CN108135888A

CN108135888A - 用于周围神经病症或脊髓损伤的治疗剂和/或预防剂

Info

Publication number: CN108135888A
Application number: CN201680056856.8A
Authority: CN
Inventors: 大野钦司; 石黑直树; 大河原美静; 八木秀树; 大田恭太郎
Original assignee: Nagoya University NUC; Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Nagoya University NUC; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 2015-09-30
Filing date: 2016-09-29
Publication date: 2018-06-08
Also published as: EP3357494A4; EP3357494A1; WO2017057562A1; JPWO2017057562A1; US20180271838A1; US20210106566A1; JP2021088592A; HK1252796A1; JP6843753B2; CA2999414A1

Abstract

本发明提供一种用于周围神经病症或脊髓损伤的治疗剂和/或预防剂等，其含唑尼沙胺或其碱金属盐作为活性成分。

Description

用于周围神经病症或脊髓损伤的治疗剂和/或预防剂

技术领域

本发明涉及一种用于治疗和/或预防周围神经病症或脊髓损伤的药用组合物，所述药用组合物包含唑尼沙胺(zonisamide)作为活性成分。

背景技术

周围神经病症(也称为神经病)为一种周围神经的正常传导受到影响的病况。在周围神经病症中，运动神经、感觉神经或自主神经可能受损。周围神经病症在临床上分类为单神经病(影响单个神经的障碍)、多发性单神经病(影响不同区域的两个或更多个神经的障碍)或多神经病(广泛的双侧神经病)，和在病理学上分类为轴突病(其中轴突主要受损)或髓鞘病(其中髓鞘变性并脱落)。周围神经病症可引起运动神经、感觉神经和自主神经受损。这转而可导致症状比如疼痛、感觉异常、麻痹、麻木、肌无力、异常出汗或排尿困难，并会随着时间的推移而加重。周围神经病症的主要原因包括由于身体因素(比如变形)引起的损伤、压迫、血液循环障碍、遗传因素、异常代谢、中毒、免疫反应、传染病、癌症、肾衰竭和肝脏疾病。不明原因的周围神经病症包括面瘫。

甲基维生素B12 (甲基钴胺素)在临床上用作周围神经病症的治疗剂(非专利文献1)，尽管其在临床实践中很少有效。依帕司他(Epalrestat, 一种醛糖还原酶抑制剂)用于糖尿病性周围神经病症(非专利文献2)。

尽管其严重影响日常生活，但仍然没有确定的方法来有效治疗与神经病相关的运动麻痹。包括NGF和BDNF、层粘连蛋白和钙粘蛋白-11的神经营养因子在动物模型中诱导运动神经元的轴突生长并改善运动障碍(非专利文献3-5)，但由于其在活体内半衰期极短而尚未在临床上用于人受试者(非专利文献6)。尽管最近细胞移植已被关注作为一种用于治疗神经病的方法，但仍存在安全性问题(非专利文献7、8)。另外，尽管有报道称一些药物比如非甾体抗炎药改善运动神经损伤，但临床上尚没有用于治疗运动神经病的药物(非专利文献9)。

脊髓损伤为一种脊髓受损的病症，主要是因为强大外力施加于脊柱而使脊椎被破坏。脊髓损伤可能损害运动功能、感觉功能或自主神经功能。这转而可导致症状比如麻痹、疼痛、感觉异常、幻肢痛(幻痛)、惊厥、痉挛、挛缩、异常出汗、体温调节异常、排泄受损或勃起功能障碍。脊髓损伤也可能引起伴发疾病比如压疮、尿路感染和/或肺炎。脊髓损伤的主要原因包括创伤、由于身体因素(比如变形)引起的损伤、压迫、血液循环障碍及传染病。

一旦受损，脊髓不再被修复和再生。仍然没有确定的自脊髓损伤中恢复的明确方法。尽管已有报道称，类固醇在损伤后48-72小时内大量给予时可抑制脊髓损伤的后续并发症，但该程序不够可信并且尚未广泛使用。而且，尽管已有报道称P2X7受体拮抗剂或肝细胞生长因子(HGF)可改善大鼠的脊髓损伤，但其尚未用于治疗脊髓损伤(非专利文献10、11)。

药物重定位(drug repositioning)为一种通过发现已广泛使用的现有药物或者由于药效不足或其他原因已退出开发的化合物的新药理作用来开发新药物的策略。与开发新药的常规方式相比，药物重定位大大减少药物开发所需的成本和时间(非专利文献12)。

唑尼沙胺(化学名：3-氨磺酰基甲基-1,2-苯并异噁唑或1,2-苯并异噁唑-3-甲磺酰胺)为一种安全性高的化合物，自1989年在日本推出已使用了20年以上。唑尼沙胺已用于治疗儿童或成人的癫痫发作(部分性发作、全身性发作和混合性发作)或用于治疗帕金森病。唑尼沙胺可用作哺乳动物(包括人)的抗癫痫药物，或者用于治疗或预防神经退行性疾病比如原发性或继发性帕金森病、亨廷顿病、舞蹈病综合征和肌张力障碍综合征(专利文献1、2)。还有报道称，唑尼沙胺作为新的药理作用显示迟发性运动障碍减少、抗肥胖作用和对双相型障碍的情绪稳定作用(非专利文献13-15)。另外，已有报道称唑尼沙胺对多巴胺能神经元或在脑缺血中具有神经保护作用(非专利文献16、17)。

然而，这些专利文献和非专利文献没有教导或启示唑尼沙胺对周围神经病症或脊髓损伤有效。

引文列表

专利文献

专利文献1：日本专利公开号60-03314

专利文献2：日本专利第3364481号

非专利文献

非专利文献1：Yamazaki 等人 Neurosci Lett, 170: 195-197 (1994)

非专利文献2：Ramirez 等人 Pharmacotherapy 28: 646-55 (2008)

非专利文献3：Coumans 等人 J Neurosci 21: 9334-9344 (2001)

非专利文献4：Powell 等人 J Biochem Cell Biol 29: 401-414 (1997)

非专利文献5：Marthiens 等人 Mol Cell Neurosci 28: 715-726 (2005)

非专利文献6：Poduslo 等人 Brain Res Mol Brain Res 36: 280-286 (1996)

非专利文献7：Nakamura 等人 Cell Res 23: 70-80 (2013)

非专利文献8：Guo 等人 Histopathology 59: 763-775 (2011)

非专利文献9：Fu 等人 J Neurosci 27: 4154-4164 (2007)

非专利文献10：Peng 等人 Proc Natl Acad Sci 106: 12489-12493 (2009)

非专利文献11：Peng 等人 J Neurosci Res. 85: 2332-2342 (2007)

非专利文献12：Ashburn 等人 Nat Rev Drug Discov 3: 673-683 (2004)

非专利文献13：Iwata 等人 J Neurol Sci. 315: 137-40 (2012)

非专利文献14：Gadde 等人 JAMA. 289(14): 1820-1825 (2003)

非专利文献15：Hasegawa 等人 Curr Med Res Opin. 20(5): 577-80 (2004)

非专利文献16：Asanuma 等人 Ann Neurol 67: 239-249 (2010)

非专利文献17：Minato 等人 Epilepsia 38: 975-980 (1997)。

发明内容

本发明要解决的技术问题为提供唑尼沙胺的新用途。

本发明人已经深入研究以解决该问题并且发现唑尼沙胺促进神经突生长和神经突再生。还揭示了唑尼沙胺保护神经元细胞免于由活性氧诱发的氧化应激，并增加神经生长因子的mRNA表达。此外，本发明人已经发现，给予具有横切坐骨神经的模型动物唑尼沙胺诱导神经再生。另外，本发明人已经发现，给予严重压碎脊髓模型动物唑尼沙胺恢复运动功能。于是，完成本发明。

具体地讲，本发明提供以下内容：

[1] 一种用于治疗和/或预防周围神经病症的药用组合物，所述药用组合物包含唑尼沙胺或其碱金属盐作为活性成分。

[2] 条目1的药用组合物，其中所述周围神经病症包括至少一种选自运动神经病、感觉神经病或自主神经病的神经病。

[3] 条目2的药用组合物，其中所述周围神经病症至少包括运动神经病。

[4] 条目2或3的药用组合物，其中所述运动神经病为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、肌肉萎缩、熟练动作(skilled movement)障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱或血管舒缩症状。

[5] 条目2-4中任一项的药用组合物，其中所述运动神经病为麻痹或麻木。

[6] 条目2-5中任一项的药用组合物，其中所述感觉神经病为疼痛、感觉异常或振动感觉异常。

[7] 条目2-6中任一项的药用组合物，其中所述自主神经病为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸或心率变异性异常。

[8] 唑尼沙胺或其碱金属盐用于制造用于治疗和/或预防周围神经病症的药物的用途。

[9] 条目8的用途，其中所述周围神经病症包括至少一种选自运动神经病、感觉神经病或自主神经病的神经病。

[10] 条目9的用途，其中所述周围神经病症至少包括运动神经病。

[11] 条目8或9的用途，其中所述运动神经病为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、肌肉萎缩、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱或血管舒缩症状。

[12] 条目9-11中任一项的用途，其中所述运动神经病为麻痹或麻木。

[13] 条目9-12中任一项的用途，其中所述感觉神经病为疼痛、感觉异常或振动感觉异常。

[14] 条目9-13中任一项的用途，其中所述自主神经病为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸或心率变异性异常。

[15] 用于治疗和/或预防周围神经病症的唑尼沙胺或其碱金属盐。

[16] 条目15的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述周围神经病症包括至少一种选自运动神经病、感觉神经病或自主神经病的神经病。

[17] 条目16的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述周围神经病症至少包括运动神经病。

[18] 条目16或17的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述运动神经病为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、肌肉萎缩、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱或血管舒缩症状。

[19] 条目16-18中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述运动神经病为麻痹或麻木。

[20] 条目16-19中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述感觉神经病为疼痛、感觉异常或振动感觉异常。

[21] 条目16-20中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述自主神经病为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸或心率变异性异常。

[22] 一种用于治疗和/或预防周围神经病症的方法，所述方法包括给予有需要的患者唑尼沙胺或其碱金属盐。

[23] 条目22的方法，其中所述周围神经病症包括至少一种选自运动神经病、感觉神经病或自主神经病的神经病。

[24] 条目23的方法，其中所述周围神经病症至少包括运动神经病。

[25] 条目23或24的方法，其中所述运动神经病为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、肌肉萎缩、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱或血管舒缩症状。

[26] 条目23-25中任一项的方法，其中所述运动神经病为麻痹或麻木。

[27] 条目23-26中任一项的方法，其中所述感觉神经病为疼痛、感觉异常或振动感觉异常。

[28] 条目23-27中任一项的方法，其中所述自主神经病为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸或心率变异性异常。

[29] 条目1-7中任一项的药用组合物，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、遗传性压力易感性神经病、遗传性神经痛性肌萎缩、异染性脑白质营养不良(MLD)、克拉伯病、法布里病、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、雷夫叙姆病、丹吉尔病、急性卟啉症、家族性淀粉样多神经病、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、与AL淀粉样变性相关的神经病、糖尿病性神经病、甲状腺功能减退症、与胶原病(比如自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮)相关的神经病、尿毒症性神经病、与慢性肝病相关的神经病、克罗-深濑综合征、菲希尔综合征、危重病性多神经病、与人免疫缺陷病毒相关的神经病、与水痘-带状疱疹病毒相关的神经病、面瘫、先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、肉毒中毒、伊顿-兰伯特综合征、药物诱发性神经肌肉接头障碍、腕管综合征、肘管综合征、Guyon管综合征、桡神经麻痹、感觉异常性股痛、腓总神经麻痹、胸廓出口综合征和跗管综合征。

[30] 条目29的药用组合物，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)和腕管综合征。

[31] 条目8-14中任一项的用途，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、遗传性压力易感性神经病、遗传性神经痛性肌萎缩、异染性脑白质营养不良(MLD)、克拉伯病、法布里病、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、雷夫叙姆病、丹吉尔病、急性卟啉症、家族性淀粉样多神经病、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、与AL淀粉样变性相关的神经病、糖尿病性神经病、甲状腺功能减退症、与胶原病(比如自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮)相关的神经病、尿毒症性神经病、与慢性肝病相关的神经病、克罗-深濑综合征、菲希尔综合征、危重病性多神经病、与人免疫缺陷病毒相关的神经病、与水痘-带状疱疹病毒相关的神经病、面瘫、先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、肉毒中毒、伊顿-兰伯特综合征、药物诱发性神经肌肉接头障碍、腕管综合征、肘管综合征、Guyon管综合征、桡神经麻痹、感觉异常性股痛、腓总神经麻痹、胸廓出口综合征和跗管综合征。

[32] 条目31的用途，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)和腕管综合征。

[33] 条目15-21中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、遗传性压力易感性神经病、遗传性神经痛性肌萎缩、异染性脑白质营养不良(MLD)、克拉伯病、法布里病、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、雷夫叙姆病、丹吉尔病、急性卟啉症、家族性淀粉样多神经病、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、与AL淀粉样变性相关的神经病、糖尿病性神经病、甲状腺功能减退症、与胶原病(比如自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮)相关的神经病、尿毒症性神经病、与慢性肝病相关的神经病、克罗-深濑综合征、菲希尔综合征、危重病性多神经病、与人免疫缺陷病毒相关的神经病、与水痘-带状疱疹病毒相关的神经病、面瘫、先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、肉毒中毒、伊顿-兰伯特综合征、药物诱发性神经肌肉接头障碍、腕管综合征、肘管综合征、Guyon管综合征、桡神经麻痹、感觉异常性股痛、腓总神经麻痹、胸廓出口综合征和跗管综合征。

[34] 条目33的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)和腕管综合征。

[35] 条目22-28中任一项的方法，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、遗传性压力易感性神经病、遗传性神经痛性肌萎缩、异染性脑白质营养不良(MLD)、克拉伯病、法布里病、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、雷夫叙姆病、丹吉尔病、急性卟啉症、家族性淀粉样多神经病、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、与AL淀粉样变性相关的神经病、糖尿病性神经病、甲状腺功能减退症、与胶原病(比如自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮)相关的神经病、尿毒症性神经病、与慢性肝病相关的神经病、克罗-深濑综合征、菲希尔综合征、危重病性多神经病、与人免疫缺陷病毒相关的神经病、与水痘-带状疱疹病毒相关的神经病、面瘫、先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、肉毒中毒、伊顿-兰伯特综合征、药物诱发性神经肌肉接头障碍、腕管综合征、肘管综合征、Guyon管综合征、桡神经麻痹、感觉异常性股痛、腓总神经麻痹、胸廓出口综合征和跗管综合征。

[36] 条目35的方法，其中所述周围神经病症选自腓骨肌萎缩症、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)和腕管综合征。

[37] 一种用于治疗和/或预防脊髓损伤的药用组合物，所述药用组合物包含唑尼沙胺或其碱金属盐作为活性成分。

[38] 条目37的药用组合物，其中所述脊髓损伤与至少一种选自运动功能障碍、感觉功能障碍和自主神经功能障碍的功能障碍相关。

[39] 条目38的药用组合物，其中所述脊髓损伤至少与运动功能障碍相关。

[40] 条目37的药用组合物，其中所述药用组合物用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍、感觉功能障碍或自主神经功能障碍。

[41] 条目40的药用组合物，其中所述药用组合物用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍。

[42] 条目38-41中任一项的药用组合物，其中所述运动功能障碍为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱、血管舒缩症状、惊厥、痉挛或挛缩。

[43] 条目38-42中任一项的药用组合物，其中所述运动功能障碍为麻痹或麻木。

[44] 条目38-43中任一项的药用组合物，其中所述感觉功能障碍为疼痛、感觉异常或幻肢痛。

[45] 条目38-44中任一项的药用组合物，其中自主神经功能障碍为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸、心率变异性异常或排泄受损。

[46] 唑尼沙胺或其碱金属盐用于制造用于治疗和/或预防脊髓损伤的药物的用途。

[47] 条目46的用途，其中所述脊髓损伤与至少一种选自运动功能障碍、感觉功能障碍和自主神经功能障碍的功能障碍相关。

[48] 条目45的用途，其中所述脊髓损伤至少与运动功能障碍相关。

[49] 条目46的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍、感觉功能障碍或自主神经功能障碍。

[50] 条目46的用途，其中所述药物用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍。

[51] 条目47-50中任一项的用途，其中所述运动功能障碍为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱、血管舒缩症状、惊厥、痉挛或挛缩。

[52] 条目47-51中任一项的用途，其中所述运动功能障碍为麻痹或麻木。

[53] 条目47-52中任一项的用途，其中所述感觉功能障碍为疼痛、感觉异常或幻肢痛。

[54] 条目47-53中任一项的用途，其中所述自主神经功能障碍为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸、心率变异性异常或排泄受损。

[55] 用于治疗和/或预防脊髓损伤的唑尼沙胺或其碱金属盐。

[56] 条目55的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述脊髓损伤与至少一种选自运动功能障碍、感觉功能障碍和自主神经功能障碍的功能障碍相关。

[57] 条目56的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述脊髓损伤至少与运动功能障碍相关。

[58] 条目55的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中唑尼沙胺或其碱金属盐用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍、感觉功能障碍或自主神经功能障碍。

[59] 条目58的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中唑尼沙胺或其碱金属盐用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍。

[60] 条目56-59中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述运动功能障碍为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱、血管舒缩症状、惊厥、痉挛或挛缩。

[61] 条目56-60中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述运动功能障碍为麻痹或麻木。

[62] 条目556-61中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述感觉功能障碍为疼痛、感觉异常或幻肢痛。

[63] 条目56-62中任一项的唑尼沙胺或其碱金属盐，其中所述自主神经功能障碍为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸、心率变异性异常或排泄受损。

[64] 一种用于治疗和/或预防脊髓损伤的方法，所述方法包括给予有需要的患者唑尼沙胺或其碱金属盐。

[65] 条目64的方法，其中所述脊髓损伤与至少一种选自运动功能障碍、感觉功能障碍和自主神经功能障碍的神经病相关。

[66] 条目65的方法，其中所述脊髓损伤至少与运动功能障碍相关。

[67] 条目64的方法，其中所述方法用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍、感觉功能障碍或自主神经功能障碍。

[68] 条目67的方法，其中所述方法用于治疗和/或预防与脊髓损伤相关的运动功能障碍。

[69] 条目65-68中任一项的方法，其中所述运动功能障碍为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱、血管舒缩症状、惊厥、痉挛或挛缩。

[70] 条目65-69中任一项的方法，其中所述运动功能障碍为麻痹或麻木。

[71] 条目65-70中任一项的方法，其中所述感觉功能障碍为疼痛、感觉异常或幻肢痛。

[72] 条目65-71中任一项的方法，其中所述自主神经病为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸、心率变异性异常或排泄受损。

本发明的唑尼沙胺或其药学上可接受的盐为在治疗和/或预防周围神经病症或脊髓损伤，特别是由创伤引起的周围神经病症或脊髓损伤方面高度安全和有效的化合物。

附图说明

图1显示唑尼沙胺对NSC34细胞或原代运动神经元的平均神经突长度、原代运动神经元中每个神经元的分支点数目及原代运动神经元中带有神经突的细胞的比率的剂量依赖性作用。

图2A显示用于比较在划痕测定(scratch assay)中用与不用唑尼沙胺处理的神经突的照片。

图2B显示在划痕测定中唑尼沙胺对神经突长度总和的剂量依赖性作用。

图3显示通过延时成像(time-lapse imaging)测量的唑尼沙胺对小鼠原代运动神经元的神经突生长的剂量和时间依赖性作用。

图4显示唑尼沙胺对由原代运动神经元中的氧化应激引起的细胞死亡的神经保护作用。

图5显示在用唑尼沙胺处理的原代运动神经元中Bdnf、Ngf、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2、Map2、Mapt和Gap43的mRNA表达水平。

图6显示在用唑尼沙胺处理的原代运动神经元中测量的Erk1/2和JNK1/2/3的磷酸化。

图7显示在小鼠坐骨神经自体移植模型手术后1周，在远端横切部位的远端0.7 mm位置横向切割的甲苯胺蓝染色的横切面的照片。

图8显示在小鼠坐骨神经自体移植模型手术后1周，在远端横切部位的远端0.7 mm位置横向切割的横切面中每根神经纤维的轴突总数和面积。

图9显示唑尼沙胺在小鼠坐骨神经自体移植模型中改善运动功能的作用。

图10显示在小鼠坐骨神经自体移植模型手术后8周，苏木精和伊红染色的胫骨前肌横切面的照片。

图11显示在小鼠坐骨神经自体移植模型手术后8周，在胫骨前肌纤维横横切区域(CSA)用唑尼沙胺进行的神经再生。

图12显示在小鼠坐骨神经自体移植模型手术后8周，腓肠肌中Chrne、Colq和Rapsn的mRNA表达水平。该图显示用唑尼沙胺处理或神经切除术对mRNA表达的作用。

图13显示在小鼠坐骨神经自体移植模型手术后8周，坐骨神经中Bdnf、Ngf、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2、Map2、Mapt和Gap43的mRNA表达水平。该图显示用唑尼沙胺处理或神经切除术对mRNA表达的作用。

图14显示在严重压碎脊髓模型小鼠中使用BMS评分评估的唑尼沙胺改善运动功能的作用。

图15显示在严重压碎脊髓模型小鼠中使用转棒试验(rotarod test)评估的唑尼沙胺改善运动功能的作用。

图16显示一种分离脊髓的技术，用于在严重压碎脊髓模型小鼠中评估损伤区域的节段及周围与神经突生长相关的基因表达。

图17显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Bdnf的mRNA表达水平。

图18显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Ngf的mRNA表达水平。

图19显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Ntf4的mRNA表达水平。

图20显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Ntrk1的mRNA表达水平。

图21显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Ntrk2的mRNA表达水平。

图22显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Map2的mRNA表达水平。

图23显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Mapt的mRNA表达水平。

图24显示在严重压碎脊髓模型小鼠手术后28天，在脊髓损伤区域的节段或损伤区域远端的节段中Gap43的mRNA表达水平。

具体实施方式

唑尼沙胺(化学名：3-氨磺酰基甲基-1,2-苯并异噁唑或1,2-苯并异噁唑-3-甲磺酰胺)可在本发明中以其碱金属盐的形式使用。唑尼沙胺的碱金属盐包括钠、钾和锂盐。优选地，碱金属盐为钠或钾盐。更优选地，碱金属盐为钠盐。

作为晶体获得的唑尼沙胺或其碱金属盐可为其晶体多晶形之一。本发明中的唑尼沙胺包括其全部晶形。

本发明的唑尼沙胺可作为水合物和/或溶剂合物存在，因此唑尼沙胺或其碱金属盐的水合物和/或溶剂合物也包括在本发明的化合物中。

本文使用的唑尼沙胺或其碱金属盐可以前药的形式存在。前药为本发明化合物(唑尼沙胺)的功能性衍生物，其能够易于在活体中转化成期望的化合物(唑尼沙胺)。

本文使用的“治疗”包括对疾病的任何治疗(例如改善症状、缓解症状或抑制症状的进展)。本文使用的“预防”包括对疾病的任何预防(例如抑制症状表现)。

本文使用的术语Bdnf、Ngf、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2、Map2、Mapt、Gap43、Chrne、Colq和Rapsn意指分别编码BDNF、NGF、NT-4/5、TrkA、TrkB、MAP2、Tau、GAP43、AChRε、ColQ和Rapsyn的基因名称。

本文使用的“周围神经”由“体神经”和“自主神经”组成。本文使用的“体神经”由“感觉神经”和“运动神经”组成。本文使用的“自主神经”由“交感神经”和“副交感神经”组成。

本文使用的“周围神经病症”为一种周围神经的正常传导受到影响的病症。“周围神经病症”包括运动神经病、感觉神经病和自主神经病。

本发明中的唑尼沙胺或其碱金属盐通过再生神经元细胞来治疗和/或预防“周围神经病症”，并因此治疗和/或预防“感觉神经病”，“运动神经病”和“自主神经病”。

“感觉神经病”包括例如疼痛、感觉异常、烧灼感和振动感觉异常。

“运动神经病”包括例如麻痹、麻木、肌无力、衰弱、肌肉萎缩、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱或血管舒缩症状。

“自主神经病”包括异常出汗、排尿困难、勃起功能障碍、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸、耳鸣、恶心、头痛、轻微发热、精神活动过度、不适、失眠、月经紊乱、味觉障碍和心率变异性异常。

优选地，“周围神经病症”为运动神经病或感觉神经病。更优选地，“周围神经病症”为运动神经病。

本文使用的“周围神经病症”包括由于不同原因引起的各种周围神经病症。周围神经病症的原因包括创伤、由于身体因素(比如变形)引起的损伤、压迫、血液循环障碍、遗传因素、异常代谢、中毒、免疫反应、传染病、癌症、肾衰竭和肝脏疾病。优选地，“周围神经病症”由创伤、由于身体因素引起的损伤或压迫引起。更优选地，“周围神经病症”由创伤或由于身体因素引起的损伤引起。

本文使用的“周围神经病症”包括“与脊椎病(spondylosis)相关的周围神经病症”，因为当脊椎被破坏和周围神经根受损时可发生“周围神经病症”。基于脊椎的损伤区域将“与脊椎病相关的周围神经病症”分类为“与颈椎病相关的周围神经病症”、“与胸椎病相关的周围神经病症”、“与腰椎病相关的周围神经病症”、“与骶椎病相关的周围神经病症”或“与尾椎病相关的周围神经病症”。本发明中的“周围神经病症”可由任何区域的损伤引起。

本文使用的“周围神经病症”在临床上分类为“单神经病”、“多发性单神经病”或“多神经病”。

“单神经病”主要由创伤、压迫或血液循环障碍引起的单个周围神经的损害造成。“单神经病”包括骨髓瘤相关的神经病、与胶原病(例如自身免疫性疾病或系统性红斑狼疮)相关的单神经病、与AL淀粉样变性相关的单神经病、糖尿病性单神经病和与创伤相关的单神经病。优选地，“单神经病”为与胶原病相关的单神经病、糖尿病性单神经病或与创伤相关的单神经病。更优选地，“单神经病”为糖尿病性单神经病或与创伤相关的单神经病。甚至更优选地，“单神经病”为与创伤相关的单神经病。

“多发性单神经病”主要由创伤、压迫或血液循环障碍引起的多种单神经病造成。通常，多发性单神经病显示左右不对称和随机分布。“多发性单神经病”包括与系统性血管炎相关的多发性单神经病、与系统性肉芽肿性病变(比如结节病)相关的多发性单神经病及糖尿病性多发性单神经病。优选地，“多发性单神经病”为糖尿病性多发性单神经病。

“多神经病”主要由遗传因素、异常代谢、中毒或免疫反应引起的弥漫性左右对称单神经病造成。在多神经病中，严重症状基本上在四肢的远端部分发生。“多神经病”包括糖尿病性多神经病、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病、腓骨肌萎缩症和白喉性神经炎。优选地，“多神经病”为腓骨肌萎缩症或糖尿病性多神经病。更优选地，“多神经病”为腓骨肌萎缩症。

本文使用的“周围神经病症”在病理学上分类为“轴突病”或“髓鞘病”。

“轴突病”为轴突主要受损的周围神经病症，包括例如由Wallerian变性引起的周围神经病症和由逆行变性引起的周围神经病症。

“髓鞘病”为髓鞘变性并脱落的周围神经病症，包括例如由原发性节段性脱髓鞘引起的周围神经病症和由继发性节段性脱髓鞘引起的周围神经病症。

“周围神经病症”的具体实例包括例如“遗传性神经病”、“获得性神经病”、“恶性肿瘤相关的神经病”、“中毒性神经病”、“营养缺乏性神经病”、“不明原因的神经病”、“神经肌肉接头障碍”和“压迫性神经病”。

优选地，“周围神经病症”为“获得性神经病”、“恶性肿瘤相关的神经病”、“中毒性神经病”、“营养缺乏性神经病”、“不明原因的神经病”、“神经肌肉接头障碍”或“压迫性神经病”。更优选地，“周围神经病症”为“获得性神经病”、“恶性肿瘤相关的神经病”、“不明原因的神经病”、“神经肌肉接头障碍”或“压迫性神经病”。甚至更优选地，“周围神经病症”为“获得性神经病”、 “不明原因的神经病”、 “神经肌肉接头障碍”或“压迫性神经病”。最优选地，“周围神经病症”为“压迫性神经病”。

“遗传性神经病”包括例如腓骨肌萎缩症、遗传性压力易感性神经病、遗传性神经痛性肌萎缩、异染性脑白质营养不良(MLD)、克拉伯病、法布里病、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、雷夫叙姆病、丹吉尔病、急性卟啉症和家族性淀粉样多神经病。优选地，“遗传性神经病”为腓骨肌萎缩症。

“获得性神经病”包括炎性神经病、与AL淀粉样变性相关的神经病、糖尿病性神经病、甲状腺功能减退症、与胶原病(比如自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮)相关的神经病、尿毒症性神经病、与慢性肝病相关的神经病，克罗-深濑综合征、菲希尔综合征、危重病性多神经病、与人免疫缺陷病毒相关的神经病和与水痘-带状疱疹病毒相关的神经病。

炎性神经病包括吉兰-巴雷综合征和慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)。

优选地，“获得性神经病”为炎性神经病或糖尿病性神经病。更优选地，“获得性神经病”为炎性神经病。最优选地，“获得性神经病”为吉兰-巴雷综合征或慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)。

“恶性肿瘤相关的神经病”包括副肿瘤性神经综合征。

“中毒性神经病”包括药物诱发性中毒性神经病、有机材料诱发性神经病和金属诱发性神经病。

药物诱发性中毒性神经病可由异烟肼、长春新碱、长春碱、顺铂、硼替佐米、氯霉素、甲硝哒唑、呋喃妥因、胺碘酮、沙利度胺、吡多辛、苯妥英、双硫仑、氯喹或吡多辛(维生素B6)引起。

有机材料诱发性神经病包括由正己烷、乙醇或苯乙烯中毒引起的神经病。

金属诱发性神经病包括由砷、汞或铊引起的神经病。

“不明原因的神经病”包括不明原因的感觉神经病和不明原因的感觉和运动神经病。具体地讲，“不明原因的神经病”包括面瘫。

“神经肌肉接头障碍”包括先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、肉毒中毒、伊顿-兰伯特综合征和药物诱发性神经肌肉接头障碍。

药物诱发性神经肌肉接头障碍可由抗生素、杀虫剂、箭毒或神经毒气引起。

“压迫性神经病”包括腕管综合征、肘管综合征、Guyon管综合征、桡神经麻痹、感觉异常性股痛、腓总神经麻痹、胸廓出口综合征和跗管综合征。优选地，“压迫性神经病”为腕管综合征、胸廓出口综合征或跗管综合征。

更优选地，“压迫性神经病”为腕管综合征或跗管综合征。最优选地，“压迫性神经病”为腕管综合征。

压迫性神经病可由创伤、压迫(其可能与微创伤相关)和/或反复应力引起。

“周围神经病症”的其他优选的具体实例包括腓骨肌萎缩症、遗传性压力易感性神经病、遗传性神经痛性肌萎缩、异染性脑白质营养不良(MLD)、克拉伯病、法布里病、肾上腺脑白质营养不良(ALD)、雷夫叙姆病、丹吉尔病、急性卟啉症、家族性淀粉样多神经病、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、与AL淀粉样变性相关的神经病、糖尿病性神经病、甲状腺功能减退症、与胶原病(比如自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮)相关的神经病、尿毒症性神经病、与慢性肝病相关的神经病、克罗-深濑综合征、菲希尔综合征、危重病性多神经病、与人免疫缺陷病毒相关的神经病、与水痘-带状疱疹病毒相关的神经病、面瘫、先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、肉毒中毒、伊顿-兰伯特综合征、药物诱发性神经肌肉接头障碍、腕管综合征、肘管综合征、Guyon管综合征、桡神经麻痹、感觉异常性股痛、腓总神经麻痹、胸廓出口综合征和跗管综合征。

优选地，“周围神经病症”为腓骨肌萎缩症、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、糖尿病性神经病、面瘫、先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、伊顿-兰伯特综合征、药物诱发性神经肌肉接头障碍、腕管综合征、肘管综合征、桡神经麻痹、感觉异常性股痛、腓总神经麻痹、胸廓出口综合征或跗管综合征。

更优选地，“周围神经病症”为腓骨肌萎缩症、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、糖尿病性神经病、面瘫、先天性肌无力综合征、重症肌无力、肌肉减少症、伊顿-兰伯特综合征、腕管综合征、肘管综合征、胸廓出口综合征或跗管综合征。

甚至更优选地，“周围神经病症”为腓骨肌萎缩症、吉兰-巴雷综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)、糖尿病性神经病、面瘫、重症肌无力或腕管综合征。

最优选地，“周围神经病症”为腓骨肌萎缩症、慢性炎性脱髓鞘性多神经根神经病(CIDP)或腕管综合征。

本文使用的“脊椎”由“颈椎”、“胸椎”、“腰椎”、“骶椎”和“尾椎”组成。

本文使用的“脊髓”由“颈部脊髓”、“胸部脊髓”、“腰部脊髓”、“骶部脊髓”和“尾部脊髓”组成。

本文使用的“脊髓损伤”为一种脊髓受损的病况，主要是因为强大外力施加于脊柱而使脊椎被破坏。“脊髓损伤”包括与“运动功能障碍”相关的脊髓损伤、与“感觉功能障碍”相关的脊髓损伤和与“自主神经功能障碍”相关的脊髓损伤。

本发明中的唑尼沙胺或其碱金属盐治疗和/或预防“脊髓损伤”，并因此治疗和/或预防与脊髓损伤相关的“运动功能障碍”、“感觉功能障碍”和“自主神经功能障碍”。

“运动功能障碍”包括麻痹、麻木、肌无力、衰弱、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱、血管舒缩症状、惊厥、痉挛和挛缩。

优选地，“运动功能障碍”为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、反射减弱、惊厥、痉挛或挛缩。更优选地，“运动功能障碍”为麻痹、麻木、肌无力、反射减弱或惊厥。甚至更优选地，“运动功能障碍”为麻痹、麻木、肌无力或反射减弱。

最优选地，“运动功能障碍”为麻痹和麻木。

“感觉神经病”包括疼痛、感觉异常和幻肢痛。

“自主神经功能障碍”包括异常出汗、排泄受损、勃起功能障碍、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸、耳鸣、恶心、头痛、轻微发热、精神活动过度、不适、失眠、月经紊乱、味觉障碍和心率变异性异常。

优选地，“脊髓损伤”包括与“运动功能障碍”相关的脊髓损伤和与“感觉功能障碍”相关的脊髓损伤。更优选地，“脊髓损伤”为与“运动功能障碍”相关的脊髓损伤。优选地，与“脊髓损伤”相关的功能障碍为“运动功能障碍”或“感觉功能障碍”。更优选地，与“脊髓损伤”相关的功能障碍为“运动功能障碍”。

本文使用的“脊髓损伤”基于损伤区域分类为“颈椎脊髓损伤”、“胸椎脊髓损伤”、“腰椎脊髓损伤”、“骶椎脊髓损伤”或“尾椎脊髓损伤”。本发明中的“脊髓损伤”可为任何区域的损伤。

本文使用的“脊髓损伤”基于脊髓损伤的严重程度分类为“完全”或“不完全”脊髓损伤。在“完全”脊髓损伤中，脊髓被横切并完全缺乏神经传递功能，而在“不完全”脊髓损伤中，脊髓部分受破坏或压迫并保持某些功能。本发明中的“脊髓损伤”包括“完全”和“不完全”脊髓损伤两者。

本文使用的“脊髓损伤”包括由任何不同原因引起的“脊髓损伤”。 “脊髓损伤”的原因包括创伤、由于身体因素(比如变形)引起的损伤、压迫、血液循环障碍或传染病。优选地，“脊髓损伤”由创伤、由于身体因素引起的损伤或压迫引起。更优选地，“脊髓损伤”由创伤或由于身体因素引起的损伤引起。

本文使用的“脊髓损伤”包括“与脊椎病相关的脊髓损伤”。“与脊椎病相关的脊髓损伤”基于脊椎的损伤区域分类为“与颈椎病相关的脊髓损伤”、“与胸椎病相关的脊髓损伤”、“与腰椎病相关的脊髓损伤”、“与骶椎病相关的脊髓损伤”或“与尾椎病相关的脊椎损伤”。本发明中的“脊髓损伤”可能与任何区域的损伤相关。

本发明的活性成分(唑尼沙胺或其碱金属盐)可配制成合适的剂型并通过口服或肠胃外途径给予。剂型包括但不限于例如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、液体剂、混悬剂、注射剂、贴剂和泥罨剂。制剂使用药学上可接受的添加剂通过任何已知的方法产生。

依目的而定，添加剂可为赋形剂、崩解剂、粘合剂、流化剂、润滑剂、包衣剂、增溶剂、溶解助剂、增稠剂、分散剂、稳定剂、甜味剂或调味剂。具体地讲，添加剂可为乳糖、甘露醇、结晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、玉米淀粉、部分预胶化淀粉、轻质无水硅酸、交联羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯醇、乙基纤维素、硬脂酸镁、硬脂富马酸钠、聚乙二醇、丙二醇、阿斯巴甜、氧化钛或滑石。

本发明的化合物可通过口服、肠胃外和直肠途径中的任何一种给予。每日剂量可依因素比如化合物的类型、给予途径以及患者的症状和年龄而变化。例如，依症状而定，预期对成人有效的每日口服剂量为每天0.1 mg-3000 mg、1 mg-2000 mg、10 mg-1000 mg或20mg-600 mg，呈单次剂量或分次剂量。

例如，依症状而定，预期对成人有效的每日静脉内剂量为每天0.01 mg-1000 mg、0.1 mg-500 mg、1 mg-200 mg或1 mg-50 mg，呈单次剂量或分次剂量。

当将为本发明活性化合物的唑尼沙胺或其碱金属盐与或不与另一种药物配制(成药用制剂或药用组合物)时，相对于制剂中的总组分，活性成分可总计占例如(非限制性地)0.1-70%重量。优选地，相对于制剂中的总组分，活性成分总计占5-60%重量。更优选地，相对于制剂中的总组分，活性成分总计占10-55%重量。

实施例

本发明将在以下实施例中详细描述，但不限于此。

实施例1

在NSC34细胞和原代脊髓运动神经元中筛选

在NSC34细胞中的筛选方法

在37℃，于95%湿度和5%二氧化碳的气氛下，在补充有10%胎牛血清(FBS，ThermoScientific)的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，Invitrogen)中培养NSC34细胞(呈现多极运动神经元样表型的小鼠成神经细胞瘤-脊髓杂交细胞，其中GFP由多西环素稳定诱导的细胞系(NSC34-pTetR12-TO/GFP)，Dev Dyn 1992, 194, 209-221)。将细胞以1.6×10³个细胞/cm²在96孔板中接种于补充有1% FBS和2 mg/mL多西环素的DMEM/F12分化培养基(Invitrogen)中，以诱导GFP的表达。在第1天，将分化培养基更换为补充有1% NEAA (非必需氨基酸，MP Biomedicals)和2 mg/mL多西环素的DMEM/F12培养基，并将细胞在存在10 μmol/L每种受试化合物(1186种FDA批准的药物)的情况下温育48小时。随后，细胞核用Hoechst 33342 (1:100000, Sigma Aldrich)染色。在ArrayScan VTI HCS Reader(Thermo Scientific Cellomics)上获取每孔16个图像。使用Neuronal Profiling v4.0BioApplication (Thermo Scientific Cellomics)自动确定每孔中神经突长度的平均值。

在原代脊髓运动神经元中的筛选方法

在胚胎期的第13.5天(E13.5)，自C57BL/6J小鼠的脊髓胚胎分离原代培养的小鼠胚胎脊髓运动神经元。以200 μmol/L-2 mmol/L的浓度制备唑尼沙胺的DMSO溶液，然后加入到培养基中，以获得唑尼沙胺的最终浓度为1 μmol/L-20 μmol/L。培养基含有0.5%的DMSO，无论其是否含有唑尼沙胺。将细胞以4.0×10³个细胞/cm²接种于用聚L-赖氨酸和层粘连蛋白包被的96孔板(Asahi Techno Glass)中，并保持在Sumilon神经元培养基(SumitomoBakelite)中。在温育2天后，将细胞在含有4%甲酰胺的PBS中于常温下固定15分钟。细胞用PBS洗涤一次，用含有2%山羊血清和0.1% Triton-X的PBS封闭，并用小鼠抗tau-1单克隆抗体(1:500, MAB3420, Millipore)和Alexa Fluor 555缀合的山羊抗小鼠二次抗体(1:1000, Life Technologies)免疫染色。在ArrayScan VTI HCS Reader上自动分析神经突。通过评估较长的200个神经突来定量神经突长度和神经分支点的数目。通过对每孔中具有25微米或更大神经突长度的细胞进行计数，确定带有神经突细胞的比率。

在NSC34细胞中的筛选结果

在1186种受试化合物中，约100种化合物增加了NSC34细胞的平均神经突长度。自100种化合物中，有20种化合物由于不能全身性给予或其毒性而被排除。其余80种化合物通过重复类似的测定16次进行筛选，选择了16种药物。

在原代脊髓运动神经元中的筛选结果

在E13.5将16种药物加入到自C57/BL6J小鼠脊髓分离的原代运动神经元。在培养48小时后，轴突用tau免疫荧光染色，然后在ArrayScan VTI HCS Reader上自动测量神经突长度。结果，发现唑尼沙胺能够延伸原代运动神经元的神经突。

剂量依赖性的评估结果

检测唑尼沙胺以剂量依赖性方式对脊髓运动神经元的神经突生长作用(图1)。唑尼沙胺在NSC34细胞和原代运动神经元中诱导剂量依赖性轴突生长。唑尼沙胺进一步显示出原代运动神经元轴突中的分支点数目的剂量依赖性增加。然而，通过给予唑尼沙胺，并未增加原代运动神经元中带有神经突细胞的比率。

实施例2

使用划痕测定评价神经突再生作用

划痕测定方法

将原代培养的运动神经元以8.0×10⁴个细胞/cm²×0.7 cm²/孔接种于用聚L-赖氨酸包被的Nun Lab-Tek Chamber Slide (Thermo Scientific)中，然后在Sumilon神经元培养基中培养48小时。原代运动神经元的神经突用200 μL无菌吸液管头线性划掉。细胞立即用PBS冲洗，并在含有0、1、10或20 μmol/L唑尼沙胺的Sumilon神经元培养基中培养48小时。将细胞在4%多聚甲醛中固定，并用神经元特异性β-III微管蛋白单克隆抗体(1:1000, MAB1195,R＆D systems)和Alexa Fluor 488缀合的山羊抗小鼠二次抗体(Life Technologies)免疫染色。在显微镜(Olympus LX71)上获取划痕区域的图像。划痕区域中原代运动神经元的神经突长度用MetaMorph软件(Universal Imaging)自动测量。

划痕测定结果

唑尼沙胺在划痕测定中诱导神经突长度的剂量依赖性增加(图2A和2B)。唑尼沙胺显示出促进原代运动神经元的神经突再生。

实施例3

原代运动神经元轴突生长的延时成像

成像方法

将原代培养的运动神经元以6.0×10³个细胞/孔在96孔板中接种于Sumilon神经元培养基中以诱导神经突生长。在IncuCyte ZOOM Live Cell Imaging System (EssenBioscience)上每8小时拍摄位相衬度图像(phase-contrast image)，持续3天。神经突长度用NeuroTrack软件(IncuCyte)自动分析。

结果

给予唑尼沙胺后40小时，在小鼠原代运动神经元中观察到神经突生长作用(图3)。在整个观察期，10 μmol/L唑尼沙胺给予组的生长作用高于1 μmol/L唑尼沙胺给予组。显示出唑尼沙胺增强神经突生长而不是开始神经突生长。

实施例4

通过使用MTS测定评估对氧化应激的作用

MTS测定方法

细胞存活率通过MTS测定(CellTiter 96 Aqueous One Solution CellProliferation Assay, Promega)进行评价，其测量线粒体还原酶的活性。将原代培养的运动神经元在Sumilon神经元培养基中培养24小时，然后将培养基更换为补充有0.5% FBS的DMEM/F12并培养24小时。以各种浓度加入唑尼沙胺1小时，然后加入100 μmol/L过氧化氢24小时。细胞用MTS试剂温育2小时。MTS信号在微平板读数器(PowerScan HT, DSPharmaBiomedical)上进行定量。将未用过氧化氢处理的细胞组用作评估MTS信号的对照。

MTS测定结果

唑尼沙胺以剂量依赖性方式显著增加原代运动神经元中活细胞的数目(图4)。显示出唑尼沙胺对由原代运动神经元中的氧化应激引起的细胞死亡具有神经保护作用。

实施例5

与神经突生长相关的基因表达的评估

总RNA提取和实时RT-PCR分析方法

使用Trizol (Thermo Fisher Scientific)，自用0、1或10 μmol/L唑尼沙胺培养的原代运动神经元分离总RNA。类似地，自长度为3 mm的坐骨神经节段或自胫骨前肌分离总RNA。单链cDNA使用ReverTra Ace (Toyobo)合成。Bdnf、Ngf、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2、Map2、Mapt和Gap43的mRNA表达水平使用LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche)和SYBR Green(Takara)定量。将mRNA水平用Gapdh的表达水平标准化。

结果

显示在加入唑尼沙胺后2天和3天，BDNF、NGF和NTF4 (神经营养因子)的mRNA水平增加(图5)。通过给予唑尼沙胺，其受体(NTRK1 (NGF受体)和NTRK2 (BDNF和NT4-4/5受体))的mRNA水平也增加。结构蛋白MAP2 (树突中丰富)、MAPT (轴突中丰富)和GAP43 (生长锥中丰富)的mRNA水平直到第3天才增加。唑尼沙胺升高神经营养因子及其受体的表达水平。

实施例6

ERK1/2和JNK1/2/3的磷酸化水平测定

蛋白质印迹方法

在培养开始后4小时，将唑尼沙胺(0、10或20 μmol/ L)加入到原代运动神经元中。细胞在第2和第3天用缓冲液(50 mmol/L HEPES pH 7.0、150 mmol/L NaCl、1%甘油、1%TritonX-100、1.5 mmol/L MgCl₂、1 mmol/L EGTA、100 mmol/L NaF、10 mmol/L焦磷酸钠、1mg/mL抑肽酶、1 mg/mL亮肽素、1 mg/mL胃酶抑素A、1 mmol/L PMSF和1 mmol/L原钒酸钠(V))冲洗。将总蛋白质溶解于1×Laemmli缓冲液中，在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜(Immobilon-P, Millipore)。膜用含有0.05% Tween 20的Tris缓冲生理盐水(TBS-T)洗涤，并用含有3%脱脂乳的TBS-T在室温下封闭1小时。将膜用抗Erk1/2(#4696, Cell Signaling)、抗磷酸化Erk1/2 (#4370, Cell Signaling)或抗磷酸化JNK1/2/3 (#4668, Cell Signaling)抗体中的任何一种(以1:1000稀释)在4℃下温育过夜。膜用TBS-T洗涤10分钟、3次，并用缀合于辣根过氧化物酶(HRP, GE Healthcare, 1:6000)的小鼠抗小鼠IgG二次抗体在室温下温育1小时。用Amersham ECL蛋白质印迹检测试剂(GEHealthcare)检测印迹，并用ImageJ程序(http://imagej.nih.gov/ij/index.html)定量。

结果

当在原代运动神经元中测量Erk1/2和JNK1/2/3的磷酸化水平时，唑尼沙胺显示抑制Erk1/2磷酸化(图6)。相比之下，唑尼沙胺轻微增加NSC34细胞中JNK1/2/3的磷酸化水平，并且不影响原代运动神经元中的该水平。

实施例7

在小鼠坐骨神经自体移植模型中的评估

评估方法

成年雄性C57BL/6J小鼠(8周龄, 19.5-22.0 g)购自Charles River。小鼠用异氟烷麻醉，并在无菌条件下经历臀肌切开以暴露左腿坐骨神经。在以下两个部位(1)和(2)处切断坐骨神经：

(1) 在距股二头肌第一分叉点3 mm远的部位(下文称为近端横切部位)

(2) 在距近端横切部位3 mm远的部位(下文称为远端横切部位)

确认切除的长度3 mm的神经节段在两个部位被完全切断。在显微镜下，在近端横切部位和远端横切部位用尼龙线(10-0黑色)缝合神经束膜。剩余的线用作发现处死小鼠时神经横切部位的标记物。为了减少DMSO毒性，制备在100% DMSO中的60 mg/mL唑尼沙胺溶液，并将溶液以橄榄油稀释以得到在5% DMSO中的3 mg/mL唑尼沙胺溶液。自手术结束开始直到处死共计1-8周，使用一次性探针(柔性型, Fuchigami)以30 mg/kg/天一天一次给予胃对照溶液(5% DMSO)或唑尼沙胺(3 mg/mL×约0.2 mL)。在每组6只小鼠中分析坐骨神经中的髓鞘形成。坐骨神经自体移植后1周，将坐骨神经在“近端横切部位”和“在距远端横切部位3mm远的部位”横切，以切除长度6 mm的神经节段。随后，将神经节段在0.2 mol/L二甲胂酸钠缓冲液pH 7.3中的2%多聚甲醛/2.5%戊二醛中固定过夜，用2%四氧化锇处理3小时，并在乙醇中脱水。在epon包埋后，在距远端横切部位0.7 mm远的位置切割半薄切片(厚度1 μm)，用碱性甲苯胺蓝(Sigma)染色，并在显微镜(FSX100, Olympus)下检查。使用ImageJ软件以盲法手动测量坐骨神经中有髓鞘轴突的数目和面积。

使用步行轨迹分析，每周评价每组3只小鼠的运动功能。在步行轨迹分析中，当允许小鼠在跑道上自由行走时记录两个后肢的足迹。通过以盲法测量两腿足迹的宽度和长度来计算坐骨神经功能指数(SFI; Bain 等人 Plast Reconstr Surg 83: 129-138(1989))。当在横切坐骨神经的后肢与没有横切坐骨神经的后肢之间没有差异时，SFI设定为0。另一方面，当横切坐骨神经的后肢变为完全麻痹时，SFI设定为-100。在记录足迹之前，允许小鼠在跑道上练习行走几次。足迹记录在6-8块薄板上。

在坐骨神经自体移植后8周，分离远端横切部位与距远端横切部位3 mm远的部位之间的整个腓肠肌和坐骨神经节段，用于总RNA提取。类似的坐骨神经节段也自没有横切坐骨神经的后肢分离。Bdnf、Ngf、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2、Map2、Mapt、Gap43、Chrne、Colq和Rapsn的mRNA表达水平以类似于实施例5的方式定量。

坐骨神经自体移植后8周，分离胫骨前肌并在冷的100%甲醇中固定用于苏木精和伊红染色。

结果

在坐骨神经自体移植模型中评价唑尼沙胺的体内神经再生作用。手术后每天以30 mg/kg/天将唑尼沙胺给予胃。手术后1周观察在距远端横切部位0.7 mm远的位置处的切面。结果揭示，与唑尼沙胺非给予组相比，轴突数目没有变化，但轴突面积增加至3.9倍(图7)。

检查长期给予唑尼沙胺对运动功能和肌肉(胫骨前肌和腓肠肌)的作用。结果揭示，作为坐骨神经自体移植后后肢运动功能的标志物的SFI在手术后6-8周给予唑尼沙胺的小鼠组中显著改善(图9)。

对胫骨前肌的横切面进行组织学和形态学分析，揭示唑尼沙胺促进自去神经性萎缩的恢复(图10、图11)。

已经证实神经肌肉接头中特异性表达的基因(包括Chrne (Jones 等人 ProcNatl Acad Sci U S A 93: 5985-5990 (1996))、Colq (Trinkaus 等人 J Neurochem105: 2535-2544 (2008))和Rapsn (Brockhausen 等人 Dev Neurobiol 68: 1153-1169(2008)))的表达水平在唑尼沙胺给予组增加(图12)。

在远端横切部位远端的坐骨神经节段分析基因表达水平，揭示在给予唑尼沙胺的小鼠手术后8周，Bdnf的表达水平未改变但Ngf和Ntf4的基因表达水平增加(图13)。此外，已证实其受体Ntrk1和Ntrk2的mRNA水平也被唑尼沙胺增加。而且，结构蛋白Map2、Mapt和Gap43的mRNA水平在唑尼沙胺给予组中升高。

这些结果证实，唑尼沙胺诱导轴突生长和坐骨神经功能的恢复。

实施例8

在严重压碎脊髓模型小鼠中评估运动功能

产生严重压碎脊髓模型小鼠的方法

雌性C57BL/6J小鼠(8周龄, 19.5-22.0 g)购自Charles River。雌性C57BL/6J小鼠通过腹膜内给予戊巴比妥钠麻醉，并在无菌条件下经历背部切开以在第10胸椎实施椎板切除术。在IH Spinal Cord Impactor上使用直径为1.35 mm的尖端以100 kdyn将脊髓压碎。在显微镜下确认脊髓中出现血肿后，封闭伤口，并将1 ml生理盐水皮下注射到后颈部区域以预防脱水。将脊髓损伤的小鼠以盲法分成两组。唑尼沙胺用橄榄油(溶剂)稀释至3 mg/mL，并自手术当天起连续几天使用一次性探针(柔性型, Fuchigami)以30 mg/kg/天胃内给予一组小鼠。另一组小鼠连续几天使用类似的方法仅接受溶剂。手术后1天，使用BMS评分(Basso 小鼠量表; Li 等人 J Neurosurg Spine 4: 165-173 (2006))，以盲法评价两组小鼠的运动功能，以选择具有BMS评分为1或更低的小鼠，并将其视为严重压碎脊髓模型小鼠。在手术后，小鼠接受200 mL来自饲养员的含有甲氧苄啶(16 mg)/磺胺甲基异噁唑(80mg)的水持续3天以预防感染。

因此，产生了“接受唑尼沙胺的严重压碎脊髓模型小鼠组(唑尼沙胺给予组)”和“仅接受溶剂的严重压碎脊髓模型小鼠对照组(对照组)”。

BMS评分

BMS评分通过将脚踝运动、重量支持、步行(stepping)、前肢和后肢的协调运动(协调)、后肢在行走中的位置、躯干稳定性和尾部位置评级来评分，并且范围在0-9，0分对应于后肢完全麻痹和9分对应于正常运动，更具体地讲，BMS评分描述如下：

0：无脚踝运动。

1：轻微脚踝运动(小于运动范围的50%)。

2：广泛的脚踝运动(等于和大于运动范围的50%)。

3：足底触地，或偶尔的足背步行。

4：偶尔足底负重步行(等于和小于50%的向前运动)。

5：频繁或持续的足底步行(等于和大于50%的向前运动)，四肢不协调；

或者频繁或持续的足底步行，四肢有一些协调，后肢爪在初始触地和提起时旋转。

6：四肢有一些协调，后肢爪在初始触地时平行并在提起时旋转，或者大部分是协调的，后肢爪在初始触地和提起时旋转。

7：大部分是协调的，后肢爪在初始触地时平行；或者大部分是协调的，后肢爪在初始触地和提起时平行，和严重的躯干不稳定性。

8：后肢爪在初始触地和提起时平行，和轻度的躯干不稳定性；或者后肢爪在初始触地和提起时平行，和正常的躯干稳定性以及尾部向下或上下翘动。

9：正常的躯干稳定性和尾部总是上翘。

结果

用BMS评分评估运动功能

“唑尼沙胺给予组10只小鼠”、“对照组10只小鼠”和“Sham组3只小鼠(其仅经历椎板切除术而没有脊髓压碎和仅接受溶剂(Sham组))”用于评价其运动功能。自损伤当天起连续几天，根据在“产生严重压碎脊髓模型小鼠的方法”中描述的程序，将唑尼沙胺在溶剂中稀释的溶液给予“唑尼沙胺给予组”，并将溶剂给予“对照组”和“Sham组”。BMS评分在手术后第1、3、7、14、21和28天以盲法测量(图14)。

Sham组(仅经历椎板切除术)的BMS评分为自手术后第3天以来的最高分9分。自手术后第14天以来，唑尼沙胺组的BMS评分显著高于对照组。唑尼沙胺给予组和对照组在手术后第14天的BMS评分分别为3.2±0.3和1.4±0.5 (p=0.014)。唑尼沙胺给予组和对照组在手术后第21天的BMS评分分别为3.2±0.4和1.2±0.5 (p=0.008)。唑尼沙胺给予组和对照组在手术后第28天的BMS评分分别为3.7±0.4和1.5±0.5 (p=0.005)。

在转棒试验中评估运动功能

以类似于“用BMS评分评估运动功能”的方式，通过自损伤当天起连续几天给予药物，在手术当天、手术后第1、7、14、21和28天，使用转棒(来自UGO BASILE)评价“唑尼沙胺给予组4只小鼠”、“对照组4只小鼠”和“Sham组3只小鼠”的运动功能。以加速旋转模式(初始速度2rpm，加速度5 rpm/min和最大速度40 rpm)测量小鼠自旋棒脱落的等待时间(保持时间，以秒计，最大等待时间为300秒)。以10分钟间隔测量等待时间3次，并将3次测量结果计算平均值用于评价(图15)。

自手术后第二天以来，Sham组的保持时间为250秒或者更长。在手术后第21和28天，唑尼沙胺给予组的保持时间显示长于对照组。在手术后第28天，唑尼沙胺给予组的保持时间为135.3±16.4秒，而对照组的保持时间为76.6±18.9秒(p=0.088)。

用BMS评分和转棒试验评估运动功能的结果揭示，在严重压碎脊髓模型小鼠中通过给予唑尼沙胺改善了运动功能。

实施例9

在严重压碎脊髓模型小鼠中的损伤区域节段处及周围评估与神经突生长相关的基因表达

方法

如在实施例8中描述的，根据“产生严重压碎脊髓模型小鼠的方法”产生严重压碎脊髓模型小鼠。在手术后第28天，自唑尼沙胺给予组的4只小鼠和对照组的4只小鼠分离脊髓，并收集损伤区域长度5 mm的节段和损伤区域远端长度5 mm的节段(图16)。使用Trizol(Thermo Fisher Scientific)自每个长度5 mm的脊髓节段分离总RNA。单链cDNA使用ReverTra Ace (Toyobo)合成。神经营养因子Bdnf、Ngf、Ntf4、Ntrk1、Ntrk2、Map2、Mapt和Gap43的mRNA表达水平使用LightCycler 480 Real-Time PCR (Roche)和SYBR Green(Takara)定量(图17、18、19、20、21、22、23和24)。将mRNA水平用GAPDH的表达水平标准化。

结果

与对照组相比，唑尼沙胺给予组的损伤区域远端节段中的MAP2和Tau基因表达水平显著增加(图22, p=0.029; 图23, p=0.008)。这表明，给予唑尼沙胺不仅诱导轴突延伸，而且诱导在损伤区域远端脊髓节段中的树突增加，因为MAP2和Tau分别在神经元细胞的树突和轴突中高度表达。如对于MAP2和Tau观察到的，NGF的表达水平似乎在损伤区域远端节段也增加(图18, p=0.053)。

这些结果证实，在损伤区域远端节段中，与神经突生长相关的基因表达水平增加。

工业应用性

本发明的唑尼沙胺或其碱金属盐对周围神经病症和脊髓损伤极其有用。本发明的唑尼沙胺或其碱金属盐通过再生神经元细胞来治疗“周围神经病症”，并因此可用于治疗与“周围神经病症”相关的运动功能障碍、感觉功能障碍和/或自主神经功能障碍。此外，本发明的唑尼沙胺或其碱金属盐治疗“脊髓损伤”，并因此可用于治疗与“脊髓损伤”相关的运动功能障碍、感觉功能障碍和/或自主神经功能障碍。

Claims

1.一种用于治疗和/或预防周围神经病症的药用组合物，所述药用组合物包含唑尼沙胺或其碱金属盐作为活性成分。

2.权利要求1的药用组合物，其中所述周围神经病症包括至少一种选自运动神经病、感觉神经病或自主神经病的神经病。

3.权利要求2的药用组合物，其中所述周围神经病症至少包括运动神经病。

4.权利要求2或3的药用组合物，其中所述运动神经病为麻痹、麻木、肌无力、衰弱、肌肉萎缩、熟练动作障碍、手腕背屈、脚踝背屈、下垂足、反射减弱或血管舒缩症状。

5.权利要求2-4中任一项的药用组合物，其中所述运动神经病为麻痹或麻木。

6.权利要求2-5中任一项的药用组合物，其中所述感觉神经病为疼痛、感觉异常或振动感觉异常。

7.权利要求2-6中任一项的药用组合物，其中所述自主神经病为异常出汗、腹泻、便秘、头晕、颤抖、心悸或心率变异性异常。