CN108138145A - 用于治疗视网膜疾病的光感受器的制备 - Google Patents

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CN108138145A CN201680058805.9A CN201680058805A CN108138145A CN 108138145 A CN108138145 A CN 108138145A CN 201680058805 A CN201680058805 A CN 201680058805A CN 108138145 A CN108138145 A CN 108138145A
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Abstract

公开了一种产生光感受器的方法。还公开了包含光感受器的细胞群及其用途。

Description

用于治疗视网膜疾病的光感受器的制备
技术领域
本发明在其一些实施方式中涉及从多能干细胞制备光感受器的方法。
背景技术
包括色素性视网膜炎和年龄相关性黄斑变性的各种眼部疾病的特征在于光感受器细胞的丧失，导致失明。一旦光感受器退化，细胞替代或假体装置是唯一的治疗选择。光感受器细胞替代已被证明是可行的，甚至是在成熟小鼠中，其中被移植到视网膜下空间的光感受器整合到视网膜中并发挥功能(MacLaren等，2006)。已经开发了用于从人胚胎干细胞获得视网膜祖细胞和光感受器的若干方案(2D和3D)(Osakada等，2008；Meyer等，2009和2011；Nakano等，2012；Gonzalez-Cordero等，2013；Zhong等，2014)。
另外的背景技术包括WO2013/114360、WO2008/129554和WO2013/184809。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其包括：
(a)在包含分化剂的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化细胞；
(b)在包含含有TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基的培养系统中培养所述分化细胞，由此产生包含视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器的混合细胞群；
(c)富集所述混合细胞群中的所述光感受器以产生光感受器富集细胞群；和
(d)向所述受试者施用治疗有效量的所述光感受器富集细胞群，由此治疗所述视网膜疾病。
根据本发明的一个方面，提供了一种产生光感受器的方法，其包括：
(a)在包含分化剂的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化细胞；
(b)在包含含有TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基的培养系统中培养所述分化细胞，由此产生包含视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器的混合细胞群；
(c)富集所述混合细胞群中的所述光感受器以产生光感受器富集细胞群；和
(d)扩增所述光感受器富集细胞群。
根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者的视网膜疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的光感受器群，由此治疗所述视网膜疾病或病症。
根据本发明的一个方面，提供了治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其包括：
(a)在包含分化剂的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化细胞；
(b)在包含含有TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基的培养系统中培养所述分化细胞，由此产生包含视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器的混合细胞群，其中所述混合细胞群的至少10％是光感受器；和
(c)向所述受试者施用治疗有效量的所述混合细胞群，由此治疗所述视网膜疾病。
根据本发明的一个方面，提供了如本文所述产生的光感受器群。
根据本发明的实施方式，步骤(c)通过机械分离进行。
根据本发明的实施方式，所述富集细胞群中所有所述细胞的少于80％是RPE细胞。
根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(a)之前扩增所述人多能干细胞。
根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(c)之后且步骤(d)之前扩增所述光感受器群。
根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(c)之后且步骤(d)之前冷冻保存所述光感受器。
根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(d)之后冷冻保存所述光感受器。
根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(b)之后且步骤(c)之前冷冻保存所述混合细胞群。
根据本发明的实施方式，所述冷冻保存是在选自90％人血清/10％DMSO、CryoStor10％、CryoStor 5％、CryoStor 2％、Stem Cell banker和PrimeFreezIS的介质中进行。
根据本发明的实施方式，所述人多能干细胞包含人胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。
根据本发明的实施方式，所述分化剂包含烟酰胺。
根据本发明的实施方式，步骤(a)的所述培养基不含激活素A(activin A)。
根据本发明的实施方式，所述TGFβ超家族的所述成员选自TGFβ1、TGFβ3和激活素A。
根据本发明的实施方式，步骤(b)的所述培养基包含烟酰胺和激活素A。
根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(b)之后且步骤(c)之前，在包含烟酰胺且不含激活素A的培养基中培养所述光感受器的步骤。
根据本发明的实施方式，步骤(a)是在非粘附条件下进行。
根据本发明的实施方式，所述非粘附条件包括非粘附培养板。
根据本发明的实施方式，所述非粘附条件包括非粘附基底。
根据本发明的实施方式，步骤(a)包括：
i)在不存在激活素A的情况下，在非粘附条件下，在包含烟酰胺的培养基中培养所述培养的人多能干细胞群以产生包含分化细胞的细胞簇；和随后
ii)在不存在激活素A的情况下，在粘附条件下，在包含烟酰胺的培养基中培养(i)的所述分化细胞。
根据本发明的实施方式，所述方法还包括在步骤(ii)之前解离所述细胞簇以产生细胞的团块或细胞的单细胞悬浮液。
根据本发明的实施方式，所述步骤(a)进行至少一天。
根据本发明的实施方式，所述步骤(b)进行至少一天。
根据本发明的实施方式，所述培养的至少一部分是在其中气氛氧水平小于约10％的条件下进行。
根据本发明的实施方式，所述培养是在其中气氛氧水平大于约10％的条件下进行。
根据本发明的实施方式，所述人多能干细胞是在饲养细胞上扩增。
根据本发明的实施方式，所述饲养细胞包含人脐带成纤维细胞。
根据本发明的实施方式，所述移植是在眼睛的视网膜下空间处进行。
根据本发明的实施方式，所述细胞在悬浮液中被移植，或作为固定在基质或基底上的单层细胞移植。
根据本发明的实施方式，所述视网膜疾病或病症选自以下中的至少一种：色素性视网膜炎、利伯氏先天性黑朦、遗传性或获得性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、Best病、视网膜脱离、回旋形萎缩、无脉络膜症、模式营养不良、RPE营养不良、斯特格氏病、由于由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或创伤性损伤中的任一种导致的损伤造成的RPE和视网膜损伤。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实施方式的实施或测试中可以使用与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料，但是下文描述了示例性的方法和/或材料。如果发生冲突，则以包括定义的专利说明书为准。另外，材料、方法和实例仅是说明性的，并非旨在必然是限制性的。
附图说明
本文中仅作为实例参照附图描述本发明的一些实施方式。现在详细地具体参照附图，强调的是所示详情是作为实例，并且是出于说明性地论述本发明的实施方式的目的。就此而言，说明书连同附图使得如何可以实施本发明的实施方式对于本领域技术人员而言是明显的。
在附图中：
图1A-B是RPE生产过程(图1A)和光感受器生产过程(图1B)以及过程中控制点(黄星，过程中控制，IPC 1-11)的概要。NUTS加，含有bFGF和TGFβ的Nutristem培养基；NUTS减，不含bFGF和TGFβ的Nutristem培养基；NIC，烟酰胺。
图2A-F是说明在用烟酰胺和激活素A分化hESC之后Chx10(图2A)、Nr1(图2B)、视紫红质(图2C)、Rax(图2D)、MITF(图2E)和恢复蛋白(图2F)的上调的表达的图。图2E说明MITF相对表达在RPE扩增期间增加，如所预期的。M4，模拟4；QC，过程中质量控制；HAD102c：HAD-C102hESC；huRPE：人胚胎RPE(商业的，ScienCell)；M4-QC1：手动传代后的模拟4HAD-C 102-hESC；M4-QC2：胶原酶传代后的HAD-C 102-hESC；M4-QC4：采用烟酰胺激活素A 2周后的模拟4细胞；M4-QC5：在采用烟酰胺和激活素A的分化阶段结束时的模拟4细胞；M4-QC8：传代P0(1个扩增循环)时的模拟4细胞；M4-QC11：冷冻保存后的传代P2时的模拟4细胞(药物产品)。
图3A-D是说明在用烟酰胺和激活素A分化hESC后Chx10(图3A)、Nr1(图3B)、MITF(图3C)和视紫红质(图3D)的上调的图。M5，模拟5；QC，过程中质量控制；HAD102c：HAD-C102hESC；huRPE：人胚胎RPE(商业的，ScienCell)；M5-QC1：机械扩增后的模拟5HAD-C 102-hESC；M5-QC5：在采用烟酰胺和激活素A的分化阶段结束时的模拟5细胞；M5-QC8：传代P0(1个扩增循环)时的模拟5细胞；M5-QC11：冷冻保存后的传代P2时的模拟5细胞(药物产品)。
图4是说明用于评估视网膜标志物的探针的特异性的图。
具体实施方式
本发明在其一些实施方式中涉及从多能干细胞制备光感受器细胞的方法。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解，本发明在其应用中不一定限于以下描述中阐述的或实施例所示例的细节。本发明能够具有其他实施方式或以各种方式实施或执行。
已经提议人胚胎干细胞作为用于产生视网膜细胞(包括视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器)的细胞来源。
美国专利号8,956,866提供了用于使用包括烟酰胺和激活素A的多种因子，使用定向分化方法产生RPE细胞的方法。
本发明人现在已经证明，使用美国专利号8,956,866中公开的方法，以及获得RPE细胞，获得光感受器是可能的。这样的光感受器可用于治疗无数的视网膜病症。
因此，根据本发明的第一方面，提供了一种产生光感受器的方法，其包括：
(a)在包含分化剂的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化细胞；
(b)在包含含有TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基的培养系统中培养分化细胞，由此产生包含视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器的混合细胞群；
(c)富集混合细胞群中的光感受器以产生光感受器富集细胞群；和
(d)扩增光感受器富集细胞群。
如本文所用的术语“光感受器”是指能够进行光转导的生物细胞。本发明的这个方面的光感受器可以是杆和/或锥。优选地，当在眼内移植时，它们表现出与天然光感受器相似的功能活性。
根据一个实施方式，光感受器细胞表达光感受器细胞的至少一种、两种、三种或四种标志物。这样的标志物包括但不限于CHX10/VSX2(视觉系统同源框2)、视紫红质、CRX、抑制蛋白(Arrestin)、视蛋白、恢复蛋白和NRL(神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白)。
根据又一个实施方式，光感受器细胞能够治疗诸如黄斑变性的疾病。
在上下文允许时可互换使用的“视网膜色素上皮细胞”、“RPE细胞”、“RPE”是指具有功能上类似于形成视网膜的色素上皮细胞层的天然RPE细胞的细胞类型的细胞类型的细胞(例如，在眼内移植后，它们表现出与天然RPE细胞的功能活性类似的功能活性)。
根据一个实施方式，RPE细胞表达成熟RPE细胞的至少一种、两种、三种、四种或五种标志物。这样的标志物包括但不限于CRALBP、RPE65、PEDF、PMEL17、Bestrophin、ZO-l和酪氨酸酶。任选地，RPE细胞还可以表达RPE祖细胞的标志物，例如MITF。在另一个实施方式中，RPE细胞表达PAX-6。在另一个实施方式中，RPE细胞表达视网膜祖细胞的至少一种标志物，包括但不限于Rx、OTX2或SIX3。任选地，RPE细胞表达SIX6和/或LHX2。
如本文所用，短语“成熟RPE细胞的标志物”是指相对于非RPE细胞或未成熟RPE细胞，在成熟RPE细胞中升高(例如至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如蛋白质)。
如本文所用，短语“RPE祖细胞的标志物”是指相对于非RPE细胞，在RPE祖细胞中升高(例如至少2倍、至少5倍、至少10倍)的抗原(例如蛋白质)。
根据另一个实施方式，RPE细胞具有与形成视网膜的色素上皮细胞层的天然RPE细胞的形态类似的形态，即色素的(pigmented)并具有特征性多边形形状。
根据又一个实施方式，RPE细胞能够治疗诸如黄斑变性的疾病。
根据又一个实施方式，RPE细胞满足本文上文列出的要求中的至少1项、2项、3项、4项或全部。
如本文所用，短语“干细胞”是指能够在培养物中保持为未分化状态(例如，多能(pluripotent)或多能(multipotent)干细胞)延长的时间段，直至被诱导分化成具有特定、专门功能的其它细胞类型(例如完全分化的细胞)的细胞。优选地，短语“干细胞”包括胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)、成体干细胞、间充质干细胞和造血干细胞。
根据一个特别实施方式，光感受器细胞由多能干细胞(例如ESC或iPSC)产生。
诱导多能干细胞(iPSC)可以通过体细胞的遗传操作从体细胞产生，例如通过用转录因子(如Oct-3/4、Sox2、c-Myc和KLF4)逆转录病毒地转导体细胞(如成纤维细胞、肝细胞、胃上皮细胞)[Yamanaka S，Cell Stem Cell.2007，1(1)：39-49；Aoi T等，Generation ofPluripotent Stem Cells from Adult Mouse Liver and Stomach Cells.Science.2008年2月14日(印刷前的Epub)；IH Park、Zhao R、West JA等，Reprogramming of humansomatic cells to pluripotency with defined factors.Nature 2008；451：141-146；KTakahashi、Tanabe K、Ohnuki M等，Induction of pluripotent stem cells from adulthuman fibroblasts by defined factors.Cell 2007；131：861-872]。其他胚胎样干细胞可以通过核转移到卵母细胞、与胚胎干细胞融合、或核转移到合子中(如果受体细胞在有丝分裂中被停止)产生。另外，可以使用非整合方法产生iPSC，例如使用小分子或RNA。
短语“胚胎干细胞”是指能够分化成全部三种胚胎胚层(即内胚层、外胚层和中胚层)的细胞或保持为未分化状态的胚胎细胞。短语“胚胎干细胞”可以包括从怀孕之后(例如胚泡)、胚胎植入之前(即植入前胚泡)形成的胚胎组织获得的细胞，从移植后/原肠胚形成前阶段胚泡获得的扩展胚泡细胞(extended blastocyst cell，EBC)(参见WO2006/040763)，和在妊娠期间的任何时间，优选在妊娠10周之前，从胎儿的生殖器组织获得的胚胎生殖(EG)细胞。本发明的一些实施方式的胚胎干细胞可以使用公知的细胞培养方法获得。例如，人胚胎干细胞可以从人胚泡分离。人胚泡通常从人体内植入前胚胎或从体外受精(IVF)胚胎获得。或者，可以将单细胞人胚胎扩增至胚泡阶段。为了分离人ES细胞，将透明带从胚泡移除，并通过其中通过轻柔移液而将滋养外胚层细胞溶解并从完整的内细胞团(ICM)移除的程序分离ICM。然后将ICM铺种在含有使其能够生长的合适培养基的组织培养瓶中。9至15天后，通过机械解离或通过酶促降解将ICM衍生的生长物解离成团块，然后将细胞重铺在新鲜的组织培养基上。通过微量移液管单独选择展示未分化形态的集落，将其机械解离成团块，并重铺。然后，每4-7天常规分离所得ES细胞。关于制备人ES细胞的方法的进一步细节，参见Reubinoff等，Nat Biotechnol 2000年5月：18(5)：559；Thomson等，[美国专利号5,843,780；Science 282：1145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38：133，1998；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844，1995]；Bongso等，[Hum Reprod 4：706，1989]；和Gardner等，[Fertil.Steril.69：84，1998]。
应理解，根据本发明的一些实施方式，也可以使用可商购干细胞。可以从NIH人胚胎干细胞注册处[www.grants(dot)nih(dot)gov/stem_cells/registry/current(dot)htm]或从其他hESC注册处购买人ES细胞。可商购胚胎干细胞系的非限制性实例是HAD-C102、ESI、BG01、BG02、BG03、BG04、CY12、CY30、CY92、CY10、TE03、TE32、CHB-4、CHB-5、CHB-6、CHB-8、CHB-9、CHB-10、CHB-11、CHB-12、HUES 1、HUES 2、HUES 3、HUES 4、HUES 5、HUES 6、HUES 7、HUES 8、HUES 9、HUES 10、HUES 11、HUES 12、HUES 13、HUES 14、HUES 15、HUES 16、HUES 17、HUES 18、HUES 19、HUES 20、HUES 21、HUES 22、HUES 23、HUES 24、HUES 25、HUES26、HUES 27、HUES 28、CyT49、RUES3、WA01、UCSF4、NYUESl、NYUES2、NYUES3、NYUES4、NYUES5、NYUES6、NYUES7、UCLA 1、UCLA 2、UCLA 3、WA077(H7)、WA09(H9)、WA13(H13)、WA14(H14)、HUES 62、HUES 63、HUES 64、CT1、CT2、CT3、CT4、MA135、Eneavour-2、WIBR1、WIBR2、WIBR3、WIBR4、WIBR5、WIBR6、HUES 45、Shef 3、Shef 6、BJNhem19、BJNhem20、SA001、SA001。
根据一个具体实施方式，胚胎干细胞系是HAD-C102或ESI。
此外，ES细胞也可以从其他物种获得，包括小鼠(Mills和Bradley，2001)、金仓鼠[Doetschman等，1988，Dev Biol.127：224-7]、大鼠[Iannaccone等，1994，Dev Biol.163：288-92]、兔[Giles等，1993，Mol Reprod Dev.36：130-8；Graves&Moreadith，1993，MolReprod Dev.1993，36：424-33]，多种家畜动物物种[Notarianni等，1991，J Reprod FertilSuppl.43：255-60；Wheeler 1994，Reprod Fertil Dev.6：563-8；Mitalipova等，2001，Cloning.3：59-67]和非人灵长类物种(恒河猴和狨猴)[Thomson等，1995，Proc Natl AcadSci U S A.92：7844-8；Thomson等，1996，Biol Reprod.55：254-9]。
扩展胚泡细胞(EBC)可以在原肠胚形成之前的阶段，从受精后至少9天的胚泡获得。在培养胚泡之前，消化透明带[例如通过Tyrode酸性溶液(Sigma Aldrich，St Louis，MO，USA)]以暴露内细胞团。然后使用标准胚胎干细胞培养方法，在受精后将胚泡作为完整胚胎体外培养至少9天且不超过14天(即在原肠胚形成事件之前)。
制备ES细胞的另一种方法描述于Chung等，Cell Stem Cell，第2卷，第2期，113-117，2008年2月7日。该方法包括在体外受精过程中从胚胎中取出单个细胞。胚胎在这个过程中不被破坏。
使用本领域任何技术人员已知的实验室技术，从获自约8-11周妊娠的胎儿(在人胎儿的情况下)的原始生殖细胞制备EG细胞。将生殖脊解离并切成小块，然后通过机械解离将其分解成细胞。然后采用合适的培养基在组织培养瓶中生长EG细胞。培养细胞，每天更换培养基，直到观察到与EG细胞一致的细胞形态，通常是在7-30天或1-4代之后。关于制备人EG细胞的方法的另外的细节，参见Shamblott等[Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：13726，1998]和美国专利号6,090,622。
又一种用于制备ES细胞的方法是通过单性生殖。胚胎在这个过程中也没有被破坏。
目前实施的ES培养方法主要是基于使用分泌干细胞增殖所需因子，同时抑制其分化的饲养细胞层。培养通常在固体表面上进行，例如用明胶或波形蛋白包覆的表面。示例性的饲养层包括人胚胎成纤维细胞，成体输卵管上皮细胞，原代小鼠胚胎成纤维细胞(PMEF)，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，鼠胎儿成纤维细胞(MFF)，人胚胎成纤维细胞(HEF)，从人胚胎干细胞分化获得的人成纤维细胞，人胎儿肌肉细胞(HFM)，人胎儿皮肤细胞(HFS)，人成体皮肤细胞，人包皮成纤维细胞(HFF)，人脐带成纤维细胞，从脐带或胎盘获得的人细胞，和人骨髓基质细胞(hMSC)。可以向培养基中加入生长因子以使ESC保持未分化状态。这样的生长因子包括bFGF和/或TGFβ。在另一个实施方式中，可以向培养基中加入试剂以使hESC保持初始未分化状态，参见例如Kalkan等，2014，Phil.Trans.R.Soc.B，369：20130540。
人脐带饲养层——可以在补充有人血清(例如20％)和谷氨酰胺的达尔伯克改良伊格尔氏培养基(例如，DMEM，SH30081.01，Hyclone)中扩增人脐带成纤维细胞。优选地，对人脐带细胞进行照射。这可以使用本领域已知的方法(例如Gamma cell，220Exel，MDSNordion 3,500rads)进行。一旦获得足够的细胞，可以将它们冷冻(例如，冷冻保存)。为了扩增ESC，通常将在补充有约20％人血清(和谷氨酰胺)的DMEM(例如，SH30081.01，Hyclone)中的人脐带成纤维细胞以25-40,000个细胞/cm2的浓度铺种在固体表面(例如T75或T175烧瓶)上，所述固体表面任选地用粘附基底如明胶(例如重组人明胶(RhG100-001，Fibrogen)包覆。通常在1-4天后将hESC铺种在支持培养基(例如具有人血清白蛋白的Nutristem)中的饲养细胞的顶部。可以向培养基中加入另外的因子以防止ESC分化，例如bFGF和TGF-β。一旦获得足够量的hESC，可以将细胞机械地破坏(例如通过使用无菌尖端或一次性无菌干细胞工具；14602Swemed)。或者，可以通过酶促处理(例如胶原酶A或TrypLE Select)或化学处理(例如EDTA)移出细胞。该过程可重复若干次以达到必要量的hESC。根据一个具体实施方式，在第一轮扩增之后使用TrypLE Select移出hESC，并在第二轮扩增之后使用胶原酶A移出hESC。
人胚胎成纤维细胞或成体输卵管上皮细胞作为饲养细胞层——可以使用人胚胎成纤维细胞或成体输卵管上皮细胞生长和维持人ES细胞。当在这些人饲养细胞上生长时，人ES细胞表现出正常的核型、呈现碱性磷酸酶活性、表达Oct-4和其他胚胎细胞表面标志物(包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和GCTM-2)、体内形成畸胎瘤、并保留所有关键形态特征[Richards M，Fong CY，Chan WK，Wong PC，Bongso A.(2002)，Human feeders supportprolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonicstem cells.Nat.Biotechnol.20：933-6]。
包皮饲养层——人ES细胞可以在如美国专利申请号10/368,045中公开的人包皮饲养层上培养。包皮衍生的饲养细胞层由适合于培养人ES细胞的完全无动物环境组成。此外，包皮细胞自其衍生以后可以保持在培养物中长达42代，为ES细胞提供了相对恒定的环境。在这些条件下，发现人ES细胞与用替代方案(例如MEF)生长的细胞在功能上无法区分。分化后，ES细胞体外表达与全部三种胚胎胚层相关的基因，并体内形成畸胎瘤，其由来自所有三种胚层的组织组成。
无饲养细胞系统也已用于ES细胞培养，这样的系统利用补充有血清替代物、细胞因子和生长因子(包括IL6和可溶性IL6受体嵌合体)的基质作为饲养细胞层的替代物。干细胞可以在培养基(例如Lonza L7系统、mTeSR、StemPro、XFKSR、E8)的存在下在固体表面如细胞外基质(例如MatrigelRTM或层粘连蛋白)上生长。与需要饲养细胞和干细胞同时生长并可以产生混合细胞群的基于饲养细胞的培养不同，在无饲养细胞系统上生长的干细胞很容易从表面分离。
在分化步骤之前，ESC可以在饲养细胞上扩增。本文上文描述了本发明设想的示例性的基于饲养层的培养。扩增通常进行至少两天、三天、四天、五天、六天或七天。扩增进行至少1代、或至少2代、至少3代、至少4代、至少5代、至少6代、至少7代、至少8代、至少9代或至少10代。
扩增后，使用分化剂使多能干细胞(例如ESC)进行定向分化。
在一个示例性的分化方案中，使用第一分化剂使胚胎干细胞向视网膜细胞谱系分化，然后使用转化生长因子-β(TGFβ)超家族的成员(例如TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3亚型，以及同源配体，包括激活素(例如激活素A、激活素B和激活素AB)、Nodal、抗缪勒氏管激素(AMH)、一些骨形态发生蛋白(BMP)(例如BMP2、BMP3、BMP4、BMP5、BMP6和BMP7)，和生长和分化因子(GDF))，使其向光感受器细胞进一步分化。根据一个具体实施方式，转化生长因子-β(TGFβ)超家族的成员是激活素A，例如0.01-1000ng/ml、0.1-200ng/ml、1-200ng/ml，例如140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml或180ng/ml。
因此激活素A可以以0.1pM-10nM、10pM-10nM、0.1nM-10nM、1nM-10nM，例如5.4nM的最终摩尔浓度添加。根据一个特别实施方式，第一分化剂是烟酰胺(NA)，例如在0.01-100mM、0.1-100mM、0.1-50mM、5-50mM、5-20mM之间，例如10mM。
根据另一个实施方式，第一分化剂是3-氨基苯甲酰胺。
NA，也被称为“烟酰胺”，是维生素B3(尼克酸)的酰胺衍生物形式，其被认为保留并改善β细胞功能。NA具有化学式C6H6N2O。NA对于生长和食物转化为能量是必要的，并且它已被用于关节炎治疗以及糖尿病治疗和预防。
根据一个特别实施方式，烟酰胺是烟酰胺衍生物或烟酰胺模拟物。如本文所用的术语“烟酰胺(NA)的衍生物”表示作为天然NA的化学修饰衍生物的化合物。在一个实施方式中，化学修饰可以是碱性NA结构的吡啶环(经由环的碳或氮成员)经由酰胺部分的氮或氧原子的取代。当被取代时，一个或多个氢原子可以被取代基取代和/或取代基可以连接到N原子以形成四价带正电荷的氮。因此，本发明的烟酰胺包括取代或未取代的烟酰胺。在另一个实施方式中，化学修饰可以是单个基团的缺失或置换，例如以形成NA的硫代苯甲酰胺类似物，所有这些都是有机化学领域精通的人员所理解的。本发明上下文中的衍生物还包括NA的核苷衍生物(例如烟酰胺腺嘌呤)。描述了多种NA的衍生物，一些也与PDE4酶的抑制活性有关(WO03/068233；WO02/060875；GB2327675A)，或作为VEGF-受体酪氨酸激酶抑制剂(WO01/55114)。例如，制备4-芳基-烟酰胺衍生物的方法(WO05/014549)。其他示例性的烟酰胺衍生物公开于WO01/55114和EP2128244中。
烟酰胺模拟物包括烟酰胺的修饰形式，和概括烟酰胺在RPE细胞从多能细胞分化和成熟中的作用的烟酰胺的化学类似物。示例性的烟酰胺模拟物包括苯甲酸、3-氨基苯甲酸和6-氨基烟酰胺。可作为烟酰胺模拟物的另一类化合物是聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的抑制剂。示例性的PARP抑制剂包括3-氨基苯甲酰胺、Iniparib(BSI 201)、奥拉帕尼(Olaparib)(AZD-2281)，鲁卡帕尼(Rucaparib)(AG014699，PF-01367338)、维利帕尼(Veliparib)(ABT-888)、CEP 9722、MK 4827和BMN-673。
另外的设想的分化剂包括例如头蛋白(noggin)、FGF拮抗剂(Dkk1或IWR1e)、Nodal拮抗剂(Lefty-A)、视黄酸、牛磺酸、GSK3b抑制剂(CHIR99021)、Notch抑制剂(DAPT)、视黄酸受体(RAR)激动剂或拮抗剂、FGF信号传导途径激动剂(aFGF、bFGF)、Hedgehog途径激动剂(Shh)、胰岛素生长因子途径激动剂(IGF)，PI3-激酶途径、EGF途径、BMP途径和Hippo途径的激动剂。
这样的分化剂可以在分化程序的任何阶段加入，例如，在第一分化步骤之前、在第一分化步骤期间、在第二分化步骤期间或在第二分化步骤之后。
根据一个特别实施方式，分化如下进行：
a)在包含第一分化剂(例如烟酰胺)的培养基中培养ESC。该步骤可以进行最少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、4周、5周或甚至6周。
b)在包含TGFβ超家族成员(例如激活素A)和任选地连同第一分化剂(例如烟酰胺)的培养基中培养获自步骤a)的细胞。该步骤可以进行最少1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、4周、5周或甚至6周。
优选地，步骤(a)在不存在TGFβ超家族成员(例如激活素A)的情况下进行。在一个实施方式中，培养基完全不含TGFβ超家族成员(例如激活素A)。在另一个实施方式中，培养基中TGFβ超家族成员的水平小于20ng/ml、10ng/ml、1ng/ml或甚至小于0.1ng/ml。
可通过在包含第一分化剂(例如烟酰胺)但不含TGFβ超家族成员(例如激活素A)的培养基中培养步骤b)中获得的细胞而继续上述方案。这个步骤在本文中被称为步骤(b*)。
现在用另外的实施方式进一步详细描述上述方案。
步骤(a)：一旦获得足够量的ESC，就开始分化过程。通常将它们从细胞培养物中移出(例如，通过使用胶原酶A、分散酶、TrypLEselect、EDTA)并在烟酰胺的存在下(并且不存在激活素A)铺种到非粘附基底上(例如，细胞培养板，如Hydrocell或琼脂糖包覆的培养皿，或皮氏细菌学培养皿)。示例性的烟酰胺浓度在0.01-100mM之间，0.1-100mM之间，0.1-50mM之间，5-50mM之间，5-20mM之间，例如10mM。一旦将细胞铺种到非粘附基底(例如细胞培养板)上，细胞培养物可以称为细胞悬浮液，优选悬浮培养物中的自由漂浮簇，即源自人胚胎干细胞(hESC)的细胞的聚集体。细胞簇不粘附于任何基底(例如培养板、载体)。自由浮动干细胞的来源先前描述于WO06/070370中，其通过引用整体并入本文。该阶段可进行最少1天，更优选2天、3天、1周或甚至14天。优选地，细胞不与烟酰胺一起在悬浮液中培养超过3周，烟酰胺例如为0.01-100mM之间，0.1-100mM之间，0.1-50mM之间，5-50mM之间，5-20mM之间，例如10mM(并且不存在激活素A)。在一个实施方式中，细胞与烟酰胺一起在悬浮液中培养6-8天，烟酰胺例如为0.01-100mM之间，0.1-100mM之间，0.1-50mM之间，5-50mM之间，5-20mM之间，例如10mM(并且不存在激活素A)。
根据一个实施方式，当细胞在非粘附基底例如细胞培养板上培养时，气氛氧条件为20％。然而，还设想操纵气氛氧条件使得气氛氧百分数小于约20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％或甚至小于约5％(例如，1％-20％之间，1％-10％之间或0-5％之间)。
根据一个特别实施方式，首先在正常气氛氧条件下在非粘附基底上培养细胞，然后降低至低于正常气氛氧条件。
非粘附细胞培养板的实例包括由Nunc生产的那些(例如，Hydrocell；目录号174912)。
通常，簇包含至少50-500,000、50-100,000、50-50,000、50-10,000、50-5000、50-1000个细胞。根据一个实施方式，簇中的细胞不被组织成层，并形成不规则的形状。在一个实施方式中，簇不含多能胚胎干细胞。在另一个实施方式中，簇包含少量的多能胚胎干细胞(例如，不超过5％或不超过3％(例如0.01-2.7％)的在蛋白质水平下共表达OCT4和TRA 1-60的细胞)。通常，簇包含在烟酰胺影响下已部分分化的细胞。这样的细胞主要表达神经和视网膜前体标志物，例如PAX6、Rax、Six3和/或CHX10。
可以使用本领域已知的酶促或非酶促方法(例如，机械、化学)使簇解离。根据一个实施方式，将细胞解离使得它们不再成簇-例如2-100,000个细胞、2-50,000个细胞、2-10,000个细胞、2-5000个细胞、2-1000个细胞、2-500个细胞、2-100个细胞、2-50个细胞的聚集体或团块。根据一个特别实施方式，细胞处于单细胞悬浮液中。
然后将细胞(例如解离的细胞)铺种在粘附基底上并在烟酰胺的存在下培养，所述烟酰胺例如0.01-100mM之间，0.1-100mM之间，0.1-50mM之间，5-50mM之间，5-20mM之间，例如10mM(并且不存在激活素A)。该阶段可以进行最少1天，更优选2天、3天、1周或甚至14天。优选地，细胞不在烟酰胺的存在下(并且不存在激活素)培养超过3周。在一个示例性实施方式中，该阶段进行6-7天。
根据一个实施方式，当细胞在粘附基底例如层粘连蛋白上培养时，气氛氧条件为20％。它们可以被操纵使得百分数小于约20％、15％、10％，更优选小于约9％、小于约8％、小于约7％、小于约6％且更优选约5％(例如1％-20％之间，1％-10％之间或0-5％之间)。
根据一个特别实施方式，首先在正常气氛氧条件下在粘附基底上培养细胞，然后降低至低于正常气氛氧条件。
粘附基底的实例包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、聚D-赖氨酸、胶原和明胶。
步骤(b)：在定向分化的第一阶段(步骤a；即在烟酰胺的存在下(例如0.01-100mM之间，0.1-100mM之间，0.1-50mM之间，5-50mM之间，5-20mM之间，例如10mM)培养)之后，然后使半分化细胞在粘附基底上进行进一步的分化阶段——在激活素A的存在下(例如100-200ng/ml，例如140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml或180ng/ml)培养。可以在该阶段添加烟酰胺(例如0.01-100mM之间，0.1-100mM之间，0.1-50mM之间，5-50mM之间，5-20mM之间，例如10mM)，该阶段可以进行1天至10周、3天至10周、1周至10周、1周至8周、1周至4周，例如至少一天、至少两天、至少三天、至少五天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、至少六周、至少七周、至少八周、至少九周、至少十周。
根据一个具体实施方式，该阶段进行约两周。如上文详细说明的，这个分化阶段可以在低或正常气氛氧条件下进行。
步骤(b*)：在定向分化的第二阶段(即，在粘附基底上在烟酰胺和激活素A的存在下培养；步骤(b))之后，在粘附基底上使进一步分化的细胞任选地进行后续分化阶段——在不存在激活素A的情况下、在存在烟酰胺(例如0.01-100mM之间，0.1-100mM之间，0.1-50mM之间，5-50mM之间，5-20mM之间，例如10mM)的情况下培养。这个阶段可以进行至少一天、2天、5天、至少1周、至少2周、至少3周或甚至4周。优选这个阶段进行约一周。如上文详述的，这个分化阶段也可以在低或正常气氛氧条件下进行。
ESC在其中分化的基础培养基是本领域已知用于支持体外细胞生长的任何已知的细胞培养基，典型地是包含规定基础溶液的培养基，其包含盐、糖、氨基酸和维持培养中的细胞处于活力状态所需的任何其他营养物质。根据一个具体实施方式，基础培养基不是条件培养基。根据本发明可以使用的可商购基础培养基的非限制性实例包括Nutristem(不含用于ESC分化的bFGF和TGFβ，含有用于ESC扩增的bFGF和TGFβ)NeurobasalTM、KO-DMEM、DMEM、DMEM/F12、CellgroTM干细胞生长培养基或X-VivoTM。基础培养基可以补充有本领域已知的处理细胞培养物的各种试剂。以下是可以包含在根据本公开使用的培养系统中的各种补充物的非限制性参考：
-血清或含有血清替代物的培养基，例如但不限于敲除血清替代物(KOSR)、Nutridoma-CS、TCHTM、N2、N2衍生物、或B27或组合；
-细胞外基质(ECM)组分，例如但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原和明胶。然后可将ECM用于携带生长因子的TGFβ超家族的一个或多个成员；
-抗菌剂，例如但不限于青霉素和链霉素；
-非必需氨基酸(NEAA)；
已知在促进SC在培养物中的存活中发挥作用的神经营养素，例如但不限于BDNF、NT3、NT4。
根据一个优选的实施方式，用于分化ESC的培养基是Nutristem培养基(Biological Industries，06-5102-01-1A)。
根据一个特别实施方式，ESC的分化和扩增在无异种(xeno)条件下进行。
根据一个实施方式，增殖/生长培养基不含异种污染物，即不含动物来源的组分如血清、动物来源的生长因子和白蛋白。因此，根据这个实施方式，培养是在不存在异种污染物的情况下进行。
在美国专利申请号20130196369中提供了用于在无异种条件下培养ESC的其他方法，其内容被整体并入。
包含光感受器细胞的制备物可以根据良好生产规范(GMP)(例如制备物是符合GMP的)和/或现行良好组织规范(GTP)(例如，制备物可以是符合GTP的)制备。
在分化步骤期间，可以监测胚胎干细胞的分化状态。可以通过检查已知指示分化的细胞或组织特异性标志物确定细胞分化。
可以使用本领域众所周知的免疫学技术检测组织/细胞特异性标志物[ThomsonJA等，(1998)Science 282：1145-7]。实例包括但不限于用于膜结合或细胞内标志物的流式细胞术、用于细胞外和细胞内标志物的免疫组织化学和用于分泌分子标志物的酶免疫测定法。
在上文所述的分化阶段之后，获得混合细胞群，其包含多边形/色素和非多边形/非色素细胞(即光感受器)两者。根据一个实施方式，混合群的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％的细胞是非色素的(即光感受器)。
在该过程的下一个步骤中，从RPE细胞(色素细胞)分离(isolate)(例如分离(separate))或富集非色素细胞(即光感受器)以产生光感受器富集群。
根据一个实施方式，通过机械选择或通过使用表面标志物而富集光感受器。
根据本发明的这个方面，至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至100％的从培养系统中移出(并随后扩增)的细胞是非色素细胞。
根据本发明的这个方面，培养系统中所有细胞的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％被移出(并随后扩增)。
根据一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于90％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于80％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于70％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于60％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于50％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于40％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于30％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于20％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于10％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于5％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于2％是色素细胞。根据另一个实施方式，移出(并随后培养)的细胞中少于1％是色素细胞。
本发明人已经证明，在本文所述的分化过程之后从培养系统中移出的细胞表达光感受器的标志物。这样的细胞可用于治疗视网膜病症。
任选地，可以培养光感受器以获得更多数量的光感受器细胞(即扩增)。在扩增阶段期间应注意其中的条件不促进RPE细胞扩增超过光感受器细胞。在一个实施方式中，培养使光感受器细胞富集。因此，例如，在一个实施方式中，不超过5％、10％、15％、20％的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，5-90％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，5-80％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，5-70％之间的扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，5-60％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，5-50％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-50％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，20-50％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，30-50％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-40％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-30％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。根据另一个实施方式，10-20％之间的被扩增的细胞是RPE细胞。
可以在细胞外基质例如明胶、胶原I、胶原IV、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白521)、纤连蛋白或聚-D-赖氨酸上进行包含光感受器的富集细胞群的扩增。
可以在已知进一步促进光感受器分化和/或存活的试剂中培养光感受器。这样的试剂包括但不限于FGF、shh、头蛋白、Wnt拮抗剂(DKK1或IWR1e)、Nodal拮抗剂(Lefty-A)、视黄酸、牛磺酸、GSK3b抑制剂(CHIR99021)和Notch抑制剂(DAPT)。
在一个实施方式中，在存在烟酰胺(例如0.01-100mM，0.1-100mM，0.1-50mM，5-50mM，5-20mM，例如10mM)并且不存在激活素A的情况下进行扩增。
光感受器细胞富集群可以在悬浮液(具有或不具有微载体)中或在单层中扩增。通过本领域熟练人员众所周知的方法，可以将单层培养物或悬浮培养物中光感受器细胞富集群的扩增修改为生物反应器或多/高叠层(multi-hyper stack)中的大规模扩增。
根据一个实施方式，扩增阶段进行至少一周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少7周、至少8周、至少9周或甚至10周。优选地，扩增阶段进行1周-10周，更优选2周-10周，更优选3周-10周，更优选4周-10周或4周-8周。
根据又一个实施方式，光感受器细胞富集群在扩增阶段期间传代至少1次，在扩增阶段期间传代至少两次，在扩增阶段期间传代至少三次，在扩增阶段期间传代至少四次，或者在在扩增阶段期间传代至少五次，或者在扩增阶段期间传代至少六次。
根据本文所述的方法产生的光感受器细胞群可以根据许多不同参数表征。
因此，例如，获得的光感受器细胞可以具有细长的细胞体，和细胞质的顶端。
可以使用本领域已知的方法(例如，使用诸如胰蛋白酶的酶、EDTA)进行光感受器细胞扩增群的收获。
收获后，可以任选地使用本领域已知的方法将光感受器细胞群冷冻保存。适用于冷冻保存的介质的实例包括但不限于90％人血清/10％DMSO，CryoStor 10％、5％和2％、Stem Cell Banker和PrimeFreezIS。
应认识到，本文公开的细胞群不含未分化的人胚胎干细胞。根据一个实施方式，少于1:250,000的细胞是Oct4+TRA-1-60+细胞，如例如通过FACS测量的。细胞还具有下调(超过5000倍)的GDF3或TDGF表达，如通过PCR测量的。
本发明的这个方面的光感受器细胞不表达胚胎干细胞标志物。所述一种或多种胚胎干细胞标志物可以是OCT-4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。
相对于非光感受器细胞，光感受器制备物可以被基本上富集，包含至少约75％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的光感受器细胞。光感受器细胞制备物可以基本上不含RPE细胞或由光感受器细胞组成。例如，充分富集的光感受器细胞制备物可包含少于约25％，20％，15％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％或1％的非光感受器细胞类型，例如RPE细胞。例如，光感受器细胞制备物可包含少于约25％，20％，15％，10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.9％，0.8％，0.7％，0.6％，0.5％，0.4％，0.3％，0.2％，0.1％，0.09％，0.08％，0.07％，0.06％，0.05％，0.04％，0.03％，0.02％，0.01％，0.009％，0.008％，0.007％，0.006％，0.005％，0.004％，0.003％，0.002％，0.001％，0.0009％，0.0008％，0.0007％，0.0006％，0.0005％，0.0004％0.0003％，0.0002％或0.0001％的非光感受器细胞，例如RPE细胞。
本文所述的制备物可基本上不含细菌、病毒或真菌污染或感染，包括但不限于HIVI，HIV 2，HBV，HCV，HAV，CMV，HTLV 1，HTLV 2，细小病毒B19，Epstein-Barr病毒，或疱疹病毒1和2，SV40，HHV5、6、7、8，CMV，多瘤病毒，HPV，肠道病毒的存在。本文所述的制备物可基本上不含支原体污染或感染。
表征本文公开的细胞群的另一种方式是通过标志物表达。因此，例如，如通过免疫染色测量的，至少70％，80％，85％，90％，95％或100％的细胞表达RAX。根据一个实施方式，70-100％之间的细胞表达RAX。优选地，如通过RT-PCR测量的，由本发明的细胞表达的RAX的水平比RPE细胞或非分化ESC中的表达水平高至少2倍、5倍或甚至10倍。
根据另一个实施方式，如通过免疫染色测量的，至少70％，80％，85％，87％，89％，90％，95％，97％或100％的细胞表达CHX10。例如，70-100％之间的细胞表达CHX10。优选地，如通过RT-PCR测量的，由本发明的细胞表达的CHX10的水平比RPE细胞或非分化ESC中的表达水平高至少2倍、5倍或甚至10倍。
根据另一个实施方式，如通过免疫染色测量的，至少70％，80％，85％，87％，89％，90％，95％，97％或100％的细胞表达视紫红质。优选地，如通过RT-PCR测量的，由本发明的细胞表达的视紫红质的水平比RPE细胞或非分化ESC中的表达水平高至少2倍、5倍或甚至10倍。
根据另一个实施方式，如通过免疫染色测量的，至少70％，80％，85％，87％，89％，90％，95％，97％或100％的细胞表达神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)。例如，通过免疫染色，70-100％之间的细胞进行表达。优选地，如通过RT-PCR测量的，由本发明的细胞表达的NRL的水平比RPE细胞或非分化ESC中的表达水平高至少2倍、5倍或甚至10倍。
优选地，本发明的这个方面的细胞不表达RPE细胞的标志物。因此，例如，优选本发明的细胞不表达(或少于30％，25％，20％，15％，10％的细胞表达)MITF、RPE65、卵黄状黄斑病蛋白(bestrophin)1，前黑素体蛋白(PMEL17)或CRALBP。优选地，如通过RT-PCR测量的，由本发明的细胞表达的RPE标志物的水平比RPE细胞中的表达水平低至少2倍、5倍或甚至10倍。
本领域熟练人员应充分认识到，光感受器细胞的获得具有很大的益处。它们可以用作用于开发新药物以促进它们的存活、再生和功能的体外模型。光感受器细胞可用于高通量筛选对光感受器细胞具有毒性或再生作用的化合物。它们可用于揭示对光感受器细胞的发育、分化、维持、存活和功能重要的机制、新基因、可溶性或膜结合因子。
光感受器细胞也可用作用于移植、补充和支持视网膜变性中的功能障碍或退化的光感受器细胞的光感受器细胞的不受限来源。此外，基因修饰的光感受器细胞可以用作在移植后在眼睛和视网膜中携带和表达基因的载体。
光感受器细胞可用作用于其的治疗剂的眼部病症包括但不限于通常与视网膜功能障碍、视网膜损伤和/或光感受器功能丧失相关的视网膜疾病或病症。可根据本发明治疗的病症的非限制性列表包括色素性视网膜炎、利伯氏先天性黑朦、遗传性或获得性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、干性AMD、Best病、视网膜脱离、回旋形萎缩、无脉络膜症、模式营养不良以及其它RPE营养不良、斯特格氏病、由于由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或创伤性损伤中的任一种导致的损伤造成的RPE和视网膜损伤。
本发明人进一步设想光感受器细胞用于治疗其他疾病的用途，例如神经退行性疾病，包括但不限于帕金森病、ALS、多发性硬化症、亨廷顿氏病、自身免疫性脑脊髓炎、糖尿病性神经病、阿尔茨海默病和癫痫。
可治疗的受试者包括灵长类动物(包括人)、犬类动物、猫类动物、有蹄类动物(例如马类动物、牛类动物、猪类动物(例如猪))、禽类和其它受试者。具有商业重要性的人和非人动物(例如家畜和家养动物)是特别感兴趣的。可以治疗的示例性哺乳动物包括犬类动物；猫类动物；马类动物；牛类动物；羊类动物；啮齿类动物等和灵长类动物，特别是人。非人动物模型，特别是哺乳动物，例如灵长类动物、鼠类动物、兔类动物等可用于实验研究。
如本文所述产生的光感受器细胞可以移植到受试者眼内的各种靶部位。根据一个实施方式，光感受器细胞的移植是至眼睛的视网膜下空间。另外，根据细胞的迁移能力和/或阳性旁分泌效应，可以考虑移植到另外的眼部隔室中，包括玻璃体空间、内或外视网膜、视网膜周边、和脉络膜内。
可以施用于受试者的活细胞的数量通常是在每次注射5000-10×106之间，例如，每次注射50,000-5×106之间。
通常将细胞配制在载体(例如等渗溶液和/或盐水)例如BSS plusTM中。其他设想的溶液包括冷冻保存溶液，例如Cryostor 5或Cryostor 2。载体可以任选地包含支持RPE植入、整合、存活、效力等的另外的因子。
移植可以通过本领域已知的各种技术进行。进行视网膜细胞移植的方法描述于例如美国专利号5,962,027、6,045,791和5,941,250以及Eye Graefes Arch Clin ExpOpthalmol 1997年3月；235(3)：149-58；Biochem Biophys Res Commun 2000年2月24日；268(3)：842-6；Opthalmic Surg 1991年2月；22(2)：102-8中。进行角膜移植的方法描述于例如美国专利号5,755,785和Eye 1995；9(Pt 6Su)：6-12；Curr Opin Opthalmol 1992年8月；3(4)：473-81；Ophthalmic Surg Lasers 1998年4月；29(4)：305-8；Ophthalmology2000年4月；107(4)：719-24；和Jpn J Ophthalmol 1999年11-12月；43(6)：502-8中。如果主要利用旁分泌效应，也可以将封装在半渗透性容器内的细胞递送并保持在眼内，这也将减少细胞暴露于宿主免疫系统(Neurotech USA CNTF递送系统；PNAS，2006年3月7日，103卷(10)3896-3901)。
施用步骤可包括将光感受器细胞眼内施用于有需要的眼中。眼内施用可以包括将光感受器细胞注射到视网膜下空间中。
根据一个实施方式，移植是经由平坦部玻璃体切除手术，随后经过小视网膜开口将细胞递送到视网膜下空间中或通过直接注射而进行。
光感受器细胞可以以各种形式移植。例如，光感受器细胞可以以单细胞悬浮液(与基质一起或粘附在基质或膜、细胞外基质或基底如生物可降解聚合物或组合上)的形式引入到靶部位中。光感受器细胞也可以与其他视网膜细胞(例如与RPE细胞)一起移植(共移植)。
治疗的有效性可以通过视觉和眼部功能和结构的不同测量评估，包括特别是最佳矫正视力(BCVA)，如通过在黑暗和光适应状态下的视野检查或微视野检查测量的视网膜对光的敏感度，全视野、多焦点、聚焦或图案视网膜电图(ERG)，对比敏感度，阅读速度，色觉，临床生物显微镜检查，眼底照相，光学相干断层成像(OCT)，眼底自发荧光(FAF)，红外和多色成像，荧光素或ICG血管造影术，自适应光学和用于评估视觉功能和眼部结构的另外的手段。
受试者可以在光感受器细胞施用之前或与光感受器细胞施用同时被施用皮质类固醇，例如泼尼松龙或甲基泼尼松龙，Predforte。
根据另一个实施方式，受试者在光感受器细胞施用之前或与光感受器细胞施用同时不被施用皮质类固醇，例如泼尼松龙或甲基泼尼松龙，Predforte。
可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用免疫抑制药物。
免疫抑制药物可属于以下类别：
糖皮质激素、细胞抑制剂(例如烷化剂或抗代谢物)、抗体(多克隆或单克隆)、作用于免疫亲和素(immunophl)的药物(例如环孢菌素、他克莫司或西罗莫司)。另外的药物包括干扰素、阿片类药物、TNF结合蛋白、麦考酚酯和小生物试剂。
免疫抑制药物的实例包括：间充质干细胞、抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体、抗胸腺细胞球蛋白(ATG)多克隆抗体、硫唑嘌呤、BAS1(抗I L-2Ra受体抗体)，环孢菌素(环孢菌素A)、(抗I L-2Ra受体抗体)、依维莫司、麦考酚酸、(抗CD20抗体)、西罗莫司、他克莫司、他克莫司和或吗替麦考酚酯。
可以在治疗之前、同时和/或之后向受试者施用抗生素。抗生素的实例包括Oflox、庆大霉素、氯霉素、Tobrex、Vigamox或批准用于眼部使用的任何其他局部抗生素制备物。
如本文使用的术语“约”是指±10％。
术语“包含(comprises或comprising)”、“包括(includes或including)”、“具有”及其同根词意指“包括但不限于”。
术语“由...组成”意指“包括并限于”。
术语“基本上由...组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但仅在另外的成分、步骤和/或部分不实质性地改变要求保护的组合物、方法或结构的基本和新颖特征的时候。
如本文所用，除非上下文另有明确指出，否则单数形式“一个/种(a)”，“一个/种(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代。例如，术语“化合物(a compound)”或“至少一种化合物(at least one compound)”可以包括多种化合物，包括它们的混合物。
每当本文指示数字范围时，其意图包括在所指示的范围内的任何引用的数字(分数或整数)。短语第一指示数字和第二指示数字“的范围内/之间的范围”和“从”第一指示数字“至”第二指示数字“的范围内/范围”在本文中可互换使用，并且意在包括第一和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数数字。
如本文中所用的术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知的那些方式、手段、技术和程序，或容易由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员从已知的方式、手段、技术和程序开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减缓或逆转病症的进展、基本上改善病症的临床或美学症状、或基本上防止出现病症的临床或美学症状。
应认识到，为了清楚起见，在单独实施方式的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方式中组合提供。相反地，为了简洁起见，在单个实施方式的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独地、或以任何合适的亚组合、或适当地在本发明的任何其他描述的实施方式中提供。在各种实施方式的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方式的必要特征，除非该实施方式在没有那些要素的情况下不起作用。
如上文所描述的以及如下文权利要求部分所要求保护的本发明的各种实施方式和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，其连同以上描述以非限制性方式说明了本发明的一些实施方式。
一般而言，本文使用的术语和本发明中使用的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中充分论述。参见，例如，“Molecular Cloning:Alaboratory Manual”，Sambrook等，(1989)；“Current Protocols in MolecularBiology”，I-III卷，Ausubel,R.M.编(1994)；Ausubel等，“Current Protocols inMolecular Biology”，John Wiley and Sons，Baltimore，Maryland(1989)；Perbal，“APractical Guide to Molecular Cloning”，John Wiley&Sons，New York(1988)；Watson等，“Recombinant DNA”，Scientific American Books，New York；Birren等(编)“GenomeAnalysis:A Laboratory Manual Series”，1-4卷，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York(1998)；如在美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中阐明的方法；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”，I-III卷，Cellis,J.E.编(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of Basic Technique”，Freshney，Wiley-Liss，N.Y.(1994)，第三版；“Current Protocols in Immunology”，I-III卷，Coligan J.E.编(1994)；Stites等(编)，“Basic and Clinical Immunology”(第8版)，Appleton&Lange，Norwalk，CT(1994)；Mishell和Shiigi(编)，“Selected Methods inCellular Immunology”，W.H.Freeman和Co.,New York(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛描述，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”，Gait,M.J.编(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”，Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1985)；“Transcription and Translation”，Hames,B.D.和Higgins S.J.编(1984)；“Animal Cell Culture”，Freshney,R.I.编(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”，IRL Press，(1986)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”，Perbal,B.(1984)和“Methods in Enzymology”，Vol.1-317，Academic Press；“PCR Protocols:A Guide ToMethods And Applications”，Academic Press，San Diego，CA(1990)；Marshak等，“Strategies for Protein Purification and Characterization-A Laboratory CourseManual”，CSHL Press(1996)；所有这些通过引用并入，如同其在本文中完全阐述一样。本文档全文提供了其他一般参考文献。据信其中的程序是本领域众所周知的，并且为了读者的方便而提供。其中包含的所有信息通过引用并入本文。
材料和方法
光感受器的产生：在经辐射的无异种GMP级人脐带成纤维细胞饲养细胞上将无异种GMP级HAD-C 102hESC扩增为集落(阶段I)。然后将扩增的hESC转移至悬浮培养物以在烟酰胺的存在下以定向方式启动分化(阶段II)。形成球形体(SB)，然后在朝向神经命运，随后朝向光感受器细胞命运的持续定向分化条件下(初始在单独的烟酰胺的存在下，随后在烟酰胺和激活素A的存在下)将其作为粘附细胞培养物铺种(阶段II)-见图1B。
RPE细胞的产生：见图1A。
定量实时PCR(QRT-PCR)：使用基因特异性TaqMan测定，用TaqMan Fast UniversalPCR Master Mix(目录号AB-4366072)进行QRT-PCR测定(参见表1)。使用AppliedBiosystems 7900HT快速实时PCR仪在光学96孔快速热循环板(目录号AB-4314320)中进行PCR反应。实时PCR结果的分析是基于Applied Biosystems(ABI)方案。每个测定使用50ngcDNA模板，一式三份。使用Sequence Detection System 2.3版(或2.4版ABI)通过实时自动化机器7900HT进行采集。得到的Ct值是高于阈值的在其处检测到每个样品的PCR信号的循环数。
在每个测试条件下，将每个标志物的表达标准化到管家基因(人GUSB；β-葡糖醛酸酶，Hs00939627_ml)内源对照。△Ct是标准化后的循环数。为了比较在各种测试条件下每个标志物的相对量，使用RQ Manager Software1.2版(或1.2.1版ABI)和△△Ct算法(根据Livak和Schmittgen，2001)。根据公式：2-△△Ct，自动计算平均相对表达，其中△△Ct是标准化到内源对照和参考对照(在每个条形图中设为1)后的循环数。将计算机结果弹(pellet)(“扩增数据”导出文件)转移到Excel中用于进一步分析。将测试重复平均化并显示最小和最大误差线。
使用硬壳薄壁96孔PCR板(Bio-Rad，目录号HSP 9601)和Bio-Rad快速实时PCR仪进行视紫红质QRT-PCR测定。使用CFX Manager Software 3.1版通过实时自动化机器Bio-RadCFX96进行采集和分析。实时PCR结果的分析是基于Bio-Rad方案。将计算机结果弹(“基因表达结果”导出文件)转移到Excel中用于进一步分析。将测试重复平均化并显示最小和最大误差线。
表1：QRT-PCR测定ID
图4中说明了对视网膜细胞分析的标志物的特异性。
结果
通过QRT-PCR，测试了在沿着RPE生产过程的各个IPC点处的眼区(eye field)标志物Rax，神经视网膜/光感受器祖标志物Chx10和Nr1，和光感受器标志物视紫红质和恢复蛋白的相对表达。如图2A-F中可见，在烟酰胺和激活素A处理(IPC点4/5)后的细胞高度表达Chx10，并相对于hESC和人RPE，以及相对于在选择色素细胞和扩增后的分化过程的后期处的细胞(IPC点8，P0和IPC点11处的细胞，低温保存后P2处的细胞)上调Nr1、恢复蛋白和视紫红质。Rax在部分分化的hESC中和在激活素A后在一定程度上表达(相对于RPE)。RPE标志物MITF随着色素细胞扩增而增加。
在分化阶段结束时在第二实验中收到了类似的数据(图3A-D)。如图3A-D中所示，在chx10、视紫红质和Nr1表达在分离和扩增色素细胞后下调时，MITF上调。
虽然已经结合其具体实施方式描述了本发明，但明显的是，许多替代、修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和广泛范围内的所有这样的替代、修改和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均在本文中通过引用整体并入本说明书中，达到如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入本文的相同程度。另外，本申请中任何参考文献的引用或识别不应被解释为承认这样的参考文献可作为本发明的现有技术。在章节标题被使用的程度上，它们不应被解释为是必然地限制性的。

Claims (33)

1.一种治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其包括：
(a)在包含分化剂的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化细胞；
(b)在包含含有TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基的培养系统中培养所述分化细胞，由此产生包含视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器的混合细胞群；
(c)富集所述混合细胞群中的所述光感受器以产生光感受器富集细胞群；和
(d)向所述受试者施用治疗有效量的所述光感受器富集细胞群，由此治疗所述视网膜疾病。
2.一种产生光感受器的方法，其包括：
(a)在包含分化剂的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化细胞；
(b)在包含含有TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基的培养系统中培养所述分化细胞，由此产生包含视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器的混合细胞群；
(c)富集所述混合细胞群中的所述光感受器以产生光感受器富集细胞群；和
(d)扩增所述光感受器富集细胞群。
3.权利要求1或2所述的方法，其中步骤(c)通过机械分离进行。
4.一种治疗有需要的受试者的视网膜疾病的方法，其包括：
(a)在包含分化剂的培养基中培养人多能干细胞群以获得分化细胞；
(b)在包含含有TGFβ超家族的一个或多个成员的培养基的培养系统中培养所述分化细胞，由此产生包含视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器的混合细胞群，其中所述混合细胞群的至少10％是光感受器；和
(c)向所述受试者施用治疗有效量的所述混合细胞群，由此治疗所述视网膜疾病。
5.权利要求1或2所述的方法，其中所述富集细胞群中所有所述细胞的少于80％是RPE细胞。
6.权利要求1、2或4所述的方法，其还包括在步骤(a)之前扩增所述人多能干细胞。
7.权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(c)之后且步骤(d)之前扩增所述光感受器群。
8.权利要求1所述的方法，其还包括在步骤(c)之后且步骤(d)之前冷冻保存所述光感受器。
9.权利要求2所述的方法，其还包括在步骤(d)之后冷冻保存所述光感受器。
10.权利要求4所述的方法，其还包括在步骤(b)之后且步骤(c)之前冷冻保存所述混合细胞群。
11.权利要求8-10所述的方法，其中所述冷冻保存是在选自90％人血清/10％DMSO、CryoStor 10％、CryoStor 5％、CryoStor 2％、Stem Cell banker和PrimeFreezIS的介质中进行。
12.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述人多能干细胞包含人胚胎干细胞(ESC)或诱导多能干细胞(iPSC)。
13.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述分化剂包含烟酰胺。
14.权利要求13所述的方法，其中步骤(a)的所述培养基不含激活素A。
15.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述TGFβ超家族的所述成员选自TGFβ1、TGFβ3和激活素A。
16.权利要求1-11中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述培养基包含烟酰胺和激活素A。
17.权利要求16所述的方法，其还包括在步骤(b)之后且步骤(c)之前，在包含烟酰胺且不含激活素A的培养基中培养所述光感受器的步骤。
18.权利要求1-17中任一项所述的方法，其中步骤(a)是在非粘附条件下进行。
19.权利要求18所述的方法，其中所述非粘附条件包括非粘附培养板。
20.权利要求18所述的方法，其中所述非粘附条件包括非粘附基底。
21.权利要求1-20中任一项所述的方法，其中步骤(a)包括：
i)在不存在激活素A的情况下，在非粘附条件下，在包含烟酰胺的培养基中培养所述培养的人多能干细胞群以产生包含分化细胞的细胞簇；和随后
ii)在不存在激活素A的情况下，在粘附条件下，在包含烟酰胺的培养基中培养(i)的所述分化细胞。
22.权利要求21所述的方法，其还包括在步骤(ii)之前解离所述细胞簇以产生细胞的团块或细胞的单细胞悬浮液。
23.权利要求1-22中任一项所述的方法，其中步骤(a)进行至少一天。
24.权利要求1-23中任一项所述的方法，其中步骤(b)进行至少一天。
25.权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述培养的至少一部分是在其中气氛氧水平小于约10％的条件下进行。
26.权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述培养是在其中气氛氧水平大于约10％的条件下进行。
27.权利要求6所述的方法，其中所述人多能干细胞是在饲养细胞上扩增。
28.权利要求27所述的方法，其中所述饲养细胞包含人脐带成纤维细胞。
29.权利要求1或4所述的方法，其中所述移植是在眼睛的视网膜下空间处进行。
30.权利要求1或4所述的方法，其中所述细胞在悬浮液中被移植，或作为固定在基质或基底上的单层细胞移植。
31.根据权利要求2所述的方法产生的光感受器群。
32.权利要求1或4所述的方法，其中所述视网膜疾病或病症选自以下中的至少一种：色素性视网膜炎、利伯氏先天性黑朦、遗传性或获得性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)、Best病、视网膜脱离、回旋形萎缩、无脉络膜症、模式营养不良、RPE营养不良、斯特格氏病、由于由光、激光、炎症、感染、辐射、新生血管或创伤性损伤中的任一种导致的损伤造成的RPE和视网膜损伤。
33.一种治疗有需要的受试者的视网膜疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求31所述的光感受器群，由此治疗所述视网膜疾病或病症。
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