年代在全世界广泛生产和使用，但由于其对环境污染过于严重，目前很多国家和地区已经禁止使用。

由于六六六化学性质较稳定，在自然环境中降解缓慢，通过空气、土壤、地下水等渠道富集于植物上，使得植物源性食品受到污染的风险依然较高，仍需长期进行监测。

在食品安全检测体系中，标准样品对整个检测质量控制体系起到核心作用。目前，用于六六六类药物残留检测的主要是纯标准品，检测质量控制主要是通过向样品中添加纯的标准品后进行检测分析，这种分析方法无法代表目标分析物在植物基体内真正存在的状态，不能真实地重现药物在植物内部和外表富集的提取效率，无法反映方法的准确性。由于目标物和基体结合情形与真实检测样品不完全一致而导致提取、净化等处理结果与日常分析样本存在较大差异，从而影响结果的可靠性和有效性。另外，一般标准样品前期制备过程中添加有维生素C等抗氧化剂，导致标准样品在后期的相关药物残留检测分析等的应用过程中对实验结果造成干扰和影响。

发明内容

为了解决现有技术中六六六类药物残留检测不能真实地重现药物经过根茎叶的自然吸收和富集的提取效率，无法反映方法的准确性，影响结果的可靠性和有效性，且存在抗氧化剂影响使用结果的技术问题，本发明的一个目的是提供菠菜中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六标准样品的制备方法与应用。本发明的另一个目的是提供本方法制备的菠菜中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六标准样品。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是：菠菜中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)、选择田间生长的菠菜，人工喷洒含有α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的乳浊液；

B)、施药结束后，收割鲜菠菜，洗净、去根、粉碎、均质、真空冷冻干燥得到粗样；

C)、研磨步骤B所述粗样，过筛，得到菠菜冻干粉标准样品；

D)、封装所述标准样品，冷藏保存；

E)、检验所述标准样品的均匀性和稳定性；

F)、对所述标准样品中的α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六含量进行定值。

所述步骤A中实验材料的选择：田间选择长势良好的生长周期20天-35天的菠菜，喷药前一天不浇水。

所述步骤A中含有四种六六六同分异构体的乳浊液浓度为(5-50)％wt。

所述步骤A中喷洒含有六六六的乳浊液的天气条件为：施药当天及施药后3天应无雨，上午10时叶面平均温度为25℃，波动温度18-32℃。施药量为每亩50-400g，施药两次，间隔时间为5-20天。

所述步骤B中的收割时间为停药后的5-20天。真空冷冻干燥条件为：预冷冻阶段：-80℃--30℃，相应预冷时间0.5-10h；真空冷冻阶段：压力控制在0.01-1.0mbar，相应时间8-15h；干燥升华阶段：-10℃-30℃，相应时间2-10h。

所述步骤C中过筛的目数为30～80目。

所述步骤D中所用瓶子为带有铝箔垫片的白色聚乙烯塑料瓶，每瓶装20g冻干粉，电磁感应封盖，2-8℃冷藏保存。

所述制备的标准样品中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的含量为0.005-1.0mg/kg。

本发明的显著优点是：

1)给田间生长的菠菜喷洒含有α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六，选择适当时机，收割，去根后，将菠菜匀浆制成菜泥，冷冻干燥，过筛，分装密封包装；

2)均匀性检验、稳定性研究和协作定值检测，通过施药控制和采集时机的选择可获得预期含量的α-六六六、β-六六六、、γ-六六六、δ-六六六阳性材料；

3)本发明的产品可以在常温下运输，保质期长，目标物和基体结合情形与真实检测样品一致，标准样品为实物标准样品，均匀稳定，无防腐剂及抗氧化剂，易保存，用于六六六药物残留测试项目的能力验证、检测方法的验证、测试仪器的校准、测试结果的质量控制与考核。

附图说明

图1是标准样品制备工艺流程图。

图2是α-六六六的结构式。

图3是β-六六六的结构式。

图4是γ-六六六的结构式。

图5是δ-六六六的结构式。

图6是本发明的标准样品的气相色谱谱图。

具体实施方式

如图1所示，本发明的菠菜中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六标准样品的制备方法，包括以下步骤：A)施药；B)取样、去杂质、匀浆；C)真空冷冻干燥；D)研磨、筛分、混样、封装；E)均匀性和稳定性检验；F)确定α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六含量。

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

一种菠菜中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六标准样品的制备方法，其具体步骤如下：

(1)选择田间生长的菠菜：犁头菠播种育苗，选择田间长势良好的生长周期25天的菠菜，喷药前一天不浇水。

施药：用含有四种六六六同分异构体的乳浊液(浓度为12％wt)上午10时施药，施药量为每亩300g，间隔时间10天，再次施药。

(2)第二次施给药10日后，收割鲜菠菜，洗净、去根、粉碎、均质制成菜泥。

(3)真空冷冻干燥：采用真空冷冻干燥机(CHRiST Epsilon 2-6D)进行冷冻干燥，物料厚度2cm，-50℃预冷冻6h，0.1mbar真空冷冻10h，-10℃-30℃快速升温干燥8h，直至完全干燥，得到六六六阳性冻干粗粉；

(4)研磨、过筛：冻干粉用中药粉碎机粉碎，组织研磨机细磨，过30目筛，取筛下部分；

(5)分装及保存：用带有铝箔垫片的白色聚乙烯塑料瓶分装，每瓶装20g冻干粉，电磁感应封盖，2℃冷藏保存。

采用气相色谱法检测实施例1制备的样品，结果如图2所示，证实标准样品中含有α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六。

实施例2

本实施例中重复实施例1中的制备过程，不同的实验条件为：

1)选择田间生长35天的菠菜；

2)四种六六六同分异构体的乳浊液的浓度为5％wt；

3)施药量为每亩50g；

4)两次施药时间间隔为5天；

5)第二次给药5天后收割；

6)-80℃预冷冻0.5h，0.01mbar真空冷冻8h，快速升温干燥2h；

7)过50目筛；

8)5℃冷藏保存。

实施例3

本实施例中重复实施例1中的制备过程，不同的实验条件为：

1)选择田间生长30天的菠菜；

2)四种六六六同分异构体的乳浊液的浓度为20％wt；

3)施药量为每亩150g；

4)两次施药时间间隔为15天；

5)第二次给药15天后收割；

6)-30℃预冷冻10h，1.0mbar真空冷冻15h，快速升温干燥10h；

7)过80目筛；

8)8℃冷藏保存。

实施例4

对实施例1中样品进行均匀性与稳定性检验：

1.均匀性检验

采用单因素方差分析方法进行均匀性检验，随机抽取12瓶实施例1制备的样品，每瓶样品平行测定2次。所有试料以随机次序在重复性条件下测试，即在同一实验室中由相同的人员使用相同的测试方法和仪器在较短时间内测试。

测试方法：称取1.0g样品，加4.0ml水还原15min，按SN/T 0159-2012出口水果中六六六、滴滴涕、艾氏剂、狄氏剂、七氯残留量测定气相色谱法进行检测。

采用以下单因素方差分析进行均匀性评价。

抽取i个样品(i＝1、2、3、…m)，每个样品在重复条件下测试j次(j＝1、2、3、…n)。

每个样品的测试平均值

全部样品测试的总平均值

测试总次数

样品间平方和均方

样品内平方和均方

自由度f₁＝m-1

f₂＝N-m

统计量

均匀性检测结果及评价见表1。

表1实施例1制备的样品均匀性检测结果

单位：mg/kg

表2实施例1制备的样品均匀性检测统计分析

以上结果可知：当α＝0.05，f₁＝11，f₂＝12,查F分布表，F临界值为2.72，因F统计值(1.79、1.52、1.34、1.87)<F临界值2.72，表明样品内及样品间无显著性差异，说明样品是均匀的，能够满足质控等实验要求。

采用相同方法，验证实施例2制得的标准样品的均匀性，以α-六六六、β-六六六、、γ-六六六、δ-六六六分别统计，F比为1.98、2.31、1.78、2.51；验证实施例3制得的标准样品的均匀性，以α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六分别统计，F比为2.02、1.97、2.18、2.54。F比均小于F临界值2.72，表明实施例2、3制得的标准样品样品内及样品间无显著性差异，说明样品是均匀的，能够满足质控等实验要求。

2.稳定性检验

2.1长期稳定性检验

按照时间间隔前密后疏的抽样原则，分别按下列时间随机抽取用于稳定性测试的包装好的实施例1制备的样品：第0、2、4、6、9、12、18月。每次抽取3个样品进行测试。在全部稳定性测试中，所用人员、仪器、测试方法和实验室均与均匀性测试相同。结果及统计分析如表3所示。

用线性拟合模型评估标准样品的稳定性，以X代表时间，Y代表标准样品中目标药物的含量，斜率b₁用下式计算：

斜率的估计值：

截距的估计值：

直线上每点的标准偏差公示：

与斜率相关的不确定度：

当|b₁|＜t_0.95,n-2·s(b₁)，表明斜率变化不显著，即标准样品是稳定的。

表3样品长期稳定性检查及统计分析

单位：mg/kg

自由度为n-2和p＝0.95(95％置信水平)的分布即t_0.95,(n-2)＝2.57,由于|b₁|＜t_0.95,n-2·s(b₁)，故斜率不显著的，即未观测到不稳定性，验证实施例1制得的标准样品的稳定性良好。

2.2短期稳定性检验

短期稳定性检验：即考察标准样品在运输条件下的稳定性，采用快递方式运输标准样品，大部分地区3-4天都能收到样品，极个别的地方9天之内也能送达。运输时，将样品放置于隔热泡沫塑料箱中然后置冰块一起运输。运输时，将样品放置于隔热泡沫箱中然后置冰块一起运输。随机抽取冷藏保存的样品6瓶，用特快专递于8月中旬寄到新疆乌鲁木齐，到达乌鲁木齐后原封再寄回大连，同样方式随机抽取冷藏保存的样品6瓶，用特快专递于12月中旬寄到黑龙江漠河，到达漠河后原封再寄回大连。样品寄出到寄回所有时间为10d。对寄回的样品(运输后样品)采用SN/T 0159-2012方法进行检测，并与未经运输的样品(运输前样品)作比对分析实验。

用t检验法对运输前后样品的测定值进行一致性检验，检验公式为：

统计量t计算：

计算出t实验，与比较，如果t实验小于临界值，则认为该标准样品的特性量值没有发生显著性变化，否则认为有显著性差异。结果见表4。

表4样品短期稳定性检验结果及统计分析

从表4可以得出，t_实验值均小于查表值(2.228)，表明该标准样品的特性量值运输前后的测定值具有一致性。验证实施例1制得的标准样品的短期稳定性良好。

采用上述相同方法，验证实施例2、3制得的标准样品的稳定性，斜率均不显著，未观测到实施例2、3制得的标准样品不稳定性，结果表明实施例2、3制得的标准样品稳定性良好。

实施例5

标准样品中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六含量的定值：

八家实验室采用气相色谱方法对实施例1制备的标准样品进行协同定值。对经过均匀性和稳定性检验合格的样品，随机抽取40瓶，分别分发到8家参加定值的实验室进行检测，结果见表5。8个实验室的定值数据采用夏皮罗－威尔克(Shapiro－Wilk)检验法考察其正态性。在近似符合正态性的前提下，再经Grubb’s法检验确认每个实验室数据是否存在异常值，用科克伦(Cochran)检验各实验室定值数据是否等精度，结果表明所有的数据均通过检验，各实验室测试精度一致。

表5合作定值实验室测试结果

单位：mg/kg

Claims (9)

1.一种菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)选择田间生长的菠菜，人工喷洒含有α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的乳浊液；

B)施药结束后，收割鲜菠菜，洗净、去根、粉碎、均质、真空冷冻干燥得到粗样；

C)研磨步骤B所述粗样，过筛，得到菠菜冻干粉标准样品；

D)封装所述标准样品，冷藏保存；

E)、检验所述标准样品的均匀性和稳定性；

F)对所述标准样品中的α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六含量进行定值。

2.如权利要求1所述菠菜中四种六六六农药残留标实物准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤A中实验材料的选择：田间选择长势良好的生长周期20天-35天的菠菜，喷药前一天不浇水。

3.如权利要求1所述菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品的制备方法，其特征在于，所述含有四种六六六同分异构体的乳浊液浓度为(5-50)％wt。

4.如权利要求1所述菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤喷洒含有六六六的乳浊液的天气条件为：施药当天及施药后3天应无雨，上午10时叶面平均温度为25℃，波动温度18-32℃。

5.如权利要求1所述菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品的制备方法，其特征在于，施药量为每亩50-400g，施药两次，间隔时间为5-20天。

6.如权利要求1所述菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品的制备方法，步骤B中的收割时间为停药后的5-20天；真空冷冻干燥条件为：预冷冻阶段：-80℃～30℃，相应预冷时间0.5-10h；真空冷冻阶段：压力控制在0.01-1.0mbar，相应时间8-15h；干燥升华阶段：-10℃-30℃，相应时间2-10h。

7.如权利要求1所述菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤C中过筛的目数为30～80目。

8.如权利要求1所述菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品的制备方法，其特征在于，所述步骤D中所用瓶子为带有铝箔垫片的白色聚乙烯塑料瓶，每瓶装10g冻干粉，电磁感应封盖，2-8℃冷藏保存。

9.一种权利要求1-8任一所述制备方法制备的菠菜中四种六六六农药残留实物标准样品，其特征在于，所述制备的标准样品中α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六的含量为0.005-1.0mg/kg。