CN108079054A - 含丹参有效成分的药物组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含丹参有效成分的药物组合物及其制备方法与应用，该药物组合物由以下药物浓度的组分混配而成：丹参素(DSS，S)1.5×10‑4mol/L,丹酚酸A(SAA，A)7×10‑6mol/L,丹参酚酸B(SAB，B)3×10‑4mol/L,原儿茶酚(PAL，L)5×10‑4mol/L，四个组分的比例关系为S：A：B：L是150：7：300：500。本发明诠释丹参“活血化瘀，通脉养心”作用的现代生物学基础，以期明确丹参抗心脑血管疾病的物质基础和部分作用机制，为进一步开发研制新药、指导临床运用提供实验依据，同时本发明在治疗高血压方面具备很好的疗效。

Description

含丹参有效成分的药物组合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及中医药学领域，具体涉及一种含丹参有效成分的药物组合物及其制备方法与应用。
背景技术
方剂是中医药学理、法、方、药的一个重要组成部分，是在辨证立法的基础上选药配伍组成的，是中医临床用药的主要形式和手段，其配伍规律有着深刻的科学内涵。方剂配伍规律的研究和实践是发展中医药学，促进中医药现代化的重要环节。尽管这方面的工作也进行了多方面的研究，从理论和实践中对中医方剂配伍进行了探索，但对方剂配伍规律和机制仍有必要进行深入的研究。特别是中医药缺乏对药效物质的微观分析和作用机理的科学阐释，成为影响中医药迅速发展的瓶颈。方剂作为连接医药学理论和临床实践的桥梁，集中体现了中医药治疗疾病的特色。方剂配伍理论研究是方剂关键科学问题的基础及要点。深入研究方剂配伍，寻找更新方法和模式，有可能从中发掘出具有民族知识产权的医药研究内容，从而对世界医学做出贡献。中医药研究应把握中医的精髓，坚持在中医理论指导下开展组分中药研究。作为一种药物，组分中药必须符合安全、有效、稳定、可控的质量要求。现阶段研究应从功效相关的活性成分群出发，建立有效性、安全性及稳定性控制指标来实现传统药物的质量监控。中药有效组分配伍是中药配伍的新模式，该模式可以显著提高疗效，有利于促进中医药内涵现代化，是现代中医药研究的重要内容之一。针对中药对发病环节的药理作用，通过中药有效成分/组分的加和或协同作用进行有效组分组方，其质量稳定可控，并能够提高有效成分含量，增强疗效。现代对中药化学成分及其药理作用的研究结果为有效成分/组分配伍提供了科学依据。功效配伍是现代中医临床最基本和最重要的配伍理论。有效成分/组分配伍的目标是：1.较高的安全性。2.临床适应症明确且针对性好。3.物质基础及作用原理相对清楚。4.质量稳定可控，能够产业化推广。5.具有自主知识产权的药物。有效成分/组分配伍的实现途径是:1.从有效复方中寻找最佳有效组分配伍；2.构成复方的有效成分/组分配伍；3.作用靶点和机理相对清楚的有效成分/组分配伍；4.单位药的组分比例调节。
无论是单味中药还是中药复方，其发挥疗效的物质基础都是它的化学组成成分。然而中药的化学组成一般相当复杂，即使是单味中药也常含有数十甚至上百种化学组成成分，众多化学成分构成了复杂的相互作用体系，这些相互作用就是中药整体效应的基础。如果通过对这些化学成分进行逐一的药效研究，来阐明中药的确切药效物质基础以及作用机制，工作量将会十分巨大。从中合理、有效的筛检出药理活性成分进行研究，将对研究中药复方的确切药效物质及其配伍规律起到事半功倍的效果。目前对组分配伍的研究已经不再单纯局限于对方剂中的组分进行研究,它逐步扩大到单味药中的组分配伍和标准物质的组分配伍,并且取得了不少积极的进展。每一味中药是单方，其中的组分比例是相对固定的，将其中的组分调整，药物的作用即出现差异。不同的煎煮和炮制方法使药性和有效组分改变即属此类，炮制方法等使药性及作用的改变即属此类。将其中的某一成分提出，应用时已和原药材药性相异。单味药的标准组分应用及改变组分比例,可获最佳作用，都有可能从中发现新药。中药组分配伍有可能成为中药新药研发的新方向和中医方剂配伍理论的继承与延伸，但还需要更多的研究基础来支撑。
丹参是我国传统医学中常用中药之一，俗有“一味丹参，功同四物”之称，有悠久的临床应用历史。如：丹参散出自《妇人良方》卷二，据《本草纲目》记载，丹参散，即用丹参洗净，切片，晒干，研细。每服二钱，温酒调下。此方称“丹参散”。主治月经不调，产前胎动，产后恶血不下，冷热劳，腰脊痛，骨节烦疼等症。即以一味丹参组方。而“一味丹参散，功同四物汤”语出《妇人明理论》，是语影响颇钜。许多医学著作中皆有转载论述。如《本草纲目》云：“按妇人明理论：四物汤治妇人病，不问产前产后，经水多少，皆可通用，唯一味丹参主治与之相同，盖丹参能破宿血…其功大类同当归、地黄、川芎、芍药故也。”及《本草从新》说：“丹参补心，去瘀生新…功兼四物为妇科要药。”近几十年，采用现代科学方法和技术手段对丹参进行了较系统的研究，取得大量新的认识和实验结果，并开发出一系列疗效良好的临床应用药物。丹参的传统应用方式为水煎液，因此，其有效成分应以水溶性物质为主。对丹参水溶性有效成分的研究是近20年来研究丹参的重要内容，最初分离出的水溶性成分为丹参素(DSS)。实验证明：丹参水溶性成分原儿茶醛(PAL)、丹参素的扩张心脑血管作用较二萜醌类的丹参酮更强，是抗心肌缺血的主要成分。丹参素能扩张肠系膜微动脉，具有抗血小板聚集，抗血栓形成，促进纤维蛋白降解及抗心肌缺血作用。除丹参素外，丹酚酸A(SAA)、丹酚酸B(SAB)和原儿茶醛也是丹参水溶性的主要成分，大量的实验已经证明每个组分对心、脑、肝、肾等器官均具有重要药理作用。表现在：通过清除自由基，抑制脂质过氧化反应，降低缺血心肌组织中MDA的含量，提高SOD的活力，对抗氧自由基对心肌细胞的毒害作用，对心肌细胞的保护作用，抗氧化作用，以及对心脑血管的保护作用。而且，通过减少内皮素(ET)及肿瘤坏死因子a(TNF-a)的释放、改善血栓素/前列环素(TXA2/PGI2)系统的平衡状态、降低缺氧/复氧损伤后内皮细胞细胞间粘附分子的表达，起到保护内皮细胞的作用和对防治动脉粥样硬化有重要意义。丹参注射液(Salivia MiltiorrhizaInjection，SMI)是一种因具有增加冠状动脉血流量、抗心肌缺血等药理作用而被广泛应用于临床的中药制剂，主要含有丹参素、丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛和迷迭香酸(RosA)等水溶性成分。
长期以来，人们对心脑血管病的研究主要聚焦在平滑肌和内皮，而对血管外膜的研究没有给以足够的重视，仅仅停留在对血管和交感神经末梢的支持(scaffold)，和血管滋养管(vasa vasorum)的认识上，最新的证据显示：血管外膜在心血管的正常调节和疾病发生过程中发挥着关键的作用。它的重要性不仅体现于它在血管性疾病中的作用，更重要的是它在维持血管正常的平衡状态中发挥着不可替代的作用，表现为血管外膜成纤维细胞作为一个生物学处理中心从外向内(outside-in)调节血管的结构和功能。血管在应答应激和损伤的过程中，外膜成纤维细胞首先被快速激活，成纤维细胞本身改编(reprogramming)而显示不同功能和结构的行为，包括增殖、分化、迁移以及细胞外基质蛋白的上调，细胞因子的释放，刺激感染和始祖细胞向血管壁的募集直接影响中层平滑肌细胞的协调和生长及内膜的改变，被称为是血管重建的第一个应答子和始动因素。血管外膜从外向内调节和应答血管的应激和损伤，维持血管的稳定，表现在两个方面：第一，外膜提供对中层和内膜损伤过程中起修复作用的迁移型肌成纤维细胞(migratory myofibroblasts)表型的资源。第二，外膜调节局部环境，维护血管的完整性，是产生局部体液免疫应答的非迁移型成纤维细胞表型和炎性细胞的仓库。血管外膜成纤维细胞对血管的调节机制具体体现在以下几个部分：
⑴.血管壁结构和细胞组成从外向内调节
大量的实验数据已经证明血管外膜成纤维细胞在血管应答应激和损伤过程中起着显著的作用，血管外膜成纤维细胞快速应答并调节它们的功能，外膜成纤维细胞表型各自以独特的方式和信号转导路径，通过增殖，分化和迁移去适应局部血管的需要。在动物模型中，外膜成纤维细胞经历分化成迁移型肌成纤维细胞(migratory myofibroblasts)表型和非迁移型成纤维细胞(non-migratory myofibroblasts)表型，我们和其他的同行观察发现非迁移型成纤维细胞又分为纺锤形(spindle-shaped)，上皮状(epithelioid)和斜方形(rhomboid)[。其中，一些表型细胞在环境因素(自分泌和旁分泌因子及机械压力等)的影响下发挥自身的特性能够自身更新(renewing)，在体内外形成平滑肌细胞和内膜细胞等。迁移型肌成纤维细胞被称为领头细胞(pacemaker cell),带领细胞进入邻近的细胞群体成为邻近细胞的组成成员，在细胞群体中领头细胞的存在支持细胞异质性(heterogeneity)的本质和特征。实验证明：在缺氧等刺激下，最早的最显著的结构改变是在血管的外膜部分，特别是在早期血管外膜成纤维细胞被发现持续的增殖改变，进而发生在中层的平滑肌细胞和内皮细胞。在应激和损伤的情况下，外膜成纤维细胞的增殖是通过激活Gα1和Gq激酶家族成员，在外膜部分细胞外ATP增加，作为自分泌和旁分泌调节子应答应激和损伤，ATP的增加被GPC(G-protein-couple P2Y)受体调节，同时激活Gα1-couple路径，部分外膜成纤维细胞的表型直接或间接地上调α-SM actin的表达，说明应激和损伤在成纤维细胞转化成肌成纤维细胞过程中起到了直接的作用。在慢性应激和损伤过程中，外膜成纤维细胞发生了稳定的表型改变，出现相关信号路径的改变以促进增殖，已经清楚地发现在血管外膜有大量的外膜成纤维细胞表型的存在，但细胞表型的克隆和鉴定以及每一个细胞表型在应答血管应激和损伤过程中的特殊细胞功能和独特的信号路径尚不清楚，一些同行认为，外膜成纤维细胞具有局部干细胞样(local stem-cell-like)的特征。所以进一步的工作需要去证明外膜成纤维细胞表型的分类和功能及其在许多人类血管疾病中的精细作用，重要的细胞表型在基因和基因产物中的独特特征。
⑵.血管炎性从外向内调节：血管受损，新生内膜发生之前，外膜和血管周围组织已经募集了较高的中性粒细胞，巨噬细胞，淋巴细胞和凋亡细胞，并且一些相关的基因和炎性分子被表达。另外，在血管损伤过程中，一些趋化信号刺激外膜并分泌一些信号分子共同完成血管损伤的修复过程，最近研究发现当血管受损和应激过程中，CXCL2(Chemokine(C-X-C motif)ligand 2)，也称为MIP2-alpha(macrophage inflammatory protein 2-alpha)早期(3天之内)在血管外膜瞬间上调，之后出现新生内膜的发生(7天)。CCL2(Chemokine(C-C motif)ligand 2)，也称为MCP-1(monocyte chemoattractant protein-1)一个靶向炎性分子和潜在的白细胞趋化因子在外膜成纤维细胞和外膜肌成纤维细胞中高效表达。在气囊血管成形术后2小时发现外膜和血管周围组织大量中性粒细胞的堆积，数小时后血管外膜的滋养管内皮发现P-selectin和VCAM-1的表达上调，14天后在外膜的表达渐弱，中层和内膜出现P-selectin和VCAM-1的表达。同时，外膜首先发生的炎性变化为外膜成纤维细胞表型分化提供了重要的环境。
⑶.血管氧化应激从外向内调节
研究表明：由于高血压性血管疾病是各种心血管疾病的一个主要的危险因子，其中包括修克，心肌梗死，充血性心力衰竭和肾脏微血管疾病，发病机制非常复杂，最近证据显示：在高血压发病过程中增加的ROS(reactive oxygen spicies)是一个关键因素，由于高血压和其它的血管疾病发病过程中氧化物的产生和氧化物的催化系统处于严重不平衡状态，导致内源性超氧化物和过氧化氢产生增加。实验证明：血管外膜是一个主要的血管ROS产生的位点，血管受损时，ROS最先在外膜产生，而且在外膜成纤维细胞NADPH氧化酶的活性先于增殖和内膜的生长，外膜成纤维细胞NADPH氧化酶衍生的ROS是血管疾病早期发生发展的信使和传感器，外膜对应激和损伤的快速激活作用被归因于血管外膜细胞内NADPH产生的ROS，并直接和间接影响新生内膜的增生和中层平滑肌细胞的肥大。同时，外膜首先发生的ROS的增加也为外膜成纤维细胞表型分化提供了重要的环境。
基于上述中药丹参及其有效成分/组分的研究发现，丹参的作用靶点侧重于血管。同等有效剂量范围内，其扩张冠脉的能力强于其它作用,不仅具有抗心肌缺血作用，而且还有增强缺血预适应效果，作用机制是扩张冠状动脉和激活内源性保护物质的释放。我们实验室首次从血管外膜成纤维细胞克隆了preproET-1的mRNA序列(accessionno.AB081657)，首次发现在血管外膜成纤维细胞中在血管紧张素II(Ang II)刺激下内皮素(ET-1)的合成和释放，并导致细胞外基质中胶原的合成。进而，我们又证明了在外膜成纤维细胞局部产生的功能性ET-1被氧化应激所激活。我们和其他的同行通过AngII刺激小鼠胸主动脉外膜和内膜NADPH氧化酶衍生的ROS的产生和中层平滑肌细胞的肥厚，而且这种刺激在NOX2缺陷的鼠中被显著的降低，表现在血管外膜和内膜NADPH氧化酶被降低，表明血管外膜和内膜NADPH氧化酶衍生的ROS在中层平滑肌细胞的肥厚过程中的旁分泌作用。在颈动脉外膜成纤维细胞用腺病毒结构靶向过表达nox2:p47phox相互作用的抑制剂gp91ds,测试血管外膜的NADPH衍生的H2O2本身能够影响中层平滑肌细胞的肥厚，而且除了外膜成纤维细胞在部分巨嗜细胞中也发现该抑制剂的表达。结果证明：该抑制剂的表达显著的降低了中层ROS的水平和平滑肌的肥厚。需要指出的是：在Ang II诱导的高血压等疾病中明确的显示了巨噬细胞定位在血管外膜和诱导中层平滑肌的肥厚。一些数据已经证明血管外膜细胞在新生内膜增值方面的作用，特别是在血管内膜损伤的模型中，血管外膜成纤维细胞表型迁移到新生的内膜表明外膜成纤维细胞有促进新生内膜生长的能力。而且在外膜成纤维细胞NADPH氧化酶的活性先于增值和内膜的生长，这些发现证明血管外膜成纤维细胞NADPH氧化酶是一个在血管损伤过程中血管重建的始动因素。血管外膜是血管疾病发生发展过程的始动因素。我们前期的实验也已经证明丹参水溶性有效成分/组分对血管外膜成纤维细胞的增殖、迁移和分化具有显著的影响。
对于以中医方剂配伍理论为基础，按着组分配伍配比规律，研究单味药丹参的多组有效成分对血管外膜成纤维细胞功能的影响，以及组分配伍配比关系对模型和血管外膜成纤维细胞作用机制，均没有任何科学依据与参考，并且在以方剂药位配伍作为临床用药模式的基础上，吸收现代新药研究理论的思维方法，建立方剂中有效组分/成分的配伍配比的模型已迫在眉睫。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于上述中药丹参及其有效成分/组分的研究发现确定的药物组合物，旨在以单味药丹参为范例，以中医方剂配伍理论为基础，按着组分配伍配比规律，将四个丹参水溶性主要成分(丹参素，丹酚酸A、丹酚酸B、原儿茶醛)分成不同的组合，观察不同组合对血管外膜成纤维细胞功能的影响。目的是通过单味药丹参的多组有效成分及组分配伍配比关系对高血压大鼠模型和血管外膜成纤维细胞作用机制，并且在以方剂药位配伍作为临床用药模式的基础上，吸收现代新药研究理论的思维方法，建立方剂中有效组分/成分的配伍配比的模型，阐明有效组分/成分相互作用和它们配伍配比的规律，推进配伍理论创新，为中医临床用药的科学性、规范标准化和提高临床疗效提供理论基础，为创新药物的研究和中药质量控制提供理论基础，为促进中医药事业的发展奠定基础。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种含丹参有效成分的药物组合物，该药物组合物由以下药物浓度的组分混配而成：
丹参素(DSS，S)1.5×10-4mol/L,丹酚酸A(SAA，A)7×10-6mol/L,丹参酚酸B(SAB，B)3×10-4mol/L,原儿茶酚(PAL，L)5×10-4mol/L，四个组分作用于细胞的浓度和比例关系为S：A：B：L是150：7：300：500。
另外提供了一种含丹参有效成分的药物组合物：上述的四个组分作用于动物实验的浓度和比例是：(S:5mg/kg/day,A:0.233mg/kg/day,B:mg/kg/day,L:mg/kg/day)，比例是：S:A:B:L是5:0.233:10:17。
还提供了一种含丹参有效成分的药物组合物的筛选方法，该筛选方法如下：
①试验1：初步筛选丹参中四种药物成分的应用剂量范围：分别采用不同浓度丹参的四种有效成分，对培养的血管外膜成纤维细胞进行干预；
丹参注射液采用浓度为0，1，5，10，50，100g/L；丹参素(DSS，S)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；丹酚酸A(SAA，A)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；丹参酚酸B(SAB，B)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；原儿茶酚(PAL，L)采用浓度为0，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6mol/L，分别培养48h后，检测各组分对血管外膜成纤维细胞增殖的影响，并初步确定各成分浓度的有效剂量范围；
②试验2：进一步确定各组分对本试验的效应和有效剂量，采用均匀设计和正交设计联用的方法，进行组分剂量和配伍的筛选：首先，结合试验1得到的结果，四个组分各选取有效剂量范围内6个不同浓度，按照均匀设计表即4因素6水平均匀表U6(64)安排试验，均匀设计表如下设计：纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数即处理数，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量，以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组，均匀试验6个试验组，加上2个对照试验组，共8个处理组合，分别考察各处理对血管外膜成纤维细胞增殖的影响；试验结果经方差分析和多重比较可得出，6个处理中最优的组分配伍，并初步得到各组分适宜应用的对应剂量；
然后，根据均匀设计得出的结论，在最优的处理中，根据各组分对应剂量相距较近的范围内再次选择低、中、高3个不同剂量，对S、A、B、L四个组分的有效剂量低、中、高进行正交设计试验研究，选择L9(34)正交表，如下设计：纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数即处理数，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量，正交设计中的3个剂量必须在均匀试验最优处理得出的对应剂量附近，以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组，正交试验9个试验组，加上2个对照试验组，共11个处理组合，分别考察各处理组对血管外膜成纤维细胞增殖的影响；
最终将正交试验结果进行分析，可求出最优试验组合，又可以根据直观分析得出各因素对测定指标贡献大小的顺序，并能够得到各个组分的适宜有效剂量以及四组分的最佳配伍方式；
③为进一步验证四组分的最佳配伍方式，根据试验1和试验2的结果，为各组分确定一个最适宜有效剂量，对S、A、B、L四个组分配伍：S、A、B、L，SA、SB、SL、AB、AL、BL、SAB、SAL、SBL、ABL、SABL共15个，再次考察各配伍对外膜成纤维细胞增殖的影响，由此，可进一步验证四种药物组分及其配伍对本试验的影响强弱顺序；
④结合以上试验内容，综合考虑，并进行系统分析各组分的协同或竞争作用，最终得出优选的药物组分最佳配伍；
⑤试验所得数据用DPS7.05统计软件进行处理和统计分析后即得。
还提供了上述所述的含丹参有效成分的药物组合物在治疗高血压方面的应用的技术方案。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明利用药效物质和作用原理两个基本清楚；单味药、有效组分、化学成分三个化学层次；整体、组织、细胞、分子四个药理水平以及在此基础上的配伍配比。对中药方剂中有效组分的化学成分多样，成分之间作用效应复杂进行研究，不仅寻找活性成分，更注重对其不同化学成分组合、量化和相互作用的研究，尤其对综合效应的有效物质组群进行优化研究。本发明在上述理论框架中以丹参四种主要水溶性有效成分配伍配比组方作为研究对象，从整体、组织、细胞、分子四个药理层次进行研究，就丹参有效组分在高血压大鼠模型和外皮成纤维细胞的作用机制及配伍配比特征进行深入探讨，诠释丹参“活血化瘀，通脉养心”作用的现代生物学基础，以期明确丹参抗心脑血管疾病的物质基础和部分作用机制，为进一步开发研制新药、指导临床运用提供实验依据。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是均匀试验和正交试验联用对丹参注射液及其有效活性成分的配伍配比设计图；
图2是高血压大鼠模型建立丹参注射液及其有效活性成分配伍配比的干预作用图；
图3是血管外膜成纤维细胞培养和丹参注射液及其有效活性成分的配伍配比的干预作用图；
图4是丹参注射液及其有效组分配伍配比的作用靶点和作用路径图；
图5是AngII诱导培养的血管外皮膜成纤维细胞产生过氧化物的时间曲线图；
图6(A-D)是AngII诱导血管外皮成纤维细胞产生超氧化物是通过血管紧张素受体1(AT1)和内皮素受体A(ETA)路径实现的所得图；
图7是AngII刺激血管外膜成纤维细胞产生NADPH氧化酶，促进内皮素(ET-1)的表达和释放图；
图8是AngII对在以腺病毒介导超表达SOD1的血管外膜成纤维细胞ET-1mRNA水平的影响图；
图9是AngII对在以腺病毒介导超表达SOD1的血管外膜成纤维细胞I型胶原(CollagenI)蛋白水平的影响图；
图10是AngII对gp91phox基因敲除小鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞ET-1释放的影响图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
本发明主要技术为：含丹参有效成分的药物组合物，由以下药物浓度的组分混配而成：
丹参素(DSS，S)1.5×10-4mol/L,丹酚酸A(SAA，A)7×10-6mol/L,丹参酚酸B(SAB，B)3×10-4mol/L,原儿茶酚(PAL，L)5×10-4mol/L，四个组分作用于细胞的浓度和比例关系为S：A：B：L是150：7：300：500。
还可以用另一种技术方案：上述的四个组分作用于动物实验的浓度和比例是：(S:5mg/kg/day,A:0.233mg/kg/day,B:mg/kg/day,L:mg/kg/day)，比例是：S:A:B:L是5:0.233:10:17。
此含丹参有效成分的药物组合物的筛选方法，主要如下：
①试验1：初步筛选丹参中四种药物成分的应用剂量范围：分别采用不同浓度丹参的四种有效成分，对培养的血管外膜成纤维细胞进行干预；
丹参注射液采用浓度为0，1，5，10，50，100g/L；丹参素(DSS，S)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；丹酚酸A(SAA，A)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；丹参酚酸B(SAB，B)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；原儿茶酚(PAL，L)采用浓度为0，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6mol/L，分别培养48h后，检测各组分对血管外膜成纤维细胞增殖的影响，并初步确定各成分浓度的有效剂量范围；
②试验2：进一步确定各组分对本试验的效应和有效剂量，采用均匀设计和正交设计联用的方法，进行组分剂量和配伍的筛选：首先，结合试验1得到的结果，四个组分各选取有效剂量范围内6个不同浓度，按照均匀设计表即4因素6水平均匀表U6(64)安排试验，均匀设计表如下设计：纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数即处理数，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量，以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组，均匀试验6个试验组，加上2个对照试验组，共8个处理组合，分别考察各处理对血管外膜成纤维细胞增殖的影响；试验结果经方差分析和多重比较可得出，6个处理中最优的组分配伍，并初步得到各组分适宜应用的对应剂量；
然后，根据均匀设计得出的结论，在最优的处理中，根据各组分对应剂量相距较近的范围内再次选择低、中、高3个不同剂量，对S、A、B、L四个组分的有效剂量低、中、高进行正交设计试验研究，选择L9(34)正交表，如下设计：纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数即处理数，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量，正交设计中的3个剂量必须在均匀试验最优处理得出的对应剂量附近，以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组，正交试验9个试验组，加上2个对照试验组，共11个处理组合，分别考察各处理组对血管外膜成纤维细胞增殖的影响；
最终将正交试验结果进行分析，可求出最优试验组合，又可以根据直观分析得出各因素对测定指标贡献大小的顺序，并能够得到各个组分的适宜有效剂量以及四组分的最佳配伍方式；
③为进一步验证四组分的最佳配伍方式，根据试验1和试验2的结果，为各组分确定一个最适宜有效剂量，对S、A、B、L四个组分配伍：S、A、B、L，SA、SB、SL、AB、AL、BL、SAB、SAL、SBL、ABL、SABL共15个，再次考察各配伍对外膜成纤维细胞增殖的影响，由此，可进一步验证四种药物组分及其配伍对本试验的影响强弱顺序；
④结合以上试验内容，综合考虑，并进行系统分析各组分的协同或竞争作用，最终得出优选的药物组分最佳配伍；
⑤试验所得数据用DPS7.05统计软件进行处理和统计分析后即得。
本发明所述的含丹参有效成分的药物组合物在治疗高血压方面的应用。
本发明基于中药丹参及其有效成分/组分的研究发现，丹参的作用靶点侧重于血管。同等有效剂量范围内，其扩张冠脉的能力强于其它作用,不仅具有抗心肌缺血作用，而且还有增强缺血预适应效果，作用机制是扩张冠状动脉和激活内源性保护物质的释放。我们实验室首次从血管外膜成纤维细胞克隆了preproET-1的mRNA序列(accessionno.AB081657)，首次发现在血管外膜成纤维细胞中在血管紧张素II(Ang II)刺激下内皮素(ET-1)的合成和释放，并导致细胞外基质中胶原的合成。进而，我们又证明了在外膜成纤维细胞局部产生的功能性ET-1被氧化应激所激活。我们和其他的同行通过AngII刺激小鼠胸主动脉外膜和内膜NADPH氧化酶衍生的ROS的产生和中层平滑肌细胞的肥厚，而且这种刺激在NOX2缺陷的鼠中被显著的降低，表现在血管外膜和内膜NADPH氧化酶被降低，表明血管外膜和内膜NADPH氧化酶衍生的ROS在中层平滑肌细胞的肥厚过程中的旁分泌作用。在颈动脉外膜成纤维细胞用腺病毒结构靶向过表达nox2:p47phox相互作用的抑制剂gp91ds,测试血管外膜的NADPH衍生的H2O2本身能够影响中层平滑肌细胞的肥厚，而且除了外膜成纤维细胞在部分巨嗜细胞中也发现该抑制剂的表达。结果证明：该抑制剂的表达显著的降低了中层ROS的水平和平滑肌的肥厚。需要指出的是：在Ang II诱导的高血压等疾病中明确的显示了巨噬细胞定位在血管外膜和诱导中层平滑肌的肥厚。一些数据已经证明血管外膜细胞在新生内膜增值方面的作用，特别是在血管内膜损伤的模型中，血管外膜成纤维细胞表型迁移到新生的内膜表明外膜成纤维细胞有促进新生内膜生长的能力。而且在外膜成纤维细胞NADPH氧化酶的活性先于增值和内膜的生长，这些发现证明血管外膜成纤维细胞NADPH氧化酶是一个在血管损伤过程中血管重建的始动因素。血管外膜是血管疾病发生发展过程的始动因素。我们前期的实验也已经证明丹参水溶性有效成分/组分对血管外膜成纤维细胞的增殖、迁移和分化具有显著的影响。
本发明采用均匀设计和正交设计联用的方法对丹参注射液及其有效活性成分进行配伍配比(如图1所示)：
正交设计是生物、医学研究领域应用最广的设计方法之一，具有“均衡分散，综合可比”的两大特点。均衡分散性即均匀性，可使每个有代表性的试验点均匀地分布在试验范围内。综合可比性即整齐可比性，由于每一因素所有水平的试验条件相同，可以综合比较各因素不同水平均数对试验指标的影响，从而可以分析各因素及其交互作用对指标的影响大小及变化规律。正交试验还有一个优点在于：结果可以通过直接对比法和直观分析法得出最佳因素水平组合。本研究拟将正交试验设计应用于丹参组分配伍配比的筛选，可在一定程度上比全面试验减少试验次数，并可以对结果进行直观分析。但是，为保证综合可比性，正交试验中均匀性就会受到一定限制，试验点的代表性不够强。而且，当需要考察的因素和水平数较多时，试验次数会随水平数的增多呈跳跃式增长(如水平数为n，试验次数为n2)。这就会限制本研究中药物组分最佳配伍配比的快速准确的获得。此外，在运用正交试验设计时需要考虑因素间的交互作用。但试验之前，我们对四个因素的交互作用以及交互作用大小未知，这就对最优配伍配比的筛选造成一定影响。
均匀设计是有别于正交设计的试验设计，它的特点是将有关因素的各个水平数均匀分散在试验范围内，使每个因素的每个水平做一次且仅做一次试验，使得试验次数与水平数相等(水平数和试验次数均为n)，减少了多次试验，且试验结果可用计算机处理，通过回归方程得出理论的最佳试验条件。其相对于全面试验和正交试验设计的最主要的优点是大幅度地减少试验次数，缩短试验周期。因此，本研究拟引入均匀试验设计进行丹参药物组分的最佳配伍配比筛选，较之正交试验设计的使试验点分布得更均匀，代表性更强。但是，均匀试验完成后不能像正交试验那样通过直观分析得出结论，而是需要对数据进行专业分析，利用回归分析得出的模型，进行影响因素的重要性分析及新试验条件的结果估算、预报和最优化。
基于正交试验设计和均匀试验设计各自的优缺点，本研究拟将两种试验设计方法联用，使两种方法有机地结合,优势互补。均匀设计能够较均匀全面的使试验次数大为减少，而后辅助正交设计能够对试验结果进行直观分析。先利用均匀设计表中较好的处理组合离真正最优的试验点不是很远的理论基础,先用均匀设计在很大范围内进行筛选，对得到的较优组合再根据试验结果设计一个相应大小的正交设计，通过简单的直观分析，就可以分析出丹参中各组分对本研究中试验指标的贡献大小、最优顺序以及适宜剂量，最后利用方差分析和回归分析还可估出各组分之间的交互效应。
1、本发明具体筛选过程如下：
①初步筛选丹参中四种药物成分的应用剂量范围：分别采用不同浓度的丹参注射液及四种有效成分，对培养的血管外皮成纤维细胞进行干预。丹参注射液采用浓度为0，20，40，80，160μL；丹参素(DSS，S)浓度采用0，1，2，5，10mg/kg；丹酚酸A(SAA，A)浓度采用0，5，10，20，30mg/kg，丹参酚酸B(SAB，B)浓度采用0，5，10，20，30mg/kg；原儿茶酚(PAL，L)采用浓度为0，5，15，30，60mg/kg。分别培养48h后，检测各组分对外皮成纤维细胞增殖的影响，并初步确定各成分浓度的有效剂量范围。
②为进一步确定各组分对本试验的效应和有效剂量，采用均匀设计和正交设计联用的方法，进行组分剂量和配伍的筛选：首先，结合试验1得到的结果，四个组分各选取有效剂量范围内6个不同浓度，按照表1进行均匀设计即4因素6水平均匀表U6(64)安排试验，纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数(处理数)，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量。以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组。均匀试验6个试验组(表1)，对照2个试验组，共8个处理组合。分别考察各处理对外皮成纤维细胞增殖、迁移和分化的影响。
表1丹参四组分U6(64)均匀试验设计表
试验结果经方差分析和多重比较可得出，6个处理中最优的组分配伍，并初步得到各组分适宜应用的对应剂量。
然后，根据均匀设计得出的结论，在最优的处理中，根据各组分对应剂量相距较近的范围内再次选择3个不同剂量(低、中、高)。对S、A、B、L四个组分的有效剂量(低、中、高)进行正交设计试验研究。选择L9(34)正交表，如下设计：纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数(处理数)，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量(正交设计中的3个剂量必须在均匀试验最优处理得出的对应剂量附近)。以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组。正交试验9个试验组(如表2所示)，对照2个试验组，共11个处理组合。分别考察各处理对外皮成纤维细胞增殖、迁移和分化的影响。
表2丹参四组分L9(34)正交试验设计表
最终将正交试验结果进行分析，可求出最优试验组合，又可以根据直观分析得出各因素对测定指标贡献大小的顺序，并能够得到各个组分的适宜有效剂量以及四组分的最佳配伍方式。
③为进一步验证四组分的最佳配伍方式，根据试验1和试验2的结果，为各组分确定一个最适宜有效剂量，对S、A、B、L四个组分配伍：S、A、B、L，SA、SB、SL、AB、AL、BL、SAB、SAL、SBL、ABL、SABL(共15个)，再次考察各配伍对外皮成纤维细胞增殖、迁移和分化的影响。由此，可进一步验证四种药物组分及其配伍对本试验的影响强弱顺序。
④结合以上试验内容，综合考虑，并进行系统分析各组分的协同或竞争作用，最终得出优选的药物组分最佳配伍。
⑤试验所得数据用DPS7.05软件进行处理和统计分析。
2、高血压大鼠模型建立
根据钱之玉编著的《药理学实验与指导》(北京:中国医药科技出版社)提供的方法建立大鼠高血压模型，用内径为0.20-0.25mm的U型银夹使大鼠右侧肾动脉狭窄，4周后形成稳定高血压。实验分为正常组，假手术组，模型组，阳性对照药丹参注射液组和有效成分不同配伍组。股静脉注射丹参注射液及其有效活性成分的配伍配比，给药7d和21d，处死动物，取胸主动脉，利用免疫组织化学方法观察血管壁形态学的变化以及NADPH水平和collagenI的合成，利用免疫细胞化学方法对血管壁细胞形态和结构分析，比较血管内膜、中层和外膜细胞形态变化，比较四种活性成分及其配伍和配比的作用靶点和作用机制。同时测试ET-1、NADPH和SOD的变化。鉴定和筛选丹参最佳有效活性成分的配伍和配比。(如图2所示)
3、血管外膜成纤维细胞的分离与培养
SD大鼠断头处死，无菌条件下取胸主动脉，放入预冷的PBS中，清洗后于手术镜下纵向剖开血管腔，刮去血管内膜和中膜，剩下薄层的血管外膜，转移入含有20％胎牛血清的DMEM培养基中，剪成约1mm3小块，吸弃多余的培养基，将组织块均匀铺于培养皿上，置37℃、5％CO2培养箱干涸24h，待组织块贴壁后向培养皿中滴加少量含20％胎牛血清的DMEM培养基，置37℃、5％CO2培养箱中培养，次日补加适量培养液继续培养，直到细胞长至融合，一般需要5-7d。融合细胞用胰蛋白酶消化传代。将第1或2代细胞-80℃冰箱冻存备用。实验用细胞为第2-4代。
4、细胞纯度鉴定
为确认成纤维细胞无内皮细胞、平滑肌细胞和白细胞的污染，采用RT-PCR方法鉴定，以β-actin为内参，第Ⅷ因子(von Willebrandfactor,vWF)为内皮细胞标记，肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC)和结蛋白(desmin)为平滑肌细胞标记，CD8为白细胞标记，设计并合成相关引物，引物序列及退火温度如表1所示。分别提取大鼠血管外膜组织和成纤维细胞RNA，经反转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR，循环体系为1.25u Taq聚合酶，20mMTris-HCl(pH8.0)，50mM KCl，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2和0.02μM上下游引物。循环程序如下：95℃初始化5min；变性，95℃，1min，退火，(46～56)℃，30s，延伸，72℃，30s，共30个循环；循环后72℃延伸10min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳后溴化乙锭染色，凝胶成像系统捕获图像。
5、增殖实验
采用MTT方法进行。取生长状态良好的细胞，用0.25％的胰酶消化成细胞悬液，以1.0×104/mL接种于96孔培养板，每孔200μL，置培养箱中孵育24h，换无血清DMEM培养过夜，使其生长同步化，换含2％FBS的DMEM，将不同药物组分配伍配比作用于经Ang II(103nM,1.5h)处理的细胞，继续培养72h，向每孔细胞中加入20μL MTT(5g/L)溶液，继续孵育4h后弃培养液，每孔加入200μL DMSO，振荡10min使结晶物充分溶解，采用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(A值)。细胞增殖率(％)＝(实验组A值-对照组A值)/对照组A值×100％。
6、迁移实验
采用Transwell小室法，比较不同药物组分配伍配比作用于经Ang II(103nM,1.5h)处理的细胞的效果。取长至80％融合的细胞，PBS漂洗3次，加入无血清培养基饥饿细胞24h使其生长同步化，0.25％胰蛋白酶消化3min，用2％FBS的培养基配制1.0×104/mL的细胞悬液，取200μL上述悬液加至transwell小室上室中，下室中加入500μL含102nM Ang II的2％FBS培养基，分别培养1、2、4、6和12h后，用棉签擦去膜靠近内室一侧的细胞，PBS漂洗3次，另一侧细胞用95％乙醇室温固定20min，PBS漂洗3次，0.1％结晶紫染色液染色20min，清水漂洗3次，倒置显微镜下观察并捕获图像。33％的醋酸脱色，将结晶紫完全洗脱下来，洗脱液用多功能检测仪测吸光度值，实验重复三次。
7、分化实验
Western blot检测α-SM actin蛋白的表达，比较不同药物组分配伍配比作用于Ang II(103nM,1.5h)对细胞分化的效果。将细胞传代至培养瓶中，待长至80％融合后进行实验。继续培养48h后提取蛋白，进行Western blot实验。
8、细胞周期分析
将长至80％融合的细胞胰酶消化，制成1×106/mL细胞悬液，比较不同药物组分配伍配比作用于Ang II(103nM,1.5h)对细胞周期的影响。继续培养48h后，弃培养液胰酶消化。PBS漂洗1次，加0.6mL PBS，吹打均匀，缓慢加入预冷无水乙醇1.4mL，混匀，置4℃冰箱固定1h，加适量生理盐水于固定液中，于1000rpm，离心4min，弃上清，用生理盐水漂洗1次，弃上清后加入300μL生理盐水，轻轻将细胞吹打均匀，加入0.5mL PI染色液孵育20-60min后，用生理盐水洗1-2次，Epics-XLⅡ型流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)检测，如图3所示。
9、丹参注射液及其有效组分配伍配比的作用路径研究(如图4所示)
AngⅡ刺激血管外膜成纤维细胞，增加NADPH氧化酶的活性，产生过剩的ROS，激活NF-kappaB和TGF-beta，通过Ras-Raf-ERK路径促进ET-1的表达，通过ETA受体增加I型胶原的合成。以该信号通路为模型，研究分析丹参注射液及其有效活性成分的配伍配比对该信号通路的作用，从中寻找和筛选丹参注射液及其有效活性成分的最佳配伍配比及其它们的作用路径、作用靶点。探索有效成分的配伍配比在血管氧化应激损伤过程中作用的分子机制。
10、免疫组织化学实验
①高血压大鼠胸主动脉切片的脱蜡和水化：将组织芯片在室温中放置60分钟后，置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后在浸泡10分钟，无水乙醇中浸泡五分钟，95％乙醇中浸泡五分钟，75％乙醇中浸泡五分钟。②抗原修复：水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至95℃左右，放入组织芯片加热10-15min。③切片用0.01MPBS(pH7.2-7.4)漂洗3次，5min/次。④切片入新鲜配制的3％H2O2甲醇溶液中室温孵育10min，0.01M PBS洗3次，3min/次。⑤切片入含有10％正常山羊血清的0.01M PBS液中，室温封闭20min，弃去多余液体，不洗。⑥将切片放入一抗(SOD或collagen I抗体等)中，37℃孵育2h，移入4℃冰箱孵育过夜后经0.01M PBS漂洗3次，5min/次。阴性对照：用0.01M PBS替代一抗，其余步骤相同。⑦切片入生物素标记的二抗(羊抗兔IgG),37℃孵育1h，0.01M PBS漂洗3次，5min/次。⑧切片入SABC复合物中(1:100),37℃孵育1h，0.01M PBS漂洗4次，5min/次。⑨DAB显色：切片入0.05％DAB显色液中(0.05M TBS配制，含0.03％H2O2,pH7.4)，室温显色，约5-10min。0.01MPBS漂洗3次，5min/次，终止反应，洗去非特异性着色。⑩将切片贴于铬矾明胶处理过的载玻片上，晾干，常规脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察。
11、免疫细胞化学实验
①将盖玻片置培养皿中，按104/mL的细胞密度将血管外膜成纤维细胞接种于培养皿中进行细胞爬片，3天后进行免疫细胞化学染色。②PBS清洗标本3次，1min/次。③0.5％Triton X-100孵育20min，PBS清洗标本3次，2min/次。④3％H2O2孵育15min，PBS清洗标本3次，2min/次。⑤1％BSA室温封闭20min。⑥一抗(兔抗鼠MHC抗体或SMα-actin抗体或vimentin抗体等，湿盒)4℃过夜或37℃60min。阴性对照用一抗来源血清。⑦PBS清洗标本3次，5min/次。⑧二抗(生物素标记羊抗兔IgG，湿盒)37℃，30min，PBS清洗标本3次，5min/次。⑨C液(湿盒)37℃30min，PBS洗3次，5min/次。⑩DAB显色(避光，镜下观察至棕色)约3-10min。蒸馏水洗2次，1min/次。苏木素复染0.5-1min。自来水洗30min。树胶封片，显微镜下观察。
12、RT-PCR实验
RNA提取和反转录，操作如下：①组织：取高血压大鼠胸主动脉，剪碎，转入匀浆器中研磨，然后慢慢加入1mL TRIZOL(成纤维细胞：吸净35mm平皿中培养液，PBS漂洗1次，加1mL TRIZOL至平皿中，用枪头吹吸几次)。②将悬液转移至1.5mL EP管中，15-30℃放置样品5min使核蛋白复合物彻底分离。③加入0.2mL氯仿上下快速颠倒摇动15秒，15-30℃放置样品2-3min。④2-8℃，12000g离心15min，转移上层水相至新EP管中。⑤加入0.5mL异丙醇，轻摇15秒，使RNA从水相沉淀出来，15-30℃放置样品10min，4℃12000g离心10min，弃上清。⑥加入至少1mL75％乙醇，在涡旋振荡器上洗涤RNA沉淀1次，2-8℃7500g离心5min，弃上清。⑦超净台中晾半干，即得RNA沉淀，用43μL DEPC水溶解RNA后，加入5μL 10×DNaseⅠ反应Buffer，2μL DNaseⅠ混匀，于37℃孵育10min。⑧加入2.6μL 50mM EDTA，抑制DNaseⅠ，于65℃水浴10min，酶标仪检测OD值。⑨RT反应体系：30μL RNA样品，3μL Oligo(dT)15，3μLdNTP(10mM)，于65℃水浴5min后，立即置冰上5min。⑩于上述体系中加入12μL 5×Buffer，6μL0.1M DTT，3μL RnasinRibonuclease inhibitor(40U)，置37℃水浴2min。室温下加入M-MLV 3μL，轻轻吹打混匀，于37℃延伸50min。抑制反转录酶，70℃水浴15min，即得60μLcDNA，可-20℃保存；亦可继续做PCR。
PCR循环体系：1.25u Taq聚合酶，20mMTris-HCl(pH 8.0)，50mM KCl，0.2mM dNTP，1.5mM MgCl2和20nM上下游引物。循环程序如下：95℃初始化5min，95℃变性1min，50℃退火1min 30s，72℃延伸2min，共30个循环，72℃10min。PCR产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳后溴化乙锭染色，凝胶成像系统捕获图像。
13、ELISA实验(试剂盒操作说明)
①取高血压大鼠尾静脉血，样本用稀释液进行1:20倍稀释后进行检测。②加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL，37℃反应120min。③弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加生物素标记抗体工作液100μL，37℃，60min。④弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2min，200μL/孔，甩干。⑤每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，37℃，60min。⑥弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2min，200μL/孔，甩干。⑦依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色(30min内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔显色不明显，即可终止)。⑧依序每孔加终止溶液50μL，终止反应。⑨用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。在加终止液后15min内进行检测。
14、Western Blot
用4℃预冷的细胞裂解液于冰上裂解30min，4℃12000rpm离心5min，上清液即为蛋白。将上清液分装到离心管中于-20℃保存。以BCA法测蛋白含量后，计算含50μg蛋白的溶液体积即为上样量。取蛋白样品至0.5mL离心管中，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为l×SDS，沸水浴加热5min，以充分变性蛋白，冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。4％浓缩胶电泳电压为80V，电泳至10％分离胶后，改用100V电压继续，待溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。采用半干式转膜仪(20mA，40min)转于PVDF膜上，用5％脱脂奶粉封闭膜，摇床上轻摇1h，TBST漂洗15min×3次后，加一抗(兔抗鼠collagen I单克隆抗体，1:1000)，4℃轻摇过夜。次日取出膜用TBST漂洗15min×3次，加入二抗(HRP标记的羊抗兔IgG，1:1000)，室温轻摇1h，TBST洗膜15min×3次，滴加1:1ECL显色液于膜上，反应3min，压片2min，将胶片先后置于显影液和定影液各5min后观察结果。
在以前的工作中，我们对血管外皮成纤维细胞进行了系统深入地研究：首次从血管外皮成纤维细胞中克隆出内皮素－1(GeneBank收录号：AB081657)；首次发现血管外皮细胞通过应答血管紧张素Ⅱ的刺激合成和释放内皮素－1，并影响细胞外基质特别是I型胶原的合成；首次证明了这一过程是通过细胞氧化应激导致NADPH活性增加而触发的，血管外皮成纤维细胞NADPH氧化酶所衍生的ROS是血管疾病和血管重构的先兆，直接和间接影响新生内膜的增生和中层平滑肌细胞的肥大，导致血管结构和功能改变的机制，构建了氧化应激的动物和细胞模型，为我们研究丹参有效活性成分的配伍和配比规律奠定坚实的动物和细胞模型基础。我们已在此模型上观察了丹参四种主要有效活性成分能够不同程度地对抗AngII诱发胸主动脉血管外皮成纤维细胞增殖、分化和迁移，抑制NADPH氧化酶所诱发的ET-1mRNA的表达和蛋白的释放，抑制细胞外基质collagen I mRNA的表达和合成，初步阐明了丹参四种主要有效活性成分抗高血压和抗动脉粥样硬化的作用机制。本项目将在上述基础上通过丹参四种主要有效活性成分的配伍和配比对高血压大鼠和血管外皮成纤维细胞的作用机制进行研究，在整体、细胞和分子水平上进一步探索有效成分间相互作用、成分配伍的体内过程、药效物质间相互作用、多靶点多途径的作用机制，为组分配伍优化设计方法学及应用规律、组分配伍减毒增效机制、组分配伍多靶点相互作用、组分配伍网络调控机制和组分配伍方药临床应用奠定基础。
如图5所示，AngII诱导培养的血管外皮膜成纤维细胞产生过氧化物的时间曲线.
AngII与细胞共孵育,在不同的时间点检测细胞内超氧化物的水平.在1.5小时和6小时两个高峰
如图6所示，AngII诱导血管外皮成纤维细胞产生超氧化物是通过血管紧张素受体1(AT1)和内皮素受体A(ETA)路径实现的。细胞分别在AT1受体抑制剂氯沙坦(losartan)和ETA受体抑制剂BQ123存在的情况下，加入AngII(10-7mol/L)共培养培养1.5小时和6小时,发现氯沙坦和Q123明显阻断了AngII诱导的超氧化物的产生和释放。
如图7所示，AngII刺激血管外膜成纤维细胞产生NADPH氧化酶，促进内皮素(ET-1)的表达和释放。temple降低了AngII诱导的ET-1的释放，catalase和DPI完全阻断了ET-1的释放。
如图8所示，AngII对在以腺病毒介导超表达SOD1的血管外膜成纤维细胞ET-1mRNA水平的影响。SOD1超表达明显拮抗了AngII诱导的ET-1mRNA的表达。
如图9所示，AngII对在以腺病毒介导超表达SOD1的血管外膜成纤维细胞I型胶原(CollagenI)蛋白水平的影响。SOD1超表达明显拮抗了AngII诱导的CollagenI蛋白的表达。
如图10所示，AngII对gp91phox基因敲除小鼠胸主动脉血管外膜成纤维细胞ET-1释放的影响。与野生型小鼠相比gp91phox基因敲除小鼠血管外膜成纤维细胞ET-1释放显著降低。
本项目以中医药理论为指导，选择单味中药丹参水溶性制剂(丹参注射液)，就丹参注射液及其有效组分在高血压大鼠模型和血管外膜成纤维细胞的作用机制及配伍配比特征进行深入探讨。其特色与创新之处为：第一，基于均匀设计和正交设计联用的方法，对丹参四个主要水溶性有效成分：丹酚酸B，丹参素、原儿茶醛和丹酚酸A进行三个层次的配伍和配比设计：①通过单因素试验，分别筛选四组分的有效剂量范围；②在有效剂量范围的基础上，通过均匀设计和正交设计联用的试验方法筛选四个有效单体成分配伍配比的最适剂量和比例；③将四个有效组分以试验二得到的最适浓度随机排列组合配伍配比，对以上结果进行验证，最终得到优选的配伍组合。第二，以高血压大鼠和血管外皮成纤维细胞为动物和细胞模型，在整体、组织、细胞和分子水平对各有效成分间相互作用，围绕成分配伍的体内过程、药效物质间相互作用、多靶点多途径作用机制等方面进行研究，重点探索组分配伍优化设计方法学及应用规律、组分配伍减毒增效机制、组分配伍多靶点相互作用、组分配伍网络调控机制和组分配伍方药临床应用基础研究，初步揭示单味中药丹参四个主要药效组分“君臣佐使”的方剂配伍规律的科学内涵，为中医方剂配伍理论的创新和发展提供科学依据。

Claims (4)

1.含丹参有效成分的药物组合物，其特征在于：该药物组合物由以下药物浓度的组分混配而成：
丹参素(DSS，S)1.5×10-4mol/L,丹酚酸A(SAA，A)7×10-6mol/L,丹参酚酸B(SAB，B)3×10-4mol/L,原儿茶酚(PAL，L)5×10-4mol/L，四个组分作用于细胞的浓度和比例关系为S：A：B：L是150：7：300：500。
2.根据权利要求1所述的含丹参有效成分的药物组合物，其特征在于：上述的四个组分作用于动物实验的浓度和比例是：(S:5mg/kg/day,A:0.233mg/kg/day,B:mg/kg/day,L:mg/kg/day)，比例是：S:A:B:L是5:0.233:10:17。
3.含丹参有效成分的药物组合物的筛选方法，其特征在于该筛选方法如下：
①试验1：初步筛选丹参中四种药物成分的应用剂量范围：分别采用不同浓度丹参的四种有效成分，对培养的血管外膜成纤维细胞进行干预；
丹参注射液采用浓度为0，1，5，10，50，100g/L；丹参素(DSS，S)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；丹酚酸A(SAA，A)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；丹参酚酸B(SAB，B)浓度采用0，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7mol/L；原儿茶酚(PAL，L)采用浓度为0，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6mol/L，分别培养48h后，检测各组分对血管外膜成纤维细胞增殖的影响，并初步确定各成分浓度的有效剂量范围；
②试验2：进一步确定各组分对本试验的效应和有效剂量，采用均匀设计和正交设计联用的方法，进行组分剂量和配伍的筛选：首先，结合试验1得到的结果，四个组分各选取有效剂量范围内6个不同浓度，按照均匀设计表即4因素6水平均匀表U6(64)安排试验，均匀设计表如下设计：纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数即处理数，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量，以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组，均匀试验6个试验组，加上2个对照试验组，共8个处理组合，分别考察各处理对血管外膜成纤维细胞增殖的影响；试验结果经方差分析和多重比较可得出，6个处理中最优的组分配伍，并初步得到各组分适宜应用的对应剂量；
然后，根据均匀设计得出的结论，在最优的处理中，根据各组分对应剂量相距较近的范围内再次选择低、中、高3个不同剂量，对S、A、B、L四个组分的有效剂量低、中、高进行正交设计试验研究，选择L9(34)正交表，如下设计：纵列为丹参的四种有效组分，横行为所需试验组数即处理数，表内对应为试验组的各组分所需添加的剂量，正交设计中的3个剂量必须在均匀试验最优处理得出的对应剂量附近，以各组分均为0的处理为阴性对照组，以丹参注射液为阳性对照组，正交试验9个试验组，加上2个对照试验组，共11个处理组合，分别考察各处理组对血管外膜成纤维细胞增殖的影响；
最终将正交试验结果进行分析，可求出最优试验组合，又可以根据直观分析得出各因素对测定指标贡献大小的顺序，并能够得到各个组分的适宜有效剂量以及四组分的最佳配伍方式；
③为进一步验证四组分的最佳配伍方式，根据试验1和试验2的结果，为各组分确定一个最适宜有效剂量，对S、A、B、L四个组分配伍：S、A、B、L，SA、SB、SL、AB、AL、BL、SAB、SAL、SBL、ABL、SABL共15个，再次考察各配伍对外膜成纤维细胞增殖的影响，由此，可进一步验证四种药物组分及其配伍对本试验的影响强弱顺序；
④结合以上试验内容，综合考虑，并进行系统分析各组分的协同或竞争作用，最终得出优选的药物组分最佳配伍；
⑤试验所得数据用DPS7.05统计软件进行处理和统计分析后即得。
4.如权利要求1或2或3所述的含丹参有效成分的药物组合物在治疗高血压方面的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949677A (zh) * 2018-07-05 2018-12-07 浙江大学 地黄苷c和丹酚酸a在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用
CN110885787A (zh) * 2018-09-10 2020-03-17 安胜军 脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101293009A (zh) * 2007-04-23 2008-10-29 北京本草天源药物研究院 药物组合物
CN104997764A (zh) * 2014-04-25 2015-10-28 西安世纪盛康药业有限公司 一种含有丹参酚酸b和丹参素的药物组合物及其制药用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101293009A (zh) * 2007-04-23 2008-10-29 北京本草天源药物研究院 药物组合物
CN104997764A (zh) * 2014-04-25 2015-10-28 西安世纪盛康药业有限公司 一种含有丹参酚酸b和丹参素的药物组合物及其制药用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. YU，等: ""Determination of Protocatechuic Aldehyde，Danshensu，Salvianolic Acid B and Gallic Acid in Chinese Medicine "SHUANGDAN"Granule by MEKC"", 《CHROMATOGRAPHIA》 *
刘培，等: ""血管紧张素Ⅱ及其受体拮抗剂对血管外膜成纤维细胞亚群增殖和胶原合成的影响"", 《中国老年学杂志》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108949677A (zh) * 2018-07-05 2018-12-07 浙江大学 地黄苷c和丹酚酸a在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用
CN108949677B (zh) * 2018-07-05 2021-11-30 浙江大学 地黄苷c和丹酚酸a在促进体外培养骨髓间充质干细胞增殖和抑制复制性衰老中的应用
CN110885787A (zh) * 2018-09-10 2020-03-17 安胜军 脐带间充质干细胞向多巴胺能神经元分化的方法

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