CN108135843A - 用于预防生物制品的塑料诱导降解的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过在生物处理袋中经一段时间的储存之后，保留含有的病毒的数量和效力，用于保护包含在生物处理袋中的病毒免受表面诱导降解，从而改善病毒与这些塑料的相容性的方法。在此显示，当储存在生物处理袋中时，病毒可以迅速降解，并且将β‑环糊精添加至储存在生物处理袋中的含病毒的溶液中出乎意料地预防所述病毒的塑料表面诱导降解。

Description

用于预防生物制品的塑料诱导降解的方法
技术领域
本发明涉及用于预防生物处理袋中生物制品的表面诱导降解的方法。特别地，其涉及β-环糊精用于预防包含在生物处理袋中的溶液中的病毒变质的用途。本发明的方法通过保留含有的病毒的数量、结构、效力和质量来改善所述病毒与塑料生物处理袋的相容性。
背景技术
随着制药工业对一次性系统的明显趋势，病毒领域的持续挑战是产生用于制造和大容量储存含有所述病毒的液体组合物的方法。尤其是其中所述病毒在原料药的实际存储温度范围内(从约2℃至约8℃)稳定更长时间。出于实际和物流方面的原因，生物处理袋(其是塑料容器)通常用于存储病毒。所述大型结构通常在这些塑料容器内变质，这是由于很大程度上未知的机制的结果。
病毒的生物学活性取决于至少氨基酸核心序列的构象完整性。与传统的有机和无机小分子不同，病毒是高度复杂的生物结构，并且微小的化学或物理应激可能会导致病毒的降解。为了确保合理的贮藏寿命，相容的大容量储存的初级包装至关重要，但考虑到工业中使用的一次性储存容器的性质，这带来了特殊的挑战。包含在生物处理袋中的病毒由于表面诱导降解而倾向于失去效力。
因此，本领域需要找到用于改善病毒与用于制造和存储病毒的生物处理袋的相容性的方法。具体而言，需要如下方法，该方法保护生物处理袋中含有的病毒免受表面诱导降解，从而在加工和储存期间改善所述病毒的贮藏寿命。
发明简述
我们在此已经发现并描述了用于保护生物处理袋中含有的病毒免受表面诱导降解的方法。通过保留病毒的数量、结构、效力和质量，与先前披露的方法相比，这些方法改善病毒与塑料生物处理袋的相容性。值得注意的是，向包含病毒(包含在生物处理袋中)的任何溶液中添加β-环糊精，导致所述病毒的结构和效力的显著保留，从而与没有β-环糊精的相同的溶液相比，出乎意料地改善了所述病毒与大容量储存容器的塑料表面的相容性。
因此，本发明涉及用于保护病毒免受表面诱导降解的方法，其中所述病毒包含在由塑料组成的袋中的溶液中，并且其中所述方法包括以在约1％(w/w)至约30％(w/w)之间的浓度将β-环糊精添加至所述溶液中的步骤。在本发明的优选的实施例中，所述环糊精是选自下组的β-环糊精：二甲基-β-环糊精、2-羟基乙基-β-环糊精、2-羟基丙基-β-环糊精、3-羟基丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。在甚至更优选的实施例中，所述β-环糊精是2-羟基丙基-β-环糊精。
在根据本发明的更优选的实施例中，塑料的流体接触层选自下组：乙烯乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚酰胺和聚乙烯。更优选地，所述层是乙烯乙酸乙烯酯。在某些实施例中，所述塑料包括气体屏障。优选地，所述气体屏障由乙基乙烯基乙醇制成。在根据本发明的优选的实施例中，所述袋是生物处理袋。在根据本发明的另一个优选的实施例中，所述病毒是腺病毒。
在更优选的实施例中，本发明涉及用于保护腺病毒免受表面诱导降解的方法，其中所述腺病毒包含在由塑料组成的袋中的溶液中，并且其中所述方法包括以在约1％(w/w)至约30％(w/w)之间的浓度将β-环糊精添加至所述溶液中的步骤。优选地，所述袋具有由乙烯乙酸乙烯酯袋组成的流体接触层。更优选地，所述β-环糊精是2-羟基丙基-β-环糊精。
在更优选的实施例中，本发明涉及用于保护腺病毒免受表面诱导降解的方法，其中所述腺病毒包含在由乙烯乙酸乙烯酯组成的袋中的溶液中，并且其中所述方法包括以在约1％(w/w)至约30％(w/w)之间的浓度将2-羟基丙基-β-环糊精添加至所述溶液中的步骤。
在此已经证明，当储存在生物处理袋中时，对于第一次，添加β-环糊精可以提供针对病毒的表面诱导降解的保护。因此，本发明还涉及β-环糊精用于保护病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述病毒包含在溶液中，该溶液包含在塑料生物处理袋中。
优选地，所述β-环糊精选自下组：二甲基-β-环糊精、2-羟基乙基-β-环糊精、2-羟基丙基-β-环糊精、3-羟基丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。在甚至更优选的实施例中，所述β-环糊精是2-羟基丙基-β-环糊精。
在根据本发明的更优选的实施例中，该塑料是聚合物。优选地，所述塑料选自下组：乙烯乙酸乙烯酯、聚乙烯、聚酰胺和聚乙烯。在某些实施例中，所述塑料包括气体屏障。优选地，所述气体屏障是乙基乙烯基乙醇。
在根据本发明的另一个更优选的实施例中，所述病毒是腺病毒。
本发明还涉及2-羟基丙基-β-环糊精用于保护腺病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述腺病毒包含在溶液中，该溶液包含在生物处理袋中。
本发明还涉及2-羟基丙基-β-环糊精用于保护腺病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述腺病毒包含在溶液中，该溶液包含在乙烯乙酸乙烯酯生物处理袋中。
附图说明
图1：在5℃(左)或25℃(右)条件下储存长达四周时，如通过蛋白内源荧光检测制剂1中的Ad26与塑料Flexboy袋(实心圆和实线)或玻璃瓶(空心菱形和虚线)的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图2：在5℃(左)或25℃(右)条件下储存长达四周时，如通过六邻体含量(hexoncontent)(通过RP-UPLC)检测制剂1中的Ad26与塑料Flexboy袋(实心圆和实线)或玻璃瓶(空心菱形和虚线)的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图3：在5℃(左)或25℃(右)条件下储存长达四周时，如通过蛋白浓度(通过在280nm的吸光度)检测制剂1中的Ad26与塑料Flexboy袋(实心圆和实线)或玻璃瓶(空心菱形和虚线)的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图4：在5℃(左)或25℃(右)条件下储存长达四周时，如通过腺病毒滴定量(通过vp-QPCR)检测制剂1中的Ad26与塑料Flexboy袋(实心圆和实线)或玻璃瓶(空心菱形和虚线)的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图5：在5℃(左)或25℃(右)条件下储存长达四周时，如通过腺病毒浓度(通过AEX-UPLC)检测制剂1中的Ad26与塑料Flexboy袋(实心圆和实线)或玻璃瓶(空心菱形和虚线)的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图6：在5℃(左)或25℃(右)条件下储存长达四周时，如通过效力(通过QPA)检测制剂1中的Ad26与塑料Flexboy袋(实心圆和实线)或玻璃瓶(空心菱形和虚线)的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图7：在一个冷冻/解冻循环(室温至-70℃并返回，在0.032℃/min)期间，如通过RP-UPLC(B)通过蛋白内源荧光(A)和六邻体含量检测在制剂1中的Ad26与塑料Flexboy袋(闭合环)或玻璃瓶(空心菱形)的相容性。显示了平均值和标准偏差。
图8：制剂1中的Ad26与(从左至右)生物处理袋(赛多利斯公司(Sartorius Stedim Biotech GmbH))、HyQ Cx5-14生物处理袋(赛默飞世尔公司(ThermoFisher))、PureFlex Mobius生物处理袋(密理博公司(Millipore))、或玻璃瓶(NuovaOmpi)的相容性。将制剂在5℃(实心方块)或25℃(空心三角)储存长达24周，并通过QPA通过效力检测相容性。显示了平均值和标准偏差，与数据呈线性拟合，灰色阴影为95％置信区间。
图9：在25℃储存长达一周期间，如通过蛋白内源荧光检测制剂1、2和3(从左至右)中的Ad26(没有HBCD(空心环和虚线)或补充有5％(w/w)HBCD(十字和实线))与塑料Flexboy袋的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图10：在25℃储存长达一周期间，如通过RP-UPLC通过六邻体含量检测制剂1、2和3(从左至右)中的Ad26(没有HBCD(空心环和虚线)或补充有5％(w/w)HBCD(十字和实线))与生物处理袋的相容性。显示了平均值和标准偏差，线条指示趋势。
图11：在25℃储存长达一周期间，如通过腺病毒颗粒浓度(通过CE)检测制剂1和2(从左至右)中的Ad26(没有HBCD(空心环和虚线)或补充有5％(w/w)HBCD(十字和实线))与生物处理袋的相容性。线条显示线性拟合的数据，灰色阴影为95％置信区间。在没有检测到病毒颗粒浓度的情况下，与生物处理袋接触后，没有HBCD的制剂3降解到这种程度。
图12：在25℃，储存8天之后，如通过蛋白内源荧光检测制剂2(用0、0.2％(w/w)、1％(w/w)或5％(w/w)HBCD补充)中的Ad26与塑料Flexboy袋的相容性。显示了各个数据点，并用一条线指示了趋势。
图13：在25℃，储存8天之后，如通过蛋白浓度(通过在280nm的吸光度)检测制剂2(用0、0.2％(w/w)、1％(w/w)或5％(w/w)HBCD补充)中的Ad26与塑料Flexboy袋的相容性。显示了各个数据点，并用一条线指示了趋势。
图14：在25℃，储存8天之后，如通过六邻体含量(通过RP-UPLC)检测制剂2(用0、0.2％(w/w)、1％(w/w)或5％(w/w)HBCD补充)中的Ad26与塑料Flexboy袋的相容性。显示了各个数据点，并用一条线指示了趋势。
图15：在25℃，储存8天之后，如通过腺病毒颗粒浓度(通过CE)检测制剂2(用0、0.2％(w/w)、1％(w/w)或5％(w/w)HBCD补充)中的Ad26与塑料Flexboy袋的相容性。该线条显示对数据的线性拟合，灰色阴影为95％置信区间。
图16：在25℃，储存8天之后，如通过效力(通过QPA)检测制剂2(用0、0.2％(w/w)、1％(w/w)或5％(w/w)HBCD补充)中的Ad26与塑料Flexboy袋的相容性。该线条显示对数据的线性拟合，灰色阴影为95％置信区间。
发明详述
如先前提及的，需要发现用于保护生物处理袋中包含的病毒免受表面诱导降解的方法，从而通过保留包含的病毒的数量和效力来改善病毒与加工和大容量储存材料的相容性。在此显示，病毒在生物处理袋中快速降解，并且将β-环糊精样2-羟基丙基-β-环糊精(所有摩尔取代，HBCD)添加至储存在生物处理袋中的溶液中的病毒令人惊讶地预防所述病毒的塑料表面诱导降解。
我们已经发现并描述了在生物处理袋中用于保留病毒的方法。特别地，当所述病毒包含在由塑料组成的袋中的溶液中时，这些方法保护病毒免受表面诱导降解。与先前披露的方法相比，这些方法通过保留病毒的数量和效力和质量来改善与塑料的生物相容性，而不管所用的制剂基质如何。适用于本发明方法的病毒的实例包括但不限于(活性的)病毒、疫苗、无包膜病毒、包膜病毒、病毒样颗粒、重组病毒、以及灭活病毒和减毒病毒。
在本发明的优选的实施例中，该病毒是重组腺病毒。腺病毒载体的构建和繁殖是本领域熟知的并且涉及使用标准分子生物技术，如描述在以下的那些：例如Sambrook等人，Molecular Cloning,a Laboratory Manual[分子克隆，实验室手册]，第2版，冷泉港实验出版社，冷泉港实验室，纽约(1989)，Watson等人，Recombinant DNA[重组DNA]，第2版，Scientific American Books[科学美国人书](1992)，美国专利6,492,169或者在WO 03/104467美国专利号5,559,099、5,837,511、5,846,782、5,851,806、5,994,106、5,994,128、5,965,541、5,981,225、6,040,174、WO 96/26281、WO 00/03029，和Thomas Shenk，“Adenoviridae and their Replication[腺病毒及其复制]”，将其通过引用结合在此。在本发明的某些实施例中，人类腺病毒的血清型包括血清型2、4、5、7、11、26、34、35、36、48、49或50的任一个或者任何杂交的或突变的腺病毒血清型。在本发明的优选的实施例中，该重组腺病毒来自人类腺病毒血清型5、26或35。在另外的实施例中，本发明的腺病毒是猿猴腺病毒，优选是黑猩猩或大猩猩腺病毒。这些腺病毒在人群中通常具有低血清阳性率和/或低预先存在的中和抗体滴定量。在另外的实施例中，本发明的腺病毒进一步包含异源核酸。合适的异源核酸是本领域技术人员已知的，并且例如可以包括转基因可读框，例如编码多肽的可读框，当载体用于疫苗接种目的时针对其免疫应答是所希望的，例如适合于针对疟疾(参见例如WO2004/055187)、HIV、埃博拉病毒、RSV、HPV、Zika病毒、HSV、肺结核(参见例如WO2006/053871)、某些病毒等产生免疫应答的转基因，这些都是本领域技术人员熟知的。实际上，转基因的性质对于本发明来说并不重要，它可以是任何异源核酸序列，因此在此不需要进一步阐述。
一些参考文献披露了环糊精作为腺病毒制剂的赋形剂的用途。WO029024披露了羟基丙基-β-环糊精用于制备冷冻干燥制剂的大量可能的冻干保护剂的一部分。WO 029024涉及与本发明披露的液体组合物相反的冷冻干燥组合物。液体制剂的优点在于它更便宜，并且给予前的处理更省时且不易于临床给药或重构错误。此外，放大冻干过程可能是一项繁重的工作。Renteria等人将HBCD识别为在鼻内给药期间用于促进某些蛋白质稳定性并避免聚集的添加剂之一。Renteria等人披露了羟基丙基-β-环糊精在适于鼻内给药增强粘膜吸收的制剂中的用途。WO 2015/04002披露了含有HBCD作为组分之一的含复合多组分病毒的组合物。包含HBCD的并且例示在WO 2015/04002中含病毒的组合物均包含在玻璃瓶中。WO2015/04002没有提到腺病毒与塑料生物过程袋的不相容性。
HBCD典型地用于增加小分子(如双氯芬酸或布洛芬)的溶解度。这与其不寻常的结构有关。由于其外部亲水特性的空间分布，HBCD分子是具有极性亲水外部和非极性疏水空腔的圆环形环。仲OH基团位于相反的边缘。这些羟基基团给出HBCD其外部亲水特性。HBCD环的内部直径较小(比病毒颗粒小得多)并且仅适合小分子。其由疏水性氢表面以及糖苷醚类氧组成。作为这种特殊结构的结果，HBCD被用来封装或俘获非常小的分子，溶解它们以形成所谓的包合物。HBCD的这些结构特征并不能使HBCD成为用于解决生物处理袋中不相容问题的明显选择。
术语“相容性”是指两种材料或组分彼此接触或与彼此相邻存在，而不会负面影响(如组分之一或两者的数量、结构、效力或质量)属性的能力。如在此所用，它指与生物处理袋或其他包装材料的表面接触或邻近的病毒颗粒的降解的相对抗性。
如在此所用，术语“效力”是指以在下文中描述的基于细胞的效力测定中测量的感染单位表示的腺病毒活性的量度。
术语“副产物”包括不希望的产物，其减少或变少给定制剂中治疗性/预防性腺病毒的比例。典型的副产物包括腺病毒的聚集体和腺病毒的片段，由例如蛋白质变性、脱酰胺作用、水解或其组合引起。典型地，聚集体是分子量大于分离的病毒颗粒的复合体。
如在此使用的，保护病毒免受表面诱导降解并且其从而改善与塑料的相容性的方法是储存于生物处理袋中时的保留病毒的物理和/或化学完整性和/或生物活性的方法。这可以通过经一段时间和某些储存条件，确定不同的特征(如生物过程袋中的病毒的效力、和/或其他质量方面)来确定。所述病毒的这些特征可以在升高的温度下(预测实时温度)或在其他胁迫条件下测量，例如病毒可以在25℃经受孵育以为了研究不同条件(最大化生物贮藏寿命)的影响。确定病毒降解的所述特征可以通过至少一种选自下组的方法确定，该组由以下组成：目视检查，病毒颗粒定量聚合酶链式反应(vp-QPCR)、基于QPCR的效力测定(QPA)、反相高效液相色谱(RP-UPLC)、AEX-UPLC、固有荧光和通过在280nm处的吸光度的蛋白质浓度。
病毒颗粒定量聚合酶链式反应(vp-QPCR)
开发了vp-QPCR用于使用靶向存在于腺病毒载体内的转基因盒的CMV启动子的100bp区域的引物定量腺病毒颗粒。简而言之，这种QPCR方法依赖于Taq聚合酶的外切核酸酶活性，其导致在100bp扩增子中间退火的特异性荧光探针的降解。该探针与发光体和猝灭剂共价连接，并且其降解使发射器从猝灭剂释放，随后与模板量成比例的荧光发射。定量值是从阈值周期(Ct)获得的，荧光信号增加超过阈值的周期。用于基于DNA的荧光检测的阈值设置为略高于背景。荧光超过阈值的周期数被称为阈值周期(Ct)，或根据MIQE指南的定量周期(Cq)(Bustin等人，2009)。在指数扩增阶段，靶DNA序列在每个循环中翻倍。例如，Ct比另一个样品领先3个循环的DNA样品含有23＝8倍以上的模板。因此，较高的Ct值代表较低量的靶DNA，并且较低的Ct值代表靶DNA的较高的可用性。绝对定量可以通过比较储备腺病毒的连续稀释产生的标准曲线(其浓度通过在260nm处的光密度(OD260)确定)来进行。绘制测试材料的Ct值与标准曲线的Ct值的关系曲线，该曲线产生精确且明确的载体颗粒的数量。
当在E1感受态细胞(QPA，参见下文)上孵育后用作读数时，更多降解的样品将导致更高的δ(t＝0减去)Ct值，并且更稳定的制剂将导致更低的Ct值。
基于QPCR的效力测定(QPA)
为了定量腺病毒效力，QPA将QPCR与基于组织培养的感染性测定相结合。该测定基于实验观察，即在接种细胞单层之后新合成的病毒DNA的外观非常快，并且与大范围的感染复数(MOI)中的病毒输入浓度成比例。将样品的稀释液(非终点稀释的)接种到96孔板中的HEK293细胞单层上。在35℃，允许感染进行持续3小时。吸出这些孔并补充不含腺病毒的培养基。为了释放腺病毒DNA，通过Triton X-100溶液和单个冷冻/解冻步骤在细胞裂解之前将平板再孵育42小时。根据以上描述方法对稀释的细胞裂解物进行QPCR。通过与由终点滴定确定的已知感染性样品的Ct值产生的标准曲线比较来计算感染滴定量。可替代地，δ效力可以直接表示为Ct值，因为感染滴定量或效力与Ct值直接相关。特别是在比较制剂之间效力的相对差异时，这是一种快速并可靠的方法。
反相超高效液相色谱(RP-UPLC)
为了确定腺病毒的若干种质量属性(如腺病毒和其他蛋白质的存在和(相对)数量，可以通过反相超高效液相色谱(RP-UPLC)分析腺病毒蛋白质谱。
UPLC通过使用在样品、流动相(缓冲液或溶剂)与固定相(色谱柱中的色谱填充材料)之间的各种化学相互作用来分离混合物的组分。高压泵将流动相移动到柱中，而分析物在两相之间分离，因此其洗脱取决于其对固定相和流动相的相对亲和力。检测器使用例如UV吸收检测来测量分子的保留时间(tR：样品注射和出现最大峰值之间的时间)。
RP-UPLC的分离机制基于疏水性的差异。在腺病毒蛋白质谱方法中，非极性固定相由疏水烷基C4链组成，而流动相由具有增加的疏水性的水/乙腈/TFA混合物组成。腺病毒颗粒解离成它们的组成蛋白质，其最初与固定相相互作用，并且随后取决于其疏水表面积在保留时间洗脱。每种蛋白质的保留时间和量通过在280nm处的UV吸收检测来检测。典型的腺病毒RP-UPLC谱由10种或14种蛋白组成，这些蛋白包括核心蛋白(VII)、五邻体基质(III)和六邻体(II)。
阴离子交换超高效液相色谱(AEX-UPLC)
为了定量腺病毒颗粒的数量，可以通过阴离子交换超高效液相色谱(AEX-UPLC)从基质分离病毒颗粒，并通过UV吸收对其进行定量。
UPLC通过使用在样品、流动相(缓冲液或溶剂)与固定相(色谱柱中的色谱填充材料)之间的各种化学相互作用来分离混合物的组分。高压泵将流动相移动到柱中，而分析物在两相之间分离，因此其洗脱取决于其对固定相和流动相的相对亲和力。检测器使用例如UV吸收检测来测量分析物的保留时间(tR：样品注射和出现最大峰值之间的时间)。
在用于腺病毒颗粒定量的AEX-UPLC方法中，带负电的颗粒通过它们与含有季铵阳离子的带正电的柱相互作用而被捕获。增加流动相中的盐浓度减弱静电相互作用，使得病毒颗粒在特定于其血清型的保留时间洗脱，与基质成分和杂质分开。随后通过在214nm处的UV吸收对颗粒进行定量。
毛细管区带电泳(CE)
使用毛细管区带电泳(CE)用于确定腺病毒颗粒浓度。在这种方法中，含有病毒颗粒的样品通过电渗流通过小直径毛细管。由于尺寸、电荷和摩擦差异，样品中的各种组分具有不同的电泳迁移率。这导致不同的组分分离成条带。
洗脱时，通过在214nm处的吸光度检测和定量腺病毒颗粒峰。信号通过校准标准转换成浓度。
固有荧光测定
腺病毒衣壳蛋白含有在激发后重新发射光的芳香族氨基酸，具体是色氨酸和较少程度的酪氨酸和苯丙氨酸。色氨酸的发射最大值和量子产率很大程度上取决于其环境的极性。在极性、水性环境(例如球形蛋白质的表面)中，量子产率相对较低，而在非极性环境(例如聚集体内部)中，量子产率增加。这种特征使色氨酸荧光成为用于研究蛋白质构象变化、聚集和分子相互作用的有用工具。
在固有荧光测定中，将样品一式三份转移至UV透明平底微孔板。将该板用UV透明密封覆盖。通过使用具有280nm中心波长和10nm带宽的激发滤光器的酶标仪以及具有340nm中心波长和10nm带宽的发射滤光片来测量色氨酸荧光。底部光学器件用于最小化密封和弯月面形状的影响。
本领域已知荧光强度是腺病毒降解的敏感度量。取决于样品中发生变化的性质，在应激时可以观察到增加或减少。预计蛋白解折叠和衣壳解离导致内在荧光下降，并且预期聚集导致增加。在所用范围内，测定的精确度<5％(CV％)。
获得的应激的样品的荧光应始终与对照样品比较。由于施加应激后的增加或减少取决于降解途径和每种活性药物成分(API)的特异性，因此无法预测。与t＝0样本相比的变化(更高或更低)指示不太稳定的制剂。接近t＝0样品值的应激的样品更加稳定。
蛋白浓度，通过在280nm的吸光度
腺病毒衣壳蛋白含有吸收280nm左右紫外线的芳香族氨基酸，具体是色氨酸、以及较少程度的酪氨酸和苯丙氨酸。根据Beer-Lambert定律，吸光度与光程长度中的氨基酸数量成线性相关，从而与蛋白质浓度成线性相关。由于病毒颗粒也散射光，导致波长依赖性表观吸光度，所以首先校正该信号以获得真实的吸光度信号。随后通过校准曲线将280nm处的吸光度转化为蛋白质浓度，或者在样品之间直接进行比较，作为蛋白质浓度的定量测量。
病毒与如生物处理袋的主要散装容器相容，如果其中在其他之间(就数量和效力而言)，其显示最小损失(即0.3log/2年)，并且不显示重大修改。另外，在视觉检查时应该没有观察到聚集、降解、颜色和/或清晰度变化的迹象。
除非另外规定，如本申请中使用的“约”意指±10％。
如本申请中使用的“塑料”意指一种或多种有机分子的合成的或半合成的可塑的(共)聚合物。这包括由多个层(如流体接触层、气体屏障和外层)组成的膜，其中至少流体接触层是塑料。本申请中使用的塑料的实例是乙烯乙酸乙烯酯(包括单层)、(超低密度)聚乙烯、聚酰胺和聚乙烯。
如本申请中使用的“袋”意指塑料的生物处理容器，其可以在病毒的制造过程中使用，以便容纳过程中间体或(散装)病毒或作为初级包装。本申请中使用的袋的实例是例如Flexboy袋、HyQ袋、PureFlex袋、波袋(wave bags)、生物反应器等。这些袋通常被称为生物处理袋。在本申请中术语“袋”和“生物处理袋”可以互换地使用。
如本申请中使用的“聚合物”意指：由很多重复子单位(单体)组成的大分子、或高分子。
如本申请中使用的“共聚物”意指：两种或更多种不同单体结合在一起。
在本发明的优选的实施例中，该生物处理袋由聚合物制成。在本发明的更优选的实施例中，所述聚合物选自下组：乙烯乙酸乙烯酯(包括单层)、(超低密度)聚乙烯、聚酰胺和聚乙烯。
如本申请中使用的“环糊精”意指：环状低聚糖的组。最常用的形式是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，其分别具有6个、7个和8个葡萄糖分子。根据本发明，提供保护袋中的病毒免受表面诱导降解的环糊精是β-环糊精。也可以得到取代的衍生物，像二甲基-β-环糊精、2-羟基乙基-β-环糊精、2-羟基丙基-β-环糊精、3-羟基丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精和2-羟基丙基-β-环糊精。对于后一组分子，如本申请中使用的“摩尔取代(MS)”意指：每个脱水葡萄糖单元的羟基丙基基团的平均数。
如本申请中使用的“取代度(DS)”意指：每分子环糊精中羟基丙基基团的数量。
如本申请中使用的“气体屏障”意指：在单体的两层之间的不渗透气体的层，如乙基乙烯基乙醇。
如本申请中使用的“w/w”意指：“重量体重”(“weight for weight”或“weight byweight”)，如按重量或质量测量的混合物中特定物质的比例。
本发明涉及用于保护生物处理袋中的病毒免受表面诱导降解的方法。如与先前披露的方法相比，这些方法通过保留病毒的数量和效力(感染性)和质量来改善与塑料的相容性。值得注意的是，将β-环糊精添加至包含病毒的溶液(包含在生物处理袋中)中导致明显地保留所述病毒的数量、效力(感染性)和质量，从而与没有β-环糊精的溶液相比改善所述病毒与生物处理袋的整体相容性。
本发明涉及用于保留溶液中病毒和相关的原料药的方法，优选地用于基因疗法和/或疫苗应用中。含有病毒的溶液适于2℃-8℃范围内的生产和储存，同时还可与肠胃外给药相容。这些溶液也可以储存在较低温度，例如-20℃或更低、-40℃或更低、-65℃或更低、-80℃或更低。它们也可以在高于8℃的温度(例如，25℃或甚至更高)储存。
用于本发明的这些溶液提供与塑料的、与不同浓度的病毒的相容性，并且可以给予至各种脊椎动物，优选是哺乳动物尤其是人类。用于本发明的方法中的稳定的溶液是例如基于病毒的组合物，其可以例如作为可以为先前未感染的个体提供预防性益处和/或提供治疗效果的疫苗给予。
在本发明的优选的实施例中，在本发明的方法中使用的β-环糊精选自下组：二甲基-β-环糊精、2-羟基乙基-β-环糊精、2-羟基丙基-β-环糊精、3-羟基丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。在甚至更优选的实施例中，所述β-环糊精是2-羟基丙基-β-环糊精。
在优选的实施例中，在含病毒的溶液中的β-环糊精的浓度范围在约1％(v/v)与约30％(v/v)之间，例如在约1.5％(v/v)与25％(v/v)之间、例如在约2％(v/v)与20％之间、例如在约2.5％(v/v)与20％(v/v)之间、例如在约3％(v/v)与15％(v/v)之间、例如在约3.5％(v/v)与10％(v/v)之间，例如约5％(v/v)。
提供以下实例来阐述本发明，而非对其进行限制。
实例
实例1
实验设计和方法学
测试包含Ad26腺病毒的腺病毒配制品(如描述在[1]中)与玻璃和塑料的相容性。在标准制剂1中，将Ad26腺病毒以2.4×1011VP/mL的浓度填充在生物处理袋(赛多利斯公司(Sartorius Stedim Biotech GmbH))以及玻璃瓶(Nuova Ompi)中(参见表1)。将50mL 生物处理袋用20mL的制剂填充，同时将3mL小瓶用1.5mL制剂填充(在两种情况下，每种条件和时间都重复两次)。在填充袋和小瓶之前，在T＝0从对照样品中取对照样品。
为了评估腺病毒制剂与塑料和玻璃表面的相容性，将袋和小瓶在5℃±3℃或在25℃±2℃孵育长达四周，时间点分别为1天、2天、4天、7天和28天。在每个时间点，将样品从袋和小瓶中取出并储存在≤-65℃直到样品分析。
如上所述，通过以下方法分析与玻璃相比腺病毒制剂与塑料的相容性以及与T＝0对照样品相比的相容性：蛋白内源荧光强度；六邻体蛋白含量，通过RP-UPLC；总蛋白含量，通过在280nm的吸光度；腺病毒颗粒浓度，通过vp-QPCR；腺病毒颗粒浓度，通过AEX-UPLC；以及效力(感染性)，通过基于QPCR的效力测定(QPA)。对所有时间点的所有袋和小瓶都进行了这些分析，除vp-QPCR分析(进行该分析仅用于选择样品)。
为了进一步评估标准制剂1与生物处理袋不相容的意外发现(见结果部分)，对其他接触材料和时间点进行研究。将制剂1中在3.0×1011VP/mL的浓度的Ad26腺病毒在5℃±3℃或在25℃±2℃孵育长达六个月，在生物处理袋(赛多利斯公司(SartoriusStedim Biotech GmbH))、在HyQ Cx5-14生物处理袋(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))、或在PureFlex Mobius生物处理袋(密理博公司(Millipore))中；在所有情况下，将25mL的制剂填充至50ml袋中。玻璃瓶(Nuova Ompi)包括为对照。
在0天、1天、2天、5天、6天、7天和14天及1个、2个、3个、4个、5个和6个月的时间点，从袋和小瓶中取出样品并使用以上描述的方法分析相容性。
结果和结论
图1-3显示了制剂1中Ad26腺病毒与玻璃或塑料的相容性。固有荧光显示蛋白质含量和构象、六邻体蛋白质的六邻体峰面积量、以及在280nm处总蛋白质浓度的吸光度。令人惊讶的是，结果显示出当制剂1与塑料表面接触时，已经在5℃或25℃ 1天后，蛋白质(总蛋白和病毒)的量减少。在第一周期间，下降最大，在此期间，蛋白质含量下降大约20％-30％。在较低的温度下，降解仅稍微缓解。这种效应显然是由塑料表面的存在所引起的，因为当在玻璃瓶中孵育时，材料没有显示蛋白质含量的这些变化。病毒与塑料的这种不相容性是非常意想不到的发现，因为塑料生物处理袋通常用于生产和储存蛋白质、病毒和其他生物制品。
病毒颗粒浓度遵循相似的趋势(图4和5)，与玻璃瓶样品没有显著降低相比，在与生物处理袋接触的样品中降低近50％。图6显示感染性颗粒受该效应的影响，使得生物处理袋中样品中的病毒蛋白质和颗粒的效力同时下降。
当样品经受冷冻/解冻应激时观察到相似的效应(图7)。在单个冷冻/解冻循环后，袋中物质显示蛋白质含量的明显下降，而玻璃中样品指示材料本身对这种应激条件有抗性。因此，病毒材料的冷冻储存不是可以预防表面诱导降解的解决方案。
为了研究不相容性是否特定于图1-7中使用的生物处理袋的类型，也测试了若干种其他类型的塑料袋的相容性。图8显示了与玻璃瓶相比，储存在三种类型的生物过程袋中的病毒制剂的效力(以感染性颗粒的浓度表示)。当病毒材料与任何塑料接触时，效力在5℃和25℃都强烈下降。另一方面，存储在玻璃瓶中的病毒材料显示出良好的相容性，并且在两种温度下都比在生物处理袋的降解速率慢得多。这表明病毒与塑料的不相容性与塑料的类型无关，并且通过改变袋的不同类型该问题不容易被缓解。
结果表明，标准制剂1在与塑料表面接触时会迅速降解，并且这种不相容性不能通过例如较低温度、冷冻储存或不同类型的塑料轻易地缓解。这对于制造、运输和存储此类材料提出了实际问题，因为塑料通常用于单次使用的生物处理袋和储存容器中。
实例2
实验设计和方法学
将包含Ad26腺病毒(如描述在[1]中)的腺病毒制剂通过超滤/渗滤(使用装配有Pellicon XL Biomax 300过滤器的Sartoslice，Millipore)浓缩并重新配制为制剂1、2和3(如表1中所定义)。制剂1是实例1中使用的标准制剂，制剂2是如文献[2]中描述的常用腺病毒制剂，并且制剂3是常用缓冲液PBS。这三种制剂在pH、缓冲物种以及其他赋形剂的存在和浓度方面不同。
随后，使用合适的制剂缓冲液将一半材料稀释至1.0×1011VP/mL(制剂1)或1.5×1011VP/mL(制剂2和3)。另一半加入在合适的制剂缓冲液中的羟基丙基β-环糊精(HBCD)贮备液直至最终浓度为5％(w/w)HBCD，以获得制剂1、2和3+HBCD(表1)。这些制剂也使用合适的制剂缓冲液稀释至相同滴度。在测试材料与生物处理袋的相容性之前，在T＝0从所有制剂取得对照样品。
表1：在此研究中测试的制剂。
为了评估有或没有HBCD的腺病毒制剂1、2和3与塑料的相容性，将25mL各制剂填充到50mL 生物处理袋(赛多利斯公司(Sartorius Stedim Biotech GmbH))中，每种制剂n＝3。将这些袋在25℃±2℃孵育，时间点为在2天或3天以及在7天或8天。在每个时间点，将样品从袋中取出并储存在≤-65℃直到样品分析。
通过以下方法(如以上描述的)分析腺病毒制剂的塑料相容性：蛋白内源荧光强度；六邻体蛋白含量，通过RP-UPLC；以及腺病毒颗粒浓度，通过CE。蛋白荧光和RP-UPLC分别在每个制剂的所有三个袋上一式三份重复进行。为三个袋中的两个进行CE，每个袋和时间点获得单一的可报告值。
结果和结论
结果提供在图9-11中，清楚地显示不含HBCD的腺病毒制剂1、2和3在25℃短期储存期间与塑料不相容性。观察到蛋白内源荧光、六邻体含量、和病毒颗粒浓度的降低。这指示制剂中病毒颗粒和蛋白质的浓度(感染性)在一周内降低约三分之一。如实例1所示，当存储在相容的主要包装材料(如玻璃)中时，制剂1中的Ad26在这些条件下是稳定的，例如关于蛋白质和颗粒含量。如描述在文献[2]中，制剂2是稳定的腺病毒制剂。因此观察到的不相容性对于生物处理袋表面是特定的。
以5％(w/w)在制剂1、2或3+HBCD中存在的HBCD保护了腺病毒免受表面诱导降解。图9-11显示在补充有HBCD的这些制剂中的Ad26与塑料相容，关于蛋白质和颗粒含量。这些数据显示β-环糊精提供针对病毒的塑料表面诱导降解的保护性作用，这些包含在生物处理袋中的液体制剂中。重要的是，由于在所有三种制剂中都观察到了这种效应，尽管它们在pH和赋形剂方面存在差异，但该效应对HBCD具有特异性，并且不取决于制剂。
实例3
实验设计和方法学
在上述实例中，出乎意料地证明，病毒制剂与塑料生物处理袋不相容，并且HBCD的添加提供针对从所述袋的表面诱导降解的保护。为了确定针对表面诱导降解的保护的HBCD的浓度范围，进行了以下实验。将包含Ad26腺病毒(如描述在[1]中)的腺病毒制剂通过超滤/渗滤(使用装配有Pellicon XL Biomax 300过滤器的Sartoslice，Millipore)浓缩并重新配制为制剂2(如表1中所定义)。如描述在文献[2]中，制剂2是常用的腺病毒制剂。随后，该制剂用0、0.2％(w/w)、1％(w/w)或5％(w/w)羟基丙基β-环糊精(HBCD)补充。通过用制剂缓冲液2稀释将所有制剂达到相同的滴定量。在测试材料的塑性相容性之前，在T＝0从所有制剂取得对照样品。
为了评估具有不同HBCD浓度的腺病毒制剂与塑料的相容性，将4mL的每种制剂填充至5mL 生物处理袋(赛多利斯公司(Sartorius Stedim Biotech GmbH))中，每种制剂n＝2。将袋在25℃±2℃孵育以进行相容性研究，时间点为3天和8天。在每个时间点，将样品从袋中取出并储存在≤-65℃直到样品分析。
通过以下方法(如以上描述的)分析腺病毒制剂的塑料相容性：蛋白内源荧光强度；六邻体蛋白含量，通过RP-UPLC；总蛋白含量，通过在280nm的吸光度；腺病毒颗粒浓度，通过CE；以及效力(感染性)，通过基于QPCR的效力测定(QPA)。
结果和结论
图12-16分别显示了与塑料生物处理袋接触8天之后四种制剂的蛋白内源荧光、总蛋白浓度(通过在280nm的吸光度)、六邻体蛋白含量(通过RP-UPLC)、腺病毒颗粒浓度(通过CE)和效力(通过QPA)。在T＝0，所有制剂的蛋白质和颗粒含量是相同的，但是在孵育之后，取决于制剂中的HBCD浓度，这些属性有明显下降。具有5％HBCD的制剂与塑料相容，而0或0.2％HBCD的制剂在与塑料接触过程中有相当程度的降解：观察到病毒蛋白浓度、颗粒含量和效力下降20％-30％。具有1％HBCD的制剂在相容性方面显示一些改善，但不如具有5％HBCD的制剂。因此，HBCD已经可以按1％的浓度保护表面诱导降解，但是在更高浓度下其效力增加。
高于5％并且高达至少30％可以实现全面保护，并且制剂与塑料相容。因此，HBCD浓度的上限是由安全性和可注射性限度确定的。HBCD在水性溶液中高度可溶，并且制剂的粘度以及由此的可注射性仍处于高达50％的HBCD浓度的可行范围内[3]。HBCD具有良好的安全性和耐受性，并且在每天肠外给药高达24g的HBCD之后没有观察到任何副作用[4]。30％HBCD的溶液的渗透压为约200-215mOsm/L，取决于摩尔取代，因此可以是等渗制剂的一部分。考虑到相容性、粘度和注射性、安全性和耐受性的因素，可用于保护表面诱导降解的HBCD的范围为1％(w/w)-30％(w/w)。
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Claims (11)

1.一种用于保护病毒免受表面诱导降解的方法，其中所述病毒包含在由塑料组成的袋中的溶液中，并且其中所述方法包括以在约1％(w/w)至约30％(w/w)之间的浓度将β-环糊精添加至所述溶液中的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述β-环糊精选自下组：二甲基-β-环糊精、2-羟基乙基-β-环糊精、2-羟基丙基-β-环糊精、3-羟基丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述β-环糊精是2-羟基丙基-β-环糊精。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述塑料选自下组：乙烯乙酸乙烯酯、聚酰胺和聚乙烯。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述袋是生物处理袋。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述病毒是腺病毒。
7.β-环糊精用于保护病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述病毒包含在溶液中，该溶液包含在塑料生物处理袋中。
8.根据权利要求7所述的β-环糊精用于保护病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述β-环糊精选自下组：二甲基-β-环糊精、2-羟基乙基-β-环糊精、2-羟基丙基-β-环糊精、3-羟基丙基-β-环糊精和三甲基-β-环糊精。
9.根据权利要求8所述的β-环糊精用于保护病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述β-环糊精是2-羟基丙基-β-环糊精。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的β-环糊精用于保护病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述塑料选自下组：乙烯乙酸乙烯酯、聚酰胺和聚乙烯。
11.2-羟基丙基-β-环糊精用于保护腺病毒免受表面诱导降解的用途，其中所述腺病毒包含在溶液中，该溶液包含在乙烯乙酸乙烯酯生物处理袋中。
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