CN108120704B - 一种啶虫脒的荧光检测方法 - Google Patents

一种啶虫脒的荧光检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种啶虫脒的荧光检测方法，所述方法包括如下步骤：S1：对碳量子点进行活化，然后将碳量子点平均分成两份，其中一份加入对啶虫脒有特异识别作用的核酸适配体溶液，另一份加入核酸适配体互补链溶液，经振荡偶联后，将两份溶液混合得碳量子点混合液；S2：用电泳方法将S1所得碳量子点混合液中剩余的核酸适配体及其互补链分离，得到只含适配体及互补链修饰的碳量子点溶液；S3：将待测啶虫脒样品加入至S1所述碳量子点混合液中，震荡使反应，然后用分子荧光光度计测量溶液的荧光强度。本发明通过将对啶虫脒有特异识别作用的核酸适配体及其互补链修饰到碳量子点上，利用啶虫脒加入前后碳量子点荧光强度的改变，建立了一种啶虫脒的快速、灵敏的检测方法。

Description

一种啶虫脒的荧光检测方法
技术领域
本发明涉及分析化学检测技术领域，具体地，涉及一种啶虫脒的荧光检测方法。
背景技术
碳量子点是一种新型的纳米材料，具有吸收光谱宽、发射光谱窄且对称、发射波长可控、不易发生光漂白、量子产率高、斯托克斯位移大等优点，是一种非常理想的荧光材料。基于其优良的光电特性，碳量子点在众多领域中得到了深入的研究和应用，如生物领域（细胞成像以及动物活体成像）、分析领域（检测金属和非金属离子、小分子化合物等）、能源领域（碳量子点敏化太阳能电池等）和光电器件等等。
啶虫脒属氯化烟碱类化合物，是一种新型杀虫剂。文献报道的关于蔬菜、茶叶等样品中的啶虫脒分析方法主要是通过液液萃取、固相萃取和固相微萃取等样品前处理方法对目标分析物进行分离富集，洗脱后利用高灵敏度的液相色谱-质谱（HPLC-MS），气相色谱-质谱（GC-MS）等仪器进行定性和定量分析。这些分析方法结合了色谱的强大的分离能力和质谱的高灵敏的定量能力，可以实现对目标物检测。但存在操作步骤繁琐，选择性不高，分析周期长等缺点。
因此，亟需建立一种选择性强、灵敏度高，同时又能实现富集和检测为一体的快速高效的分析方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种啶虫脒的荧光检测方法。
本发明通过将对啶虫脒有特异识别作用的核酸适配体互补链修饰到碳量子点上，利用啶虫脒加入前后碳量子点荧光强度的改变，建立了一种啶虫脒的快速、灵敏的检测方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种啶虫脒的荧光检测方法，所述方法包括如下步骤：
S1：对碳量子点进行活化，然后将碳量子点平均分成两份，其中一份加入对啶虫脒有特异识别作用的核酸适配体溶液，另一份加入核酸适配体互补链溶液，经振荡偶联后，将两份溶液混合得碳量子点混合液；
S2：用电泳方法将S1所得碳量子点混合液中剩余的核酸适配体及其互补链分离，得到只含适配体及互补链修饰的碳量子点溶液；
S3：将待测啶虫脒样品加入至S1所述碳量子点混合液中，震荡使反应，然后用分子荧光光度计测量溶液的荧光强度。
本发明提供的检测方法通过将核酸适配体和互补链分别修饰到碳量子点上，在没有与啶虫脒混合的时候，核酸适配体和互补链结合导致碳量子点团聚荧光淬灭；当将碳量子点溶液和啶虫脒混合时，修饰了核酸适配体的碳量子点与啶虫脒结合，进而碳量子点不再团聚，荧光恢复；利用这个原理实现对啶虫脒的检测。
优选地，S1中，所述碳量子点混合液的质量浓度为1.0～8.0*10-4mg/mL；更为优选地，所述碳量子点混合液的质量浓度为1.6*10-4mg/mL。
优选地，S1中，所述核酸适配体溶液的浓度为0.1～3nmol/L；更为优选地，所述核酸适配体溶液的浓度为1.92nmol/L。
优选地，S3中，反应温度为21～37℃，反应时间为5～120min；更为优选地，反应温度为21℃，反应时间为30min。
优选地，S1中，所述碳量子点的制备方法如下：
S11：将柠檬酸溶解于水中，然后加入乙二胺并搅拌形成均一溶液；
S12：将S11所得均一溶液于160～200℃条件下反应2～7h，经透析、干燥后即得所述碳量子点。
优选地，S12中，反应时间为5h。
优选地，S12中，透析的时间为24～72h。
优选地，S1中，将碳量子点溶液与乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合并振荡即得活化后的碳量子点。
优选地，S3中，将待测啶虫脒样品加入至S1所述碳量子点混合液中，常温下振荡耦联2h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过将对啶虫脒有特异识别作用的核酸适配体及互补链修饰到碳量子点上，利用啶虫脒加入前后碳量子点荧光强度的改变，实现对啶虫脒的检测。本发明提供的方法的选择性高使得该方法可以选择性地检测啶虫脒而不受其它干扰物质的影响。本发明提供的检测方法大大拓展了碳量子点在农药残留分析中的应用。
附图说明
图1为使用核酸适配体功能化的碳量子点检测啶虫脒的原理示意图；
图2为荧光碳量子点的透射电镜图；
图3为碳量子点浓度与荧光体系的关系图；
图4为核酸适配体浓度与荧光体系的关系图；
图5为碳量子点与啶虫脒的反应时间与荧光体系的关系图；
图6为碳量子点与啶虫脒的反应温度对荧光体系的关系图；
图7为不同浓度的啶虫脒加入核酸适配体功能化的碳量子点溶液后的荧光图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1
一种啶虫脒的荧光检测方法，包括如下步骤：
（1）荧光碳量子点的制备
取1.5 g柠檬酸溶于15～20ml水中，磁力搅拌5min使固体全部溶解；用移液枪加入500 μl乙二胺，磁力搅拌10 min，形成均一溶液；将溶液转移到水热反应釜，在200℃下反应5h；将溶液转入已预处理好的透析袋（截留量为500）透析36h；冷冻干燥得到粘稠状的棕色碳量子点固体。
（2）碳量子点的活化及适配体功能化
取3.5μg/ml 的碳量子点溶液30ml与60mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和25mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）混合，室温下振荡15min，得到活化的碳量子点溶液；将已活化好的碳量子点平均分成2份，其中一份加入300μl对啶虫脒有特异识别作用的核酸适配体溶液，另一份加入300μl核酸适配体互补链溶液，常温下振荡偶联2h后，将两份溶液混合。
（3）荧光检测啶虫脒
将啶虫脒配制成不同的浓度的溶液，加入混合后的碳量子点溶液中，常温下震荡30 min，用分子荧光光度计测量系统检测溶液的荧光强度。根据Stern-Volmer equation（FO/F=1+Ksv[c]）以浓度[c]为横坐标，相对荧光强度（Fo /F）为纵坐标绘制荧光响应曲线。比较碳量子点在适配体修饰前后啶虫脒对其荧光的影响，评价分析方法的选择性。
图1为使用核酸适配体功能化的碳量子点检测啶虫脒的原理示意图，图2为荧光碳量子点的透射电镜图。
实施例2
一种啶虫脒的荧光检测方法，包括如下步骤：
（1）荧光碳量子点的制备
取2.0 g柠檬酸溶于15～20ml水中，磁力搅拌5min使固体全部溶解；用移液枪加入500～600 μl乙二胺，磁力搅拌10 min，形成均一溶液；将溶液转移到水热反应釜，在160～200°C下反应5h；将溶液转入已预处理好的透析袋（截留量为500）透析24～72h；冷冻干燥得到粘稠状的棕色碳量子点固体。
（2）碳量子点的活化及适配体功能化
取4 μg/ml 的碳量子点溶液28ml与50mg的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和30 mg N-羟基丁二酰亚胺（NHS）混合，室温下振荡15min，常温下震荡15min，得到活化的碳量子点溶液；将已活化好的碳量子点溶液平均分成两份，其中一份加入核酸适配体溶液，另一份加入核酸适配体互补链溶液，常温下震荡反应2h，将两份溶液混合。
（3）荧光检测啶虫脒
将啶虫脒配制成不同的浓度的溶液，加入混合后的碳量子点溶液中，常温下震荡30 min，用分子荧光光度计测量系统检测溶液的荧光强度。根据Stern-Volmer equation（FO/F=1+Ksv[c]）以浓度[c]为横坐标，相对荧光强度（Fo/F）为纵坐标绘制荧光响应曲线。比较碳量子点在适配体修饰前后啶虫脒对其荧光的影响，评价分析方法的选择性。
表1实施例1提供的荧光检测方法与文献报道的方法比较
分析方法 检出限（LODs）
液相-飞行时间质谱（LC-TOF-MS） 0.002 mg·kg<sup>−1</sup>
液相-质谱联用（UHPLC-MS/MS） 1.49 μg·kg<sup>−1</sup>
气相色谱（GC-ECD） 0.32 ng·mL<sup>−1</sup>
电化学分析 1 nM
光电化学分析 180 pM
本方法 0.16 pg/ml
本发明上述各实施例中的荧光分析检测方法的建立按如下方式进行：
将适量碳量子点荧光溶液和已知浓度的一系列目标物浓度溶液加入到10 mL容量瓶中，室温下超声30 min后置于40 ℃水浴中12 h。用分子荧光光度计测量系统检测溶液的荧光强度。根据Stern-Volmer equation（FO/F=1+Ksv[c]）以浓度[c]为横坐标，相对荧光强度（Fo/F）为纵坐标绘制荧光响应曲线。选择S型和R型的混合物的布洛芬溶液，评价其手性识别能力。
本发明还考察了碳量子点浓度、核酸适配体溶液浓度对荧光体系的影响，以及反应时间和温度对荧光强度的影响，具体如下。
（1）考察碳量子点浓度对体系的影响
碳量子点与适配体的耦合效率与碳量子点的浓度相关。当体系中碳量子点浓度较高时，颗粒之间的碰撞概率较大，容易发生耦合，但是浓度过高可能产生较高的背景，降低检测灵敏度；而当体系中碳量子点浓度较小时，颗粒之间的碰撞概率较小，难于发生耦合；因此首先优化了碳量子点探针的浓度。由图3可以看出，当碳量子点的浓度为1.6*10-4mg/mL时，荧光增强幅度最大，荧光增强效率最大；当浓度继续加大时，猝灭效率反而降低，这可能因为碳量子点浓度过高，背景也同步增大的原因。因此，选择碳量子点浓度1.6*10-4mg/mL用于后续实验。
（2）考察核酸适配体溶液浓度对体系的影响
碳量子点表面修饰的适配体负载量过高，将不利于核酸适配体二级结构的形成，影响两条核酸适配体的特异性结合，同时也阻碍啶虫脒与核酸适配体的特异性结合；修饰的核酸适配体较少，则难于实现颗粒之间的团聚。本实验考察了适配体的修饰量对于该检测体系的影响。图4所示为固定碳量子点的浓度，不同核酸适配体修饰浓度得到的碳量子点在与啶虫脒作用下的荧光增强效率对比图。我们可以看出，当核酸适配体的浓度为1.92 nmol/L时，荧光增强效率达到最佳，因此我们使用1.92 n mol/L的浓度用于后续实验。
（3）考察反应时间和温度对荧光强度的影响
碳量子点与适配体的耦合受反应时间影响，因此考察了反应时间对实验的影响。图5所示为不同耦合时间荧光增强效率的时间变化柱状图。结果表明，适配体与碳量子点的耦合，先是随着耦合时间的增加而碳量子点荧光强度逐渐增加，大约 30 min 后荧光强度达到最大值，并且荧光强度相对稳定。因此，选择反应时间为 30 min，用于后续实验。
碳量子点与适配体的耦合与温度密切相关的，因此还考察了温度对啶虫脒检测的影响。图6所示为 21~37℃不同温度适配体存在下，碳量子点荧光增强效率的影响，结果表明，在此温度范围内碳量子点荧光增强效率有所变化。为使实验方便进行，本实验选择室温21℃为最佳反应温度，用于后续实验。
（4）考察分析方法的选择性
选择了噻虫嗪、噻虫胺等与啶虫脒结构相似的药物，在同样的条件下分别用该核酸适配体对三种药物进行特异性检测。由于核酸适配体对噻虫嗪和噻虫胺没有明显的特异性结合，因此碳量子点没有明显的荧光增强现象，相关系数分别为0.5和0.1。而啶虫脒与该核酸适配体有明显的特异性结合，线性相关的R2达到0.9898.
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种啶虫脒的荧光检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：对碳量子点进行活化，然后将碳量子点平均分成两份，其中一份加入对啶虫脒有特异识别作用的核酸适配体溶液，另一份加入核酸适配体互补链溶液，经振荡偶联后，将两份溶液混合得碳量子点混合液；所述碳量子点混合液的质量浓度为1.0～8.0*10-4mg/mL；所述核酸适配体溶液的浓度为0.1～3nmol/L；
S2：用电泳方法将S1所得碳量子点混合液中剩余的核酸适配体及其互补链分离，得到只含适配体及互补链修饰的碳量子点溶液；
S3：将待测啶虫脒样品加入至S1所述碳量子点混合液中，震荡使反应，然后用分子荧光光度计测量溶液的荧光强度。
2.根据权利要求1所述荧光检测方法，其特征在于，S1中，所述碳量子点混合液的质量浓度为1.6*10-4mg/mL。
3.根据权利要求1所述荧光检测方法，其特征在于，S1中，所述核酸适配体溶液的浓度为1.92nmol/L。
4.根据权利要求1所述荧光检测方法，其特征在于，S3中，反应温度为21～37℃，反应时间为5～120min。
5.根据权利要求4所述荧光检测方法，其特征在于，S3中，反应温度为21℃，反应时间为30min。
6.根据权利要求1所述荧光检测方法，其特征在于，S1中，所述碳量子点的制备方法如下：
S11：将柠檬酸溶解于水中，然后加入乙二胺并搅拌形成均一溶液；
S12：将S11所得均一溶液于160～200℃条件下反应2～7h，经透析、干燥后即得所述碳量子点。
7.根据权利要求6所述荧光检测方法，其特征在于，S12中，反应时间为5h。
8.根据权利要求1所述荧光检测方法，其特征在于，S1中，将碳量子点溶液与乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺混合并振荡即得活化后的碳量子点。
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