CN108078987A - 阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途，阿苯达唑可抑制胶质母细胞瘤的生长增殖，药物为口服制剂或注射剂，药物中阿苯达唑的含量为25‑100mg/kg；本发明通过阿苯达唑治疗胶质母细胞瘤的体外及体内试验，证明并揭示阿苯达唑通过抑制肿瘤中血管发生发挥作用，其对胶质瘤干细胞有抑制细胞生长的效果，通过试验验证了其可抑制胶质母细胞瘤生长及浸润性，提供了治疗胶质母细胞瘤的新手段。

Description

阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途

【技术领域】

本发明属于阿苯达唑应用技术领域，尤其涉及阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途。

【背景技术】

脑恶性肿瘤包含众多的分类，常见的有星形胶质细胞瘤，少突胶质细胞瘤，少突星形胶质细胞瘤，室管膜瘤，髓母细胞瘤等。其中胶质母细胞瘤为成人最常见的脑部原发性恶性肿瘤，而髓母细胞瘤为儿童最常见的脑肿瘤。脑肿瘤由于其占位性可导致局部或全身性的症状。全身性症状主要由肿瘤导致的颅内压增高所致，多可出现头痛，严重时还会有恶心、呕吐以及脑神经麻痹表现(常见第六脑神经麻痹)。局部症状主要有肿瘤的占位性病变引起，依肿瘤的发生位置而不同，例如可出现偏瘫、失语等。头痛为脑肿瘤最常见的症状，约发生于一般的患者。其次常见的症状为癫痫、偏瘫、精神症状。增强磁共振成象为重要的辅助诊断手段。

胶质瘤为成人最常见的脑肿瘤，分为两大类：星形胶质细胞瘤和少突胶质细胞瘤。按照世界卫生组织(World Health Organization，WHO)分级这两种主肿瘤可分为I-IV级。在星形胶质细胞瘤中，纤维状细胞性星形细胞瘤(pilocytic astrocytoma,WHO I级)和多形性黄色星形细胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma,WHO II级)被认为是良性肿瘤，其余的均为恶性肿瘤，包括星形细胞瘤(astrocytoma,A,WHO II级)，间变性星形细胞瘤(anaplastic astrocytoma,AA,WHO III级)和胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM,WHO IV级)。少突胶质细胞瘤分为低级别少突胶质细胞瘤(Oligodendroglioma,O)和高级别少突胶质细胞瘤(间变性少突胶质细胞瘤，anaplastic Oligodendrogliomas,AO)。少突胶质细胞瘤约占胶质瘤的20％，其一个重要特点是其对化疗较敏感。

胶质母细胞瘤属于WHO IV级星形胶质细胞瘤，是成人中最常见的原发性脑肿瘤。胶质母细胞瘤呈浸润性生长，以致手术完全切除极为困难，且其对放、化疗具有抵抗性，故复发率高，预后极差。目前手术联合术后放、化疗后的中位生存期仅为15个月左右。到目前为止，GBM的治疗策略仍十分有限，寻找新的治疗胶质母细胞瘤的治疗方法及新的药物，是目前神经外科临床和基础研究工作者面临的重要课题。

阿苯达唑，中文别名：5-(丙硫基)-2-苯并咪唑氨基甲酸甲酯；丙硫咪唑；丙硫苯咪唑；抗蠕敏；扑尔虫；肠虫清；阿丙条史克肠虫清。英文名称：albendazole(ABZ)。CAS号：54965-21-8；分子式：C₁₂H₁₅N₃O₂S；分子量：265.33100；精确质量：265.08800；PSA：92.31000；LogP：3.31630。阿苯达唑是一种咪唑衍生物类广谱驱肠虫药物。由葛兰素史克公司的动物健康实验室在1972年发现。阿苯达唑已被列入世界卫生组织基本药物标准清单，是最重要的基本健康药物之一。阿苯达唑为一高效低毒的广谱驱虫药。临床可用于驱蛔虫、蛲虫、绦虫、鞭虫、钩虫、粪圆线虫等。在体内代谢为亚砜类或砜类后，抑制寄生虫对葡萄糖的吸收，导致虫体糖原耗竭，或抑制延胡索酸还原酶系统，阻碍ATP的产生，使寄生虫无法存活和繁殖。

【发明内容】

本发明的目的是提供阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途，以解决通过手术难以完全切除胶质母细胞瘤，以及胶质母细胞瘤复发率高，预后极差的问题。

本发明的第一种技术方案为：阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途。

本发明的第二种技术方案为：阿苯达唑在制备抑制胶质母细胞瘤生长增殖的药物中的用途。

进一步地，药物为口服制剂或注射剂。

进一步地，药物中阿苯达唑的含量为25～100mg/kg。

进一步地，药物中阿苯达唑的含量为50mg/kg。

进一步地，药物用于抑制胶质母细胞瘤的体内生长。

进一步地，药物用于抑制胶质母细胞瘤干细胞系、U87细胞系和U251细胞系的生长增殖。

本发明的第三种技术方案为：阿苯达唑在制备促进胶质母细胞瘤细胞凋亡的药物中的用途。

本发明第四种技术方案为：阿苯达唑在制备抑制胶质母细胞瘤中血管生长因子VEGF的蛋白表达水平的药物中的用途。

本发明的有益效果是：本发明通过阿苯达唑治疗胶质母细胞瘤的体外及体内试验，证明并揭示阿苯达唑通过抑制肿瘤中血管发生发挥作用，其对胶质瘤干细胞有抑制细胞生长的效果，通过试验验证了其可抑制胶质母细胞瘤生长及浸润性，提供了治疗胶质母细胞瘤的新手段。本发明说明了阿苯达唑对胶质母细胞瘤具有抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡、具有体内抑制肿瘤生长、抑制血管因子的效果以及机制。

【附图说明】

图1为本发明中不同浓度阿苯达唑(ABZ)的药物对胶质母细胞瘤干细胞GSC的抑制细胞生长效果图；

图2为本发明中不同浓度阿苯达唑(ABZ)的药物对胶质瘤细胞系U87的抑制细胞生长效果图；

图3为本发明中不同浓度阿苯达唑(ABZ)的药物对胶质瘤细胞系U251的抑制细胞生长效果图；

图4为本发明中不同浓度阿苯达唑(ABZ)的药物对胶质瘤细胞系U172的抑制细胞生长效果图；

图5为本发明实施例中100ng/ml浓度的阿苯达唑药物作用于胶质瘤细胞系U251细胞后，导致细胞凋亡形态图对比图，其中，图5-1为对照组效果图，图5-2为阿苯达唑药物作用；

图6为本发明实施例中，100ng/ml浓度的阿苯达唑作用于胶质母细胞瘤细胞系U251细胞后，采用流式细胞分析细胞周期的结果，阿苯达唑使得细胞处于G1期，从而抑制细胞增殖；

图7为本发明实施例流式细胞试验中100ng/ml浓度的阿苯达唑药物作用于胶质母细胞瘤U251细胞系细胞后的效果图，其中图7-1为对照组效果图，图7-2为试验组效果图；

图8为本发明实施例流式细胞试验中，100ng/ml及200ng/ml浓度的阿苯达唑药物作用于胶质母细胞瘤干细胞GSC及U87细胞后，使得细胞中caspase-3表达增加，caspase-3的表达和激活可以启动细胞的凋亡程序，从而促进细胞的凋亡；

图9为本发明体内胶质母细胞瘤干细胞系GSC在裸鼠体内移植瘤的肿瘤体积生长曲线效果图；

图10为本发明体内胶质母细胞瘤U87细胞系在裸鼠体内移植瘤的肿瘤体积生长曲线效果图；

图11为本发明实施例中体内胶质母细胞瘤干细胞GSC在裸鼠体内成瘤结果对比效果图，其中图11-1为肿瘤在裸鼠体内情况图，图11-2为将肿瘤分离出后的效果对比图；

图12为本发明实施例中通过PCR结果显示含有阿苯达唑的药物抑制胶质瘤中血管生长因子VEGF的mRNA表达水平图；

图13为本发明实施例中Western blot测试结果图。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明公开了阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途，具体的，阿苯达唑可制备抑制胶质母细胞瘤生长增殖的药物。在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中含有阿苯达唑后，可抑制胶质母细胞瘤的生长增殖，促进胶质母细胞瘤细胞的凋亡，阿苯达唑可以使得胶质母细胞瘤细胞中Caspase-3的表达增加，从而启动细胞的凋亡程序。具体的，阿苯达唑可抑制胶质母细胞瘤中血管生长因子。阿苯达唑可在胶质母细胞瘤的细胞周期中抑制细胞从G1期向S期转化，从而抑制细胞的分裂，达到抑制生长增殖效果。

含有阿苯达唑的药物，可用于抑制胶质母细胞瘤干细胞系、U87细胞系和U251细胞系的生长增殖。含有阿苯达唑的药物还用于抑制胶质母细胞瘤的体内生长和体外生长增殖。

生长增殖实验是对胶质母细胞瘤细胞培养进行的实验，体外实验细胞的生长环境简单，专注于药物细胞对肿瘤细胞本身的作用，例如抑制生长、促进凋亡、促进血管生长因子分泌等；而体内生长实验是模拟人体内生长肿瘤的治疗效果实验，它模拟了人体内肿瘤生长的效果，反应的不仅是对肿瘤细胞本身的作用，还反映了在体内复杂环境中的药物效果，很多药物对细胞有杀伤作用，而对体内肿瘤没有治疗效果，就是因为体内肿瘤生长的环境更为复杂，包含了肿瘤细胞和体内正常细胞之间的相互作用。二者均是肿瘤研究广泛采取的重要模型。

上述药物为口服制剂或注射剂。注射剂是以有效剂量的阿苯达唑为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂(注射制剂为将阿苯达唑(购买于市售商品，如sigma试剂公司)溶解于DMSO(购买于sigma试剂公司)，配置成浓度为1mg/ml的溶液使用。注射制剂用法及用量：目前属于动物实验前期研究阶段，裸鼠用量为浓度为10mg/ml，剂量为50mg/kg，腹腔注射。用于其它哺乳动物治疗时可根据临床剂量换算得出。

口服制剂包含阿苯达唑的重量比为41.6％，葡糖基β-环糊精25％，剩余为其他辅料，其他辅料包括淀粉、果绿、亮蓝、滑石粉、硬脂酸镁、氢氧化铝。口服制剂用法及用量：每天15～20mg/kg，分2次服用，15天为一个疗程。

上述该药物中阿苯达唑的含量为20-100mg/kg，优选的含量为50mg/kg。

本发明实施例中通过建立动物肿瘤模型，模拟对人体胶质母细胞瘤的治疗，在实施治疗的4组小鼠(20只)中均观察到了肿瘤生长减缓，肿瘤体积较对照组明显减小的效果，可证明该药物在治疗胶质母细胞瘤上的效果稳定性。

实施例1：含有阿苯达唑的药物抑制胶质母细胞瘤生长增殖的效果验证

胶质母细胞瘤干细胞的培养采取从U87细胞系(购自于北京百欧博伟生物技术有限公司)中进行。将U87细胞在无血清培养基中(serum free medium，SFM)培养，种植密度为100,000细胞/ml。经过传代后成为不贴壁的、呈现为神经球样的生长方式的细胞，作为GSC细胞。SFM的组成为：DMEM/F12(1：1)，HEPES缓冲液(10mM)，EGF(20ng/ml；Invitrogen)，bFGF(20ng/ml；Invitrogen)，L-谷氨酰胺(2mM),葡萄糖(0.3％w/v),N-2添加剂(R&D Systems)。

胶质瘤细胞系U87、U251、A172的培养

人脑胶质瘤细胞U87、U251、A172来自第四军医大学西京医院神经外科(购自于北京百欧博伟生物技术有限公司)，均在含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.2％NaHCO₃和0.3％HEPES的DMEM培养液中。

阿苯达唑对细胞的作用处理

将阿苯达唑药物溶解于DMSO溶剂中，按设计好的浓度25、50、100、200ng/ml加入到细胞培养液中。药物浓度按照倍比稀释的方法制备。细胞换液时重新加入药物以保证药物浓度的维持。每组重复3次。

胶质母细胞瘤各细胞系的相对生长曲线

则将5000细胞种植于96孔板，并分别在种植后0、2、4和7天加入MTT(Promega，Madison，WI，孵育1小时)后检测499处的吸光光度值，每组重复3次。如图1、图2、图3、图4所示，得出生长曲线。通过生长曲线的实验结果证明，在多个细胞系中包括胶质母细胞瘤干细胞系GSC、U87、U251和A172细胞中均可产生抑制细胞生长的效果，抑制生长的效果具有浓度依赖性，在浓度大于50ng/ml后产生较好的效果。图1中不同浓度的阿苯达唑(ABZ)对胶质瘤干细胞GSC具有抑制生长作用。当ABZ的浓度增加时，抑制作用也增加。浓度为50-200ng/ml时均比浓度为25ng/ml时效果明显；图2中不同浓度的阿苯达唑(ABZ)对胶质瘤细胞系U87具有显著抑制生长作用，浓度为50-200ng/ml时均比浓度为25ng/ml时有明显的抑制效果。图3中不同浓度的阿苯达唑(ABZ)对胶质瘤细胞系U251的抑制生长作用。图4中不同浓度的阿苯达唑(ABZ)对胶质瘤细胞系A172的抑制生长作用。

实施例2：流式细胞检测细胞凋亡

分别消化收集各浓度阿苯达唑处理24h的细胞，调整细胞浓度至1×10⁷，各取100μL；磷酸盐缓冲液(Phosphate buffed solution，PBS)洗涤两次后，弃上清液；加入预冷的结合缓冲液100μL重悬细胞，置冰浴；加入5μL AnnexinⅤ-FITC和5μL PI于细胞悬液中，轻轻混匀；将试管置于4℃避光染色10min；补加490μL结合缓冲液混悬细胞，流式细胞仪进行检测，分析用药后细胞凋亡的百分比。每组重复3次。如图6所示，图6-1为对照组，图6-2为试验组，为100ng/ml浓度的阿苯达唑作用于胶质母细胞瘤细胞系U251细胞后，采用流式细胞分析细胞周期的结果，阿苯达唑使得细胞处于G1期，从而抑制细胞增殖。如图7所示，流式细胞分析显示阿苯达唑(100ng/ml)作用于胶质瘤细胞U251后，凋亡的细胞与对照组相比明显增加，其中图7-1为对照组效果图，图7-2为试验组效果图。如图8所示，为本发明实施例流式细胞试验中，100ng/ml及200ng/ml浓度的阿苯达唑药物作用于胶质母细胞瘤干细胞GSC及U87细胞后，使得细胞中caspase-3表达增加，caspase-3的表达和激活可以启动细胞的凋亡程序，从而促进细胞的凋亡。如图5所示，得到显示了阿苯达唑作用后胶质瘤细胞凋亡坏死的形态图，表明了阿苯达唑作用于细胞后可导致细胞发生凋亡、坏死。阿苯达唑(100ng/ml)作用于U251细胞后导致细胞凋亡形态图图5-1为对照组，图5-2为药物作用组。

实施例3：含有阿苯达唑的药物抑制胶质母细胞瘤体内生长的效果验证

裸鼠体内移植瘤模型

胶质瘤干细胞GSC及细胞系U87细胞悬液0.2mL，含有5×10⁶个细胞，台盼蓝染色法确定细胞存活率90％以上。注射于裸小鼠右侧腋窝皮下。每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的最大长径(a)和与其垂直的最大短径(b)，按公式V＝ab²/2计算肿瘤体积。

移植瘤裸鼠体内给药

阿苯达唑的使用剂量设为50、100mg/kg。将30只肿瘤模型裸鼠分成6组(GSC和U87模型各15只)，每组各5只，雌雄各半，分别为GSC肿瘤模型组、GSC阿苯达唑50mg/kg组、GSC阿苯达唑100mg/kg组、以及U87肿瘤模型组、U87阿苯达唑50mg/kg组、U87阿苯达唑100mg/kg组。给药为经腹腔注射给药，剂量分别为50、100mg/kg(药物的浓度分别为5mg/ml、10mg/ml，给药剂量为100μl)，隔天给药一次，给药4周。

移植瘤裸鼠给药后观察

观察阿苯达唑药物对肿瘤生长的影响从给药之日起，隔3天测量1次肿瘤体积和荷瘤鼠体质量，观察至8周时间。实验终点后过量麻醉药物处死裸鼠，分离肿瘤组织后放入-80℃低温冰箱保存备用。

如图9、图10所示，在胶质瘤体内移植瘤的动物模型中，给于阿苯达唑治疗动物后可抑制胶质瘤在体内的生长。图9为体内胶质母细胞瘤干细胞GSC在裸鼠体内移植瘤实验，给于药物腹腔注射后(阿苯达唑50或100mg/kg)，可抑制移植瘤的生长。图10为体内胶质细胞瘤U87在裸鼠体内移植瘤实验，体内移植瘤的肿瘤体积生长曲线，给于药物腹腔注射后(阿苯达唑50或100mg/kg)，可抑制移植瘤的生长。

在对GSC及U87形成的体内移植瘤试验中，阿苯达唑治疗组中肿瘤体积生长较对照组更为缓慢。阿苯达唑的体内治疗效果具有浓度依赖性，浓度高的效果更好一些。

如图11所示，为体内移植瘤(图示GSC细胞在裸鼠体内成瘤结果)图示。给于药物治疗(阿苯达唑100mg/kg)后裸鼠的体内移植瘤较对照组小。图11-1显示肿瘤在裸鼠体内情况的代表图片；图11-2为将肿瘤分离出来后的照片，将裸鼠体内的移植瘤取出后显示，阿苯达唑治疗组的肿瘤体积更小。

实施例4：含有阿苯达唑的药物抑制胶质母细胞瘤中生长因子的蛋白表达水平的验证

实时定量RT-PCR

将分离获得的裸鼠肿瘤组织采用Trizol Reagent(Invitrogen)提取总RNA。提取的RNA逆转录为cDNA，然后利用SYBR在ABI7700PCR仪器上运行实时定量RT-PCR(quantitative real-time RT-PCR，qPCR)。反应体系为20μL。每个反应采用3遍重复，所有引物均以无cDNA模板为阴性对照。实验结果均以β-actin作为内参。反应结束后通过溶解曲线以及电泳跑胶分析产物的特异性。实验结果对反应结果的Ct值采用ΔΔC_t方法进行相对定量。

如图12所示，PCR结果分析证明，药物治疗后的肿瘤内，血管生长因子VEGF的mRNA表达量减少。

本实验用到了下列引物：VEGFA：

forward 5’-AGGGCAGAATCATCACGAAGT-3’(购自于上海吉凯基因科技有限公司)；

reverse：5’-AGGGTCTCGATTGGATGGCA-3’(购自于上海吉凯基因科技有限公司)；

β-actin forward 5’-CCCAGCACAATGAAGATCAA-3’(购自于上海吉凯基因科技有限公司)；

reverse：5’-GATCCACACGGAGTACTTG-3’(购自于上海吉凯基因科技有限公司)。

细胞蛋白提取及Western Blotting

对上述分离获得的裸鼠肿瘤组织提取蛋白组织后进一步型Western Blot实验。

(1)细胞蛋白提取

1)准备裂解液

(a)溶PMSF(将PMSF晶体溶到PMSF溶剂中，即配成10ml100mM的PMSF液体)；

(b)裂解液的制备组成：PIRA裂解液+PMSF溶剂+蛋白酶抑制剂10mlPIRA＝100ulPMSF＝1片蛋白酶抑制剂；

(c)将配好的裂解液放在4℃备用。

2)研磨组织(胶质瘤组织)

(a)准备研钵，药勺(2把)，长镊子，保温箱(里面放入冰块)，汤勺，离心管，天平，手套(2幅)，液氮，冰盘，振荡器。

(b)将所有接触到组织的工具用液氮预冷。

(c)1人负责将组织组织给研磨者并随时加液氮2人研磨组织(多次快速)，同时一人将1.5ml离心管编号预冷去皮。

(d)将研磨好的组织放在去皮处理的对应的离心管中称重。(用大白纸记录好每个样的重量，便于离心时配平用)。

(e)加裂解液(1mg组织加6ul裂解液)。

(f)震荡混匀后放入冰盘上，等所有的样加完后一齐在摇床上摇1h。

3)离心提取蛋白上清液

(a)提前30min预冷离心机(4℃)。

(b)配平。

(c)离心，按照配平时的组放样(13000r，5min)。(4)取上清液，储存在-20℃备用。

(2)Western blot

采用SDS标本缓冲液从培养的细胞中提取蛋白质。之后采用30μg蛋白样品加样到6％SDS-PAGE胶上进行跑胶。之后转到硝酸纤维素膜上。对转好的膜用PBST稀释的脱脂牛奶室温封闭一小时。之后采用以下一抗孵育4℃过夜：VEGFA(1：500；Abcam，Cambridge，MA)，β-Actin(1：500，000；Abcam)。之后将膜用含有0.1％Tween 20的PBS(PBST)洗3次，每次5分钟，之后用结合有过氧化物酶的二抗孵育。PBST洗后用化学发光剂显色(enhancedchemiluminescence，Amersham Biosciences，GE Healthcare，France)。如图13所示，Western blot结果显示(即上述肿瘤蛋白含量证明)，血管生长因子VEGF的蛋白含量明显降低，含有阿苯达唑的药物可抑制胶质瘤中血管生长因子VEGF的蛋白表达水平β-actin。

Claims (9)

1.阿苯达唑在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的用途。

2.阿苯达唑在制备抑制胶质母细胞瘤生长增殖的药物中的用途。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射剂。

4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述药物中阿苯达唑的含量为25～100mg/kg。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物中阿苯达唑的含量为50mg/kg。

6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述药物用于抑制胶质母细胞瘤的体内生长。

7.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述药物用于抑制胶质母细胞瘤干细胞系、U87细胞系和U251细胞系的生长增殖。

8.阿苯达唑在制备促进胶质母细胞瘤细胞凋亡的药物中的用途。

9.阿苯达唑在制备抑制胶质母细胞瘤中血管生长因子VEGF的蛋白表达水平的药物中的用途。