CN108076628A - 药物组合物和缺氧相关疾病的治疗方法 - Google Patents

药物组合物和缺氧相关疾病的治疗方法 Download PDF

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Abstract

一种药物组合物，其包括N,N,N',N'‑四(2‑吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)或其药学上可接受的盐、藻酸盐化合物和药学上可接受的载体。该药物组合物对于缺氧相关疾病的治疗是有用的。

Description

药物组合物和缺氧相关疾病的治疗方法
技术领域
本发明，在其一些实施方案中，涉及药物组合物及其用于治疗缺氧相关疾病的方法，并且更特别地，涉及包括TPEN和藻酸盐化合物作为活性成分的药物组合物。
背景技术
缺氧缺血性损伤是由血液供应中的组织限制引起的，导致供氧与需求之间的不匹配，这可能导致细胞坏死。充氧血对缺血性组织的恢复，即复氧，可能引起通常与程序性细胞死亡即细胞凋亡有关的更严重的组织伤害。这两个事件之间的联系已知为缺血再灌注损伤(IRI)。因此，使IRI最小化具有宽范围的临床意义。认为IRI是在急性心肌梗塞、中风、血栓溶解和与缺血随后复氧/再灌注相关的其它病理情况期间发生的氧化还原活性金属和自由基介导的级联。对组织和器官的这种类型的损伤/伤害也发生在如体外循环、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉血管成形术和其它血栓溶解过程等医疗程序期间的缺血后再灌注中。
生物学上重要的过渡金属，如铜、铁和锌，也是氧化还原活性金属，并且已被发现在再灌注诱导的心肌伤害中发挥重要的介导作用。因此，它们的细胞内运输受到严格的控制，并且在正常的生理状况下，原位储存在如铁蛋白和血浆铜蓝蛋白等的保护性细胞内储存蛋白中。
然而，在如缺氧缺血的情况下，它们经常从它们的储存释放并且在开始再灌注时经受高氧水平。结果是氧化还原活性催化过程的触发以及有害自由基即通过Fenton和Haber-Weiss反应的所谓的活性氧类(reactive oxygen species)(ROS)的形成。
ROS涉及并且介导许多疾病、综合征和病理，如心脏和脑中风、脑外伤、器官移植排斥、各种神经变性疾病、关节炎等。
缺血诱导的细胞内过渡金属如铁、铜以及还有锌的高积累通过神经元凋亡死亡的促进显著地有助于如缺血性脑伤害等的器官损伤。通过螯合剂除去锌可以是减少缺血性脑损伤的有效方法。
本发明人的美国专利No.5,082,851教导了能够保护心脏组织免受缺血-再灌注伤害的金属螯合剂，N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)。认为这种高特异性重金属螯合剂通过在复氧开始之前将氧化还原活性金属(过渡金属)的氧化还原电势改变成非活性形式，并且因此防止有害活性氧类(ROS)的产生和释放而起作用。
国际专利申请WO2013/003445教导了TPEN能够为心脏细胞提供高达，但不高于，70％的保护免受缺氧应激损伤。TPEN的有效浓度范围在约1至约10μM之间。以较高浓度施用TPEN导致降低的保护功效(Journal of Muscle Research and Cell Motility,2007年10月,第28卷，第7-8期，第421-428页)。
因此，对于有效的并且避免上述限制的用于治疗缺氧相关疾病的药物组合物，存在普遍地认识到的需要并且具有其将是高度有利的。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供药物组合物，其包括TPEN或其药学上可接受的盐、藻酸盐化合物和药学上可接受的载体。
根据本发明的另一方面，提供缺氧相关疾病的治疗方法。该方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的药物组合物的步骤。
根据本发明的又一方面，提供缺氧相关疾病的治疗方法。该方法包括以下步骤：(i)向需要的受试者施用治疗有效量的TPEN或其药学上可接受的盐，和(ii)向受试者施用治疗有效量的藻酸盐化合物。
根据下面描述的本发明的优选实施方案中的进一步特征，藻酸盐化合物为藻酸钠。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，藻酸盐化合物的平均分子量范围为约10至约300kDa。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，藻酸盐化合物的平均分子量范围为约10至约50kDa。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中藻酸盐化合物的浓度范围为约0.1至约10％(w/v)。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中藻酸盐化合物的浓度范围为约1至约4％(w/v)。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中藻酸盐化合物的浓度为约2％(w/v)。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中藻酸盐化合物的浓度为约1％(w/v)。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中TPEN的浓度范围为0.1至100μΜ。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中TPEN的浓度范围为1至50μΜ。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中TPEN的浓度范围为1至10μΜ。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，药物组合物中TPEN的浓度范围为3至5μΜ。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，藻酸盐化合物中α-L-古洛糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸之间的单体比例范围在1:1和3:1之间。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，缺氧相关疾病选自由以下组成的组：心血管疾病、缺血性心脏病、急性心肌梗塞(AMI)、缺血性脑病症、缺血性中风、黄斑变性、眼部缺血综合征、缺血性视神经病、糖尿病性视网膜病、关节炎、炎症、败血症、败血症诱导的休克、肾脏疾病、组织纤维化、胃肠疾病、神经变性疾病、呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良、肺动脉高血压症、缺氧性肺动脉高血压症、严重肺动脉高血压症、COPD、糖尿病性视网膜病、糖尿病、角膜新生血管形成、致病性血管生长、肌肉骨骼病症、缺血再灌注损伤、心肌缺氧或心脏肥大。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，心脏病为缺血性心脏病。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，心脏病为急性心肌梗塞。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，施用通过注射或导管插入术实施。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，导管插入术是动脉内导管插入术。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，有效量范围为约0.1至约10ml。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，有效量范围为约0.5至约5ml。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，施用TPEN的步骤和施用藻酸盐化合物的步骤同时实施。
根据描述的优选实施方案中的仍进一步的特征，施用TPEN的步骤和施用藻酸盐化合物的步骤顺序地实施。
本发明通过提供用于缺氧相关疾病的治疗的安全和有效的药物组合物及其使用方法成功地解决目前已知构成的缺点。
除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文中所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实施方案的实施或试验中，但是下面描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，将控制包括定义的专利说明。另外，这些材料、方法和实施例仅是说明性的，并且不旨在必需地限制。
具体实施方式
本发明是包括作为活性成分的TPEN和藻酸盐化合物的药物组合物。该药物组合物可以用于缺氧相关疾病的治疗。
参照附图和所附描述可以更好地理解本发明的原理和操作。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应该理解的是，本发明在其应用中并不必需限于以下描述中提出的细节或由实施例所例举的细节。本发明能有其它实施方案或能以各种方式实施或进行。
美国专利No.8,168,612和美国专利申请序列No.12/530,488教导藻酸盐化合物用于急性心肌梗塞(AMI)的治疗的用途。藻酸盐的治疗效果归因于在梗死组织的细胞外基质内固体凝胶的形成，从而在AMI之后的愈合和修复过程期间为伤害的心脏组织提供机械支持。现有技术没有描述或暗示藻酸盐可以发挥治疗上有益的生理活性的生物化学作用。
在将本发明进行实践时，本发明人惊讶地发现藻酸钠能够防止对培养的细胞的缺氧诱导的损伤。该发现是出人意料的，因为机械支持不可能与培养的细胞有关，而且因为藻酸盐不能渗透入活细胞内部。然而，如下文中实施例部分所述，在缺氧状况下向培养的心脏细胞提供藻酸钠导致由细胞释放的肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的量显著降低。由于这些酶的释放衰减，(作为缺氧损伤的指示)，需要生物化学途径，因此推测观察到的它们的释放减少是藻酸盐通过生物化学途径保护细胞免受缺氧损伤的能力的指示。实施例进一步显示，将藻酸钠与TPEN组合导致比用单独任一化合物显著地更有效的免受缺氧损伤的保护。
因此，根据本发明的一个方面，提供药物组合物，其包括N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)或其药学上可接受的盐、藻酸盐化合物和药学上可接受的载体。
本文中使用的短语“药物组合物”是指如本文所述的TPEN或其药学上可接受的盐和藻酸盐化合物与如药学上可接受的和合适的载体和赋形剂等的其它化学组分的制剂(preparation)。药物组合物的目的是便于活性成分向受试者的施用，或任选地便于其在无生命对象中或无生命对象上应用(接触)。
本文中使用的术语“药学上可接受的载体”是指对生物体不引起显著刺激并且不抑制分布、治疗性质或另外不破坏施用或应用的化合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。
本文中使用的术语“赋形剂”是指为了进一步便于药物的施用或应用而添加至药物组合物的惰性物质。
本文中使用的术语“TPEN”是指具有下面所示结构式的化合物N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺。
TPEN容易从如，例如德国的Sigma Aldrich Ltd等的几家商业制造商获得。
本文中使用的短语“药学上可接受的盐”是指母体化合物的带电种类及其抗衡离子，其通常用于改变母体化合物的溶解性特征和/或减少母体化合物对生物体的任何显著刺激，而不破坏所施用的化合物的生物活性和性质。药学上可接受的盐的实例，没有限制，包括包含如羧酸根或硫酸根阴离子等的阴离子，和/或如，但不限于，铵、钠和钾等的阳离子的盐。在例如Birge等人(J.Pharm.Sci.1977,66:1-19)中描述了合适的盐。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物中TPEN的终浓度范围为约1至50μM。在另一个实施方案中，药物组合物中TPEN的终浓度范围为约0.1至约100μM。在另一个实施方案中，药物组合物中TPEN的终浓度范围为约1至约10μM。在另一个实施方案中，药物组合物中TPEN的终浓度范围为约3至约5μM。
本文中使用的短语“藻酸盐化合物”是指源自海藻(例如，极北海带(Laminariahyperborean)、掌状海带(L.digitata)、南非褐藻(Eclonia maxima)、巨藻(Macrocystispyrifera)、淡黑巨海藻(Lessonia nigrescens)、岩衣藻(Ascophyllum codosum)、海带(L.japonica)、南极海茸(Durvillaea Antarctica)和海洋巨藻(D.potatorum))的聚阴离子多糖共聚物，并且其包括不同比例的β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古洛糖醛酸(G)残基。
根据本发明的教导，合适的藻酸盐化合物可以为任意的生物相容的、非免疫原性的、并且优选地，可生物蚀解的藻酸盐化合物。
在一些实施方案中，本发明的藻酸盐化合物具有范围在1:1和3:1之间的α-L-古洛糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸之间的单体比例，以及范围为约10至约300kDa的分子量。在一些实施方案中，藻酸盐化合物的分子量范围为约10至约50kDa。
藻酸盐化合物可以为游离碱、酸、碱、阴离子盐或单价阳离子盐的形式。在一些实施方案中，藻酸盐化合物是可溶性藻酸盐，例如，但不限于，藻酸钠、藻酸钾、藻酸锂、藻酸铷和藻酸的铯盐、以及铵盐，以及有机碱的可溶性藻酸盐，例如单、二或三乙醇胺藻酸盐和苯胺藻酸盐等。
在一个实施方案中，藻酸盐化合物为藻酸钠。符合欧洲和美利坚合众国(USA)药理学监管部门的所有质量和安全要求的药物级藻酸钠容易从如Novamatrix FMCBiopolymers(Drammen,Norway)或青岛荣德海藻有限公司(Qingdao Rongde Seaweed co.,Ltd)(青岛，中国)等的几家商业制造商获得。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物中藻酸盐化合物的终浓度范围为约0.1至约10％(w/v)。在另一个实施方案中，药物组合物中藻酸盐化合物的终浓度范围为约1至约4％(w/v)。在另一个实施方案中，药物组合物中藻酸盐化合物的终浓度为约2％(w/v)。在另一个实施方案中，药物组合物中藻酸盐化合物的终浓度为约1％(w/v)。
任选地，本发明的药物组合物还包括至少一种治疗剂。在本发明的药物组合物中可以包括的合适的治疗剂可以为，例如，生长因子(例如碱性成纤维细胞生长因子；bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、TGF-家族的成员、骨形态发生蛋白(BMP)、源自血小板的生长因子、血管生成素以及如生肌因子、转录因子、细胞因子等的其它因子，和同源框基因产物、多核苷酸、多肽、激素、抗炎药物、抗凋亡药物或抗生素药物。
有利地，一种或多种治疗剂可以与本发明的藻酸盐化合物化学连接。可以通过任意已知的化学键合方法，优选共价键来实施此类连接。合适的共价键可以为，例如，酯键(例如，羧酸酯键、氧烷基羧酸酯键、酰胺键或硫酯键)、糖苷键、碳酸酯键、氨基甲酸酯键、硫代氨基甲酸酯键、脲键或硫脲键。
在“Remington's Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co.,Easton,PA的最新版中可以发现药物的制剂(formulation)和施用的技术，其通过引用并入本文。
因此，根据本发明用途的药物组合物可以以常规方式使用一种以上的药学上可接受的载体来配制，所述载体包括赋形剂和助剂，其便于将活性成分加工成药学上可以使用的制剂。适当的制剂取决于所选的施用途径。剂量可以取决于采用的剂型和利用的施用途径而变化。可以由单个医生鉴于患者的状况来选择确切的制剂、施用途径和剂量(例如参见，Fingl等人，1975，在“The Pharmacological Basis of Therapeutics”,Ch.1p.l中)。
取决于是否选择局部或全身治疗或施用以及待治疗的区域，可以配制药物组合物以用于以一种或多种途径施用。可以通过吸入口服地，或例如通过静脉滴注或腹膜内、皮下、肌内或静脉内注射胃肠外地，或局部地(包括经皮、眼部、阴道、直肠、鼻内)进行施用。
在本发明的一个实施方案中，将药物组合物配制为适于注射或胃肠外施用的溶液。
在另一个实施方案中，将本发明的药物组合物配制成用于局部施用。
在另一个实施方案中，将本发明的药物组合物配制成用于眼部施用。
在另一个实施方案中，将本发明的药物组合物配制为滴眼剂。
当然，待施用或另外应用的药物组合物的量将取决于所治疗的受试者、痛苦的严重性、施用方式、处方医师的判断等。
如果需要，本发明的组合物可以存在于包装或分配装置中，例如FDA(美国食品和药品监督管理局)批准的试剂盒，其可以含有一种以上的含有活性成分的单位剂型。该包装可以，例如，包括金属或塑料箔，如但不限于，泡罩包装或加压容器(用于吸入)。包装或分配装置可以附有施用说明。该包装或分配器还可以附有与由调控药物的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的容器相关的通知，该通知反映了机构对用于人类或牲畜施用的组合物形式的批准。例如，此类通知可以为用于处方药的由美国食品和药品监督管理局批准的标签或批准的产品说明书。如本文所详述，还可以制备包括配制在相容性药物载体中的根据本发明实施方案的活性成分的组合物，将其放入合适的容器中，并标记用于治疗特定的医学状况、疾病或病症。
根据一些实施方案，将本文呈现的药物组合物包装在包装材料中并且在包装材料中或包装材料上印刷来识别，用于治疗缺氧相关疾病。
如上所述，本发明的药物组合物可以用于保护活细胞和身体组织免受缺氧损伤。因此，根据本发明的一个方面，提供缺氧相关疾病的治疗方法。该方法包括向需要的受试者施用治疗有效量的本发明的药物组合物的步骤。
本文中使用的术语“缺氧”是指氧缺乏或低于生理水平的不足的氧供应的环境，使得氧含量(O2)小于或等于约5％。在大多数情况下，缺氧组织将具有小于或等于约2％以下的氧含量。缺氧可能与小于20mm汞柱[mmHg]，例如小于15mmHg、小于10mmHg、小于5.0mmHg以下的低O2分压(pO2)有关。
本文使用的短语“缺氧相关疾病”是指涉及受试者组织中的缺氧的疾病、病症或状况。缺氧可能是一种症状，或在疾病、病症或状况的病因、发展、进程、改善或治愈中起作用。缺氧相关疾病可以为，但不限于，由缺血-再灌注损伤引起或与其相关的疾病、病症或状况。
根据本发明的教导的缺氧相关疾病可以为，但不限于心血管疾病、缺血性心脏病、急性心肌梗塞(AMI)、缺血性脑病症、缺血性中风、黄斑变性、眼部缺血综合征、缺血性视神经病(ION)、糖尿病性视网膜病、关节炎、炎症、败血症、败血症诱导的休克、肾脏疾病、组织纤维化、胃肠疾病、神经变性疾病、呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良、肺动脉高血压症、缺氧性肺动脉高血压症、严重肺动脉高血压症、COPD、糖尿病性视网膜病、糖尿病、角膜新生血管形成、致病性血管生长、肌肉骨骼病症、急性缺血性综合征、心肌缺氧、心脏肥大、缺血再灌注损伤(IRI)，IRI由以下引起：心脏外科手术、冠状动脉介入(球囊和支架)、心律失常管理和器官移植、用于冠状动脉支架置入的血管成形术期间的心律失常、或心脏瓣膜介入。
本文使用的短语“治疗”是指抑制、防止或阻止病理发展和/或引起病理的减轻、缓解或消退。本领域技术人员将理解，可以使用各种方法和分析来评估病理的发展，并且类似地，可以使用各种方法和测定来评估病理的减轻、缓解或消退。
本文中使用的短语“需要的受试者”是指被诊断为患有缺氧相关疾病的哺乳动物雄性或雌性受试者(例如人类)。在具体的实施方案中，该术语包含处于发展缺氧相关疾病的风险的个体。也考虑牲畜用途。受试者可以为任意性别或包括新生儿、婴儿、少年、青少年、成人和老年人的任意年龄。
本文中使用的短语“有效量”是指有效提供显著治疗益处的量。当然，待施用的组合物的量将取决于所治疗的受试者、痛苦的严重性、施用方式、处方医师的判断等。有效量范围为浓度范围在约0.1至约10％(w/v)之间、优选在约0.2至约5％(w/v)之间、优选在约0.3至约2％(w/v)之间、优选在约0.5至约1.5％(w/v)之间、优选为约2％(w/v)、优选为约1％的约0.1至约10ml(dwt在1至1000mg之间)，优选约1至约5ml(dwt在10至500mg之间)。
本文中使用的短语“治疗有效量”是指有效提供显著治疗益处的量。当然，待施用的组合物的量将取决于所治疗的受试者、痛苦的严重性、施用方式、处方医师的判断等。有效量范围为浓度范围在约0.1至约10％(w/v)之间、优选在约0.2至约5％(w/v)之间、优选在约0.3至约2％(w/v)之间、优选在约0.5至约1.5％(w/v)之间、优选为约2％(w/v)、优选为约1％(w/v)的约0.1至约10ml(dwt在1至1000mg之间)、优选约1至约5ml(dwt在10至500mg之间)。
本发明的药物组合物可以通过向需要的受试者在梗塞的心肌中或其周围提供治疗有效量的本发明的药物组合物来用于治疗心肌梗塞。
为了治疗急性心肌梗塞(AMI)，药物组合物可以通过合适的导管如球囊导管，在动脉内，优选地在冠状动脉内施用(例如参见，在Knight等人,Circulation 95:2075-2081,1997中)。
本发明的药物组合物可以在开始再灌注期间或之后在AMI的同一天施用。在一些实施方案中，药物组合物在AMI后约一天、AMI后约一天、AMI后约两天、AMI后约三天、AMI后约四天、AMI后约五天、AMI后约六天、或AMI后约七天施用。
为了治疗缺血性中风，本发明的药物组合物优选通过合适的导管动脉内施用。施用可以在再灌注开始时、期间或之后实施。
此类导管通常包括含有一个以上的内部通路(内腔)的伸长的柔性导管主体，使材料引入导管主体并且流过内腔的近端部分(proximal portion)，任选地具有锥形端的远端部分，以及为了使材料响应于施加的压力而离开导管在远端部分的端部处或附近的一个以上的出口端口(exit ports)。
在本发明的药物组合物的注射之前或同时，缺血引起的血栓必须通过例如血栓溶解、机械再通或栓子切除术清除。
血栓溶解涉及静脉内或动脉内施用纤溶酶原激活剂，如t-PA。动脉内血栓溶解涉及使用如例如在美国专利申请No.20080095760、Furlan等人(JAMA 282:2003-11,1999)、Arnold等人(J Neurol Neurosurg Psych 75:857-62,2004)和Lindsberg和Mattle(Stroke37:922-8,2006)中描述的本领域已知的过程通过导管的闭塞动脉的直接导管插入术和血栓溶解剂的局部施用。
例如，由Bergui等人(Stroke 37:145-50,2006)、Smith等人(Stroke 36:1432-8,2005)和美国专利申请No.20090105737和20050277979描述合适的机械再造管术和栓子切除术过程。
将本发明的药物组合物输送至大脑动脉中精确的期望位置，例如引起中风的闭塞(occ1usion)部位，可以使用如例如在美国专利No.4,995,862、6,379,373和美国专利申请公开No.20050228359中描述的本领域已知的过程实施。
如果需要，本发明的药物组合物和适合于将其施用至大脑动脉内的预定位置的导管可以包括在试剂盒中，所述试剂盒还包括识别用于缺血性脑病症的治疗的药物组合物的包装材料。
本发明的药物组合物还可以用于通过向缺血性肌肉组织提供治疗有效量的药物组合物来治疗与如缺血性横纹肌肉组织等的缺血性肌肉组织相关的疾病和状况。
本发明的药物组合物还可以用于通过将体外组织或器官或细胞浸入或浸浴在有效量的药物组合物中来保护和保存体外组织或器官免受缺血和氧自由基相关伤害。
尽管在单一药物组合物中TPEN和藻酸盐化合物的组合施用是优选的，但是本发明的活性成分可以分开施用。因此，可以通过以下步骤治疗缺氧相关疾病：(a)向需要的受试者施用治疗有效量的TPEN或其药学上可接受的盐；和(b)向受试者施用治疗有效量的藻酸盐化合物。在一个实施方案中，步骤(a)和(b)同时实施。在另一个实施方案中，步骤(a)和(b)顺序地实施。
本文中使用的术语“约”是指±10％。
术语“包括(comprises)”、“包括(comprising)”、“包括(includes)”、“包括(including)”、“具有(having)”以及它们的结合是指“包括但不限于”。
术语“由…组成”是指“包括且不限于”。
术语“基本上由...组成”是指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部分，但只有当另外的成分、步骤和/或部分不会实质上改变要求保护的组合物、方法和结构的基本和新颖特征时才可。
如本文所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
贯穿本申请，本发明的各种实施方案可以以范围形式呈现。应该理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对本发明范围的不灵活的限制。因此，应该认为范围的描述具体地公开所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，应该认为如1至6的范围的描述具体地公开如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等的子范围，以及该范围内的单个数值，例如1、2、3、4、5和6。无论范围的宽度如何，这都适用。
无论何时在本文中表示数值范围，其意在包括在所表示的范围内的任意引用的数值(分数或整数)。短语第一表示数值和第二表示数值“之间的范围(ranging/rangesbetween)”和从第一指示数值至第二指示数值的“范围(ranging/ranges from)”在本文中互换地使用，并且意在包括第一和第二指示数值以及其间的所有分数和整数数值。
如本文中所使用的，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和过程，包括但不限于，已知的或容易由化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的技术人员从已知的方式、手段、技术和过程发展的那些方式、手段、技术和过程。
应该认识到，为了清楚，在分开的实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中组合提供。相反地，为了简洁，在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以分开地或在任意合适的子组合中，或适当地在本发明的任意其它描述的实施方案中提供。不认为在各种实施方案的上下文中描述的某些特征是那些实施方案的基本特征，除非该实施方案在没有那些元素的情况下不起作用。
如上文所述的以及如所附权利要求部分所要求的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参照以下实施例，其与以上描述一起以非限制性方式说明本发明。
实施例1
TPEN和藻酸钠对在缺氧下由大鼠原代心脏细胞释放的CK和LDH量的影响材料与方法
化合物
N,N,N’,N’-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)购自德国的Sigma Aldrich。
藻酸钠(UP-VLVG药物级，Mw＝20-50kDa)购自中国青岛的青岛荣德海藻有限公司。
大鼠原代心脏细胞的准备
无菌地取出Sprague Dawley大鼠心脏(1-2天龄)，并且在不含Ca++和Mg++的PBS中洗浴三次以除去过量的血细胞。将心脏切碎成小碎片，然后如先前所述(Brik等人,BasicRes.Cardiol.85:237-246,1990),Shneyvays等人,J Mol Cell Cardiol.33:1249-1261,2001)在由无花果树提取物制备的蛋白水解酶-RDB溶液(Life Science research,Inst.,Nes Ziona,Israel)中搅动。然后在25℃下在PBS中将RDB溶液1:200稀释几个循环，每次10分钟。将添加有含有10％马血清的培养基的含有解离细胞的上清液悬浮液以500g离心5分钟。离心后，弃去上清液相，并且将细胞再悬浮于补充有10％热灭活马血清和0.5％鸡胚提取物的Dulbecco改良Eagle培养基中。将细胞悬浮液稀释为1×106个细胞/ml，并且将300pl样品放入24孔板(4块板)胶原/明胶涂布的塑料培养皿中。在每个孔中显示自发性收缩的汇合的单层(confluent monolayer)，在2天内在培养物中发育。之后的一天，洗涤细胞以除去死细胞，并且每2天和实验开始之前此时用不含葡萄糖的PBS替换生长培养基。然后在过程开始这天后的5天后对这些心肌细胞培养物体外进行实验。就在缺氧实验之前，将培养物孔在5％CO2和95％空气的潮湿气氛培养箱中于37℃孵育30分钟稳态。
缺氧诱导
使用基本上如由O.Golan等人(Biochemical pharmacology,81(2011),pp.1219-1227)所述的过程将来自新生大鼠心脏的约3×105个心肌细胞/孔用不含葡萄糖的PBS培养并且暴露于缺氧(剥夺氧气和葡萄糖)180分钟。
简言之，通过用100％氩替换空气在密闭室中进行缺氧。缺氧期间N2气氛中的氧水平低于1％。并且在缺氧180分钟后，PBS中的pO2为<0.4托。在3小时缺氧阶段结束时，以及因此在另外的2小时的复氧之后，基于从细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的活性来确定缺氧应激损伤。
酶释放测量
对于LDH和CK测量两者，将在缺氧下孵育180分钟的每个孔的25μL等分试样转移至干净的24孔板，将其放在自动分光光度计内，并且在振荡下在30℃下通过340nm的波长测量产物的酶活性。结果相对于对照来表示。
CK活性测量
使用来自Thermo Fisher Scientific Inc.Middletown,VA 22645-1905 USA的CK-NAC试剂(肌酸激酶，由N-乙酰半胱氨酸激活)在心脏细胞培养基(PBS)内测定肌酸激酶(CK)活性。在缺氧损伤结束时(180分钟后)收集培养基(PBS)样品(25pl)。
LDH活性测量
使用LDH-L试剂盒(Thermo Trace,Melbourne,Australia)在心脏细胞培养基(PBS)内测定乳酸脱氢酶(LDH)活性。在缺氧损伤结束时(180分钟后)收集培养基(PBS)样品(25pl)。
结果
下文中表1至10显示TPEN与藻酸钠组合有效地保护培养的心脏细胞免受缺氧损伤。
以0.3和1％的浓度向暴露于缺氧的心脏细胞施用的藻酸钠分别引起从细胞释放的CK的44.7和81.9％的减少(表1)。观察到的CK减少为藻酸钠能够保护培养的心脏细胞免受缺氧损伤的指示。由于预期分子量为20-50kDa的藻酸盐分子不能渗透入培养细胞中或在其中相互作用，所以该观察是非常令人惊讶的。
将藻酸钠浓度从0.1％增加至0.3％引起从细胞释放的CK和LDH的分别减少。例如，以0.1和0.3％的浓度提供的藻酸钠(与3μM TPEN组合)分别引起65.5和74.3％CK减少(表2-3)。类似地，以0.1和0.3％的浓度单独施用藻酸钠(无TPEN)分别引起8.7和64.5％的CK减少，以及分别为13.8和28.7％的LDH减少(表7-9)。
以从0.3至3μM增加的浓度施用TPEN引起从细胞释放的CK和LDH的分别减少。例如，以0.3、1和3μΜ提供的TPEN(与0.1％藻酸钠组合)分别引起20.5、60.8和65.5％的CK减少(表2)。然而，当以高于最佳浓度施用TPEN时，TPEN对CK和LDH减少的效果下降。例如，与由以3μΜ的浓度施用TPEN(与0.1％藻酸钠组合；表2)引起的65.5％的CK减少相比，以7.5μΜ施用的TPEN(与0.1％藻酸钠组合)引起仅46.2％的CK减少。
有趣的是，当以高于最佳浓度施用时，TPEN的下降功效通过增加藻酸钠的量而克服。因此，以7.5μM浓度施用的TPEN，与浓度为0.3％的藻酸钠组合引起71.2％的CK减少(表3)。
因此，结果表明在保护心脏细胞免受缺氧损伤方面，TPEN与藻酸钠的组合使用显著优于单独任一种化合物的使用。
表1
藻酸钠对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的CK的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的CK活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的CK活性)]×100。
表2
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的CK的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的CK活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的CK活性)]×100。
表3
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的CK的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的CK活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的CK活性)]×100。
表4
藻酸钠和TPEN对在缺氧下从大鼠心脏细胞的LDH的释放的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的LDH活性)]×100。
表5
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的LDH的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的LDH活性)]×100。
表6
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的LDH的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的LDH活性)]×100。
表7
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的CK的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的CK活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的CK活性)]×100。
表8
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的CK的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的CK活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的CK活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的CK活性)]×100。
表9
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的LDH的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的LDH活性)]×100。
表10
藻酸钠和TPEN对在缺氧下由大鼠心脏细胞释放的LDH的量的影响*
*将细胞暴露于缺氧3小时。
**如下计算值：[(在经处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)]/[(在未处理的细胞培养物中测量的LDH活性)-([(在不暴露于缺氧的对照细胞培养物中测量的LDH活性)]×100。
实施例2
向梗塞心肌组织诱导的狗冠状动脉内施用TPEN和藻酸钠。材料和方法
试验组合物：
试验组合物为：生理盐水(阴性对照)和由生理盐水中的3μM TPEN和1％(w/v)藻酸钠(UP-VLVG,Mw 20-50kDa)组成的TPEN/藻酸盐溶液。
急性心肌梗塞(AMI)的诱导
将两岁(20-25kg)的狗麻醉，并且插管并用室内空气呼吸。静脉注射羟吗啡酮盐酸盐(0.22mg/kg)和地西泮(0.17mg/kg)使动物镇静，并且用1-2％异氟烷(isofluorane)维持麻醉的水平。在胸部关闭并且在无菌条件下进行该过程。为了产生冠状动脉闭塞，通过股动脉切开术通过4JL导引导管经0.014英寸导丝推入2.7法国PTCA球囊导管。使用4.0mm直径、15mm的球囊。使在荧光透视引导下推进的、位于左主干冠状动脉中的导引导管和导丝，位于远端的Circumflex冠状动脉中。经导丝将球囊导管推入冠状动脉中并且位于接近第一边缘分支。在所有情况下，用750-1000USP单位的静脉内肝素钠使动物抗凝血。
冠状动脉内施用
一旦到位，使PTCA球囊膨胀以闭塞冠状动脉。通过心电图上的ST段升高以及通过经胸二维超声心动图评估的LV后壁运动的近乎不存在来确认冠状动脉的完全闭塞。在所有情况下，冠状动脉闭塞维持3至5小时。在闭塞结束时，将球囊放气以使冠状动脉再灌注。
将试验溶液(2ml体积)注入动物的Circumflex冠状动脉中。为了模拟对于试验溶液的使用可能的临床设定，在AMI的同一天(开始再灌注后约1小时)或AMI后2-5天进行试验溶液的冠状动脉注射。将狗随机分配以接受任意试验溶液。在AMI之后，将所有动物随访4个月。在诱导AMI之前、就在施用试验溶液之前以及之后的两个和四个月时，在基线处进行血管造影和超声心动图测量。
结束点
1.基于LV收缩末期和舒张末期体积的心室造影测量的渐进的LV扩张的预防或减弱。
2.基于LV射血分数(EF)的心室造影测量和LV缩短分数面积(FAS)的超声心动图测量，LV收缩功能的逐步恶化的预防。
3.基于梗塞的LV壁的收缩增厚的超声心动图测量的闭塞扩张的预防或衰减。
血管造影和超声心动图测量
在全身麻醉和无菌条件下在心脏导管插入术期间进行所有血管造影和超声心动图测量。在将狗放在其右侧上并且在注射20ml造影材料(RENO-M-60Squibb,Princeton,NJ)期间数字地记录的情况下，获得左心室造影照片。用放在LV水平的辐射不透明的校准网格(calibrated grid)进行图像放大的校正。使用面积长度法(Dodge等人,Am JCardiol.1966；18:10-24,1966)从LV剪影计算LV收缩末期(ESV)和舒张末期(EDV)体积。将左心室EF计算为EDV和ESV的差与EDV的比例乘以100(Sabbah等人,Circulation 89:2852-2859,1994)。
在狗放在右侧卧位的情况下进行所有二维超声心动图测量。使用带有3.5MHz转换器的General Electric VIVID 7Dimension超声系统进行超声心动图研究，并且记录在Mitsubishi MD3000VHS记录器上用于离线分析。记录在中乳头肌水平的LV短轴视图并且用于计算分数缩短百分比(FAS；Kono等人.J Am Coll Cardiol 1992；19:1101-1105,1992)，定义为舒张末期面积和收缩末期面积之间的差除以舒张末期面积乘以100。还使用短轴视图测量LV前壁、后壁和室间中隔的收缩壁增厚百分比，并且各自计算为在舒张末期时的壁厚与在收缩末期时的壁厚的比例除以在舒张末期时的壁厚乘以100。从所有分析排除期前收缩和期外收缩后心跳。
统计分析
在α设定在0.05的情况下使用重复测量的方差分析(ANOVA)来分析组内血管造影和超声心动图数据。如果总体ANOVA显著，则使用Student-Newman-Keuls试验进行治疗前(PRE)与2个月和4个月之间的配对比较。对于该试验，认为低于0.05的p值是显著的。为了评估治疗效果，对于两个研究组的每一个，计算从PRE至治疗后2个月和PRE至治疗后4个月的每个测量中的变化(Δ)。为了确定在对照组与TPEN/藻酸盐处理组之间是否存在Δ中的显著性差异，在认为p<0.05是显著的情况下，使用两个平均值的t-统计量。
尽管结合其具体实施方案描述了本发明，但是显然的是，对于本领域技术人员而言，许多替代、改进和变化将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的主旨和广泛范围内的所有此类替代、改进和变化。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请在本文中通过引用其整体并入本说明书，其程度如同各单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入本文。另外，本申请中任何参考文献的引用或识别不应被解释为承认此参考文献可以作为本发明的现有技术。在使用章节标题的范围内，不应将其解释为必要地限制。

Claims (27)

1.一种药物组合物，其包括N,N,N',N'-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)或其药学上可接受的盐、藻酸盐化合物和药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述藻酸盐化合物为藻酸钠。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述藻酸盐化合物的平均分子量范围为约10至约300kDa。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述藻酸盐化合物的平均分子量范围为约10至约50kDa。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述藻酸盐化合物的浓度范围为约0.1至约10％(w/v)。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述藻酸盐化合物的浓度范围为约1至约4％(w/v)。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述藻酸盐化合物的浓度为约2％(w/v)。
8.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述藻酸盐化合物的浓度为约1％(w/v)。
9.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述TPEN的浓度范围为0.1至100μΜ。
10.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述TPEN的浓度范围为1至50μΜ。
11.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述TPEN的浓度范围为1至10μΜ。
12.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物中所述TPEN的浓度范围为3至5μΜ。
13.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述藻酸盐化合物中α-L-古洛糖醛酸和β-D-甘露糖醛酸之间的单体比例范围在1:1和3:1之间。
14.一种缺氧相关疾病的治疗方法，其包括向需要的受试者施用治疗有效量的根据权利要求1所述的药物组合物，由此治疗所述缺氧相关疾病。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述缺氧相关疾病选自由以下组成的组：缺血再灌注损伤(IRI)、心血管疾病、缺血性心脏病、缺血性脑病症、黄斑变性、眼部缺血综合征、缺血性视神经病(ION)、糖尿病性视网膜病、关节炎、炎症、败血症、败血症诱导的休克、肾脏病、组织纤维化、胃肠疾病、神经变性疾病、呼吸窘迫综合征、支气管肺发育不良、肺动脉高血压症、缺氧性肺动脉高血压症、严重肺动脉高血压症、COPD、糖尿病性视网膜病、糖尿病、角膜新生血管形成、致病性血管生长、肌肉骨骼病症。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述缺血性心脏病为急性心肌梗塞。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述施用通过注射或导管插入术实施。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述导管插入术为动脉内导管插入术。
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述有效量的范围为约0.1至约10ml。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述有效量的范围为约0.5至约5ml。
21.根据权利要求14所述的方法，其中所述缺血性脑病症为缺血性中风。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述施用通过动脉内导管插入术实施。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述施用在再灌注开始时、期间或之后实施。
24.一种缺氧相关疾病的治疗方法，其包括以下步骤：
(a)向需要的受试者施用治疗有效量的TPEN或其药学上可接受的盐；和
(b)向所述受试者施用治疗有效量的藻酸盐化合物，由此治疗所述缺氧相关疾病。
25.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(a)和(b)同时实施。
26.根据权利要求24所述的方法，其中步骤(a)和(b)顺序地实施。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述藻酸盐化合物为藻酸钠。
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