CN108070574A - 灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，命名为CiP‑G175F蛋白，如序列表的序列1所示。本发明还保护CiP‑G175F蛋白作为过氧化物酶的应用。本发明提供的过氧化物酶，发挥功能的单元为单一蛋白质，更加适用于工业化大规模生产。本发明提供的过氧化物酶，比活力高、底物亲和度高、底物谱广、性质稳定，可应用于清除废水中酚类物质、降解苯类物质、催化染料脱色、生物传感器、医药领域等多个领域，生产不受地域和气候限制。本发明具有重大的应用推广价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及一种灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用。
背景技术
过氧化物酶是一系列能够氧化芳香胺类、酚类等化合物的氧化剂。过氧化物酶可以参与清除废水中的酚类物质，降解苯类物质，催化染料脱色，可用作清洁剂等，在纸浆造纸工业中极具应用潜力。过氧化物酶还可用于食品行业、煤炭行业、化工行业等多个领域。
现有技术中，过氧化物酶经常用作酶联免疫吸附试验的标记酶，例如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)。但是，HRP由至少12种不同催化活性的酶组成，且酶的比例随不同的生长周期进行改变。
发明内容
本发明的目的是提供一种灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用。
本发明提供的蛋白质，命名为CiP-G175F蛋白，如序列表的序列1所示。
编码CiP-G175F蛋白的基因(CiP-G175F基因)也属于本发明的保护范围。
所述基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)编码区序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码过氧化物酶的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码过氧化物酶的DNA分子。
上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。
含有CiP-G175F基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述表达盒中，启动子具体可为AOX1启动子。
所述表达盒中，终止子具体可为AOX1终止子。
所述重组表达载体可为在表达载体中插入所述CiP-G175F基因得到的重组质粒。所述表达载体具体可为pPIC9K载体。
所述重组菌是将所述CiP-G175F基因导入出发菌得到的。所述基因具体可通过以上任一所述重组表达载体导入出发菌。所述出发菌可为毕赤酵母，具体可为毕赤酵母X33。将毕赤酵母作为出发菌表达外源蛋白，具有生物量高、表达量高、生产成本低，产物稳定性好的优点。
本发明还保护CiP-G175F蛋白作为过氧化物酶的应用。所述应用中，底物为ABTS或TMB。所述应用中，反应条件为pH4.5。所述应用中，反应体系为pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液。
本发明还保护CiP-G175F蛋白在制备具有过氧化物酶功能的产品中的应用。所述应用中，底物为ABTS或TMB。所述应用中，反应条件为pH4.5。所述应用中，反应体系为pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液。
本发明还保护CiP-G175F蛋白的如下应用：对过氧化物酶底物进行氧化反应。所述应用中，底物为ABTS或TMB。所述应用中，反应条件为pH4.5。所述应用中，反应体系为pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液。
本发明还保护一种制备CiP-G175F蛋白的方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，得到CiP-G175F蛋白。所述培养的具体方法为：取所述重组菌，接种至发酵培养基(初始OD600nm值为10-16，具体可为12)，30℃、200rpm振荡培养84小时；培养过程中，分别于培养24小时后、培养36小时后、培养48小时后、培养60小时后和培养72小时后向体系中加入甲醇，每次加入甲醇后体系中的甲醇浓度为0.5％(体积分数)。所述方法还包括如下步骤：①完成所述培养后，离心收集上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液；②取步骤①得到的滤液，装入透析袋中，将透析袋置于pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中透析，然后浓缩，然后用0.2μm滤膜过滤并收集滤液；③取步骤②得到的滤液，脱盐、浓缩，然后进行FPLC纯化。FPLC纯化的方法如下：层析柱：阴离子柱HiTrap DEAE FF(GE Healthcare，产品目录编号为：17-5154-01)，柱体积为5ml；洗脱过程(流速1ml/min)：先用pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分平衡柱子；然后上样1ml浓缩蛋白液；然后用50ml pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤；然后用A液和/或B液作为流动相进行洗脱(A液为pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，B液为含1M NaCl的pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱时间为80min)，从洗脱初始时刻至洗脱终止时刻，A液占流动相的体积百分比由100％线性降低至0％，收集洗脱过程中保留时间为40min-50min的过柱后溶液，得到CiP-G175F蛋白溶液。
本发明还保护一种制备过氧化物酶的方法，包括如下步骤：培养所述重组菌，得到过氧化物酶。所述培养的具体方法为：取所述重组菌，接种至发酵培养基(初始OD600nm值为10-16，具体可为12)，30℃、200rpm振荡培养84小时；培养过程中，分别于培养24小时后、培养36小时后、培养48小时后、培养60小时后和培养72小时后向体系中加入甲醇，每次加入甲醇后体系中的甲醇浓度为0.5％(体积分数)。所述方法还包括如下步骤：①完成所述培养后，离心收集上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液；②取步骤①得到的滤液，装入透析袋中，将透析袋置于pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中透析，然后浓缩，然后用0.2μm滤膜过滤并收集滤液；③取步骤②得到的滤液，脱盐、浓缩，然后进行FPLC纯化。FPLC纯化的方法如下：层析柱：阴离子柱HiTrap DEAE FF(GE Healthcare，产品目录编号为：17-5154-01)，柱体积为5ml；洗脱过程(流速1ml/min)：先用pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分平衡柱子；然后上样1ml浓缩蛋白液；然后用50ml pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤；然后用A液和/或B液作为流动相进行洗脱(A液为pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，B液为含1M NaCl的pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱时间为80min)，从洗脱初始时刻至洗脱终止时刻，A液占流动相的体积百分比由100％线性降低至0％，收集洗脱过程中保留时间为40min-50min的过柱后溶液，得到过氧化物酶溶液。
本发明提供的过氧化物酶，发挥功能的单元为单一蛋白质，更加适用于工业化大规模生产。本发明提供的过氧化物酶，比活力高、底物亲和度高、底物谱广、性质稳定，可应用于清除废水中酚类物质、降解苯类物质、催化染料脱色、生物传感器、医药领域等多个领域，生产不受地域和气候限制。本发明具有重大的应用推广价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pPIC9K载体：Invitrogen，其产品目录号为V17520；pPIC9K载体中位于多克隆位点(MCS)上游的启动子为AOX1启动子，在AOX1启动子下游且MCS上游有信号肽，信号肽带有起始密码子ATG，因此在MCS处插入的外源基因可以没有起始密码子，只要三联密码子与之相符，没有移码即可，在蛋白表达加工成熟的过程中信号肽会自行切除。毕赤酵母(Pichiapastoris)X33，简称毕赤酵母X33：invitrogen，货号为C18000。
pH6.0、50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液：溶剂为水；溶质及其浓度如下：磷酸氢二钠6.15mM，磷酸二氢钠43.85mM。pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液：溶剂为水，溶质及其浓度如下：磷酸氢二钠12.2mM，磷酸二氢钠7.8mM。pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液：溶剂为水，溶质是醋酸和醋酸钠；醋酸钠的浓度为50mM，用醋酸调pH值为4.5。
实施例1、蛋白及其编码基因的发现
经过大量序列分析以及功能验证，从灰盖鬼伞中发现一个新蛋白，将其命名为CiP蛋白。CiP蛋白如序列表的序列3所示。将编码CiP蛋白的基因命名为CiP基因，如序列表的序列4所示。
在CiP蛋白的基础上进行大量单点突变和多点突变，分别进行功能验证，发现一个活性增高的突变蛋白，将其命名为CiP-G175F蛋白。CiP-G175F蛋白如序列表的序列1所示。将编码CiP-G175F蛋白的基因命名为CiP-G175F基因，如序列表的序列2所示。
实施例2、重组菌的构建
一、重组菌X33/pPIC9K-CiP的构建
将序列表的序列4所示的双链DNA分子插入pPIC9K载体的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-CiP。
将重组质粒pPIC9K-CiP用限制性内切酶SacⅠ线性化，然后导入毕赤酵母X33，得到重组菌，将其命名为重组菌X33/pPIC9K-CiP。
二、重组菌X33/pPIC9K-CiP-G175F的构建
将序列表的序列2所示的双链DNA分子插入pPIC9K载体的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-CiP-G175F。
将重组质粒pPIC9K-CiP-G175F用限制性内切酶SacⅠ线性化，然后导入毕赤酵母X33，得到重组菌，将其命名为重组菌X33/pPIC9K-CiP-G175F。
三、重组菌X33/pPIC9K的构建
将pPIC9K载体用限制性内切酶SacⅠ线性化，然后导入毕赤酵母X33，得到重组菌，将其命名为重组菌X33/pPIC9K。
实施例3、蛋白的制备和纯化
试验菌株为：重组菌X33/pPIC9K-CiP、重组菌X33/pPIC9K-CiP-G175F或重组菌X33/pPIC9K。发酵培养基的溶剂为pH6.0、50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；溶质及其浓度如下：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、山梨醇5g/L、酪蛋白水解物20g/L。
1、取试验菌株，接种至发酵培养基(初始OD600nm值为12，实际应用中10-16均可)，30℃、200rpm振荡培养84小时。培养过程中，分别于培养24小时后、培养36小时后、培养48小时后、培养60小时后和培养72小时后向体系中加入甲醇，每次加入甲醇后体系中的甲醇浓度为0.5％(体积分数)。
2、完成步骤1的培养后，4℃、8000rpm离心5min，收集上清液，用0.45μm滤膜过滤并收集滤液。
3、取步骤2得到的滤液，装入透析袋中，将透析袋置于pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，4℃透析12h(每4h换液一次)。
4、完成步骤3后，取透析袋中的液体，在PEG20000中浓缩，然后4℃、10000rpm离心30min，收集上清液，用0.2μm滤膜过滤并收集滤液。
5、取步骤4得到的滤液，用HiTrapTM脱盐柱(GE Healthcare，产品目录编号为GE17-5130-01)脱盐，脱盐缓冲液为pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，收集蛋白峰值处的流出液。
6、取步骤5得到的流出液，加入超滤管中，4℃、10000rmp离心1h，收集浓缩蛋白液。
7、取步骤6得到的浓缩蛋白液，进行FPLC纯化。
层析柱：阴离子柱HiTrap DEAE FF(GE Healthcare，产品目录编号为：17-5154-01)，柱体积为5ml；
洗脱过程(流速1ml/min)：先用pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液充分平衡柱子；然后上样1ml浓缩蛋白液；然后用50ml pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液洗涤；然后用A液和/或B液作为流动相进行洗脱(A液为pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，B液为含1M NaCl的pH7.0、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，洗脱时间为80min)，从洗脱初始时刻至洗脱终止时刻，A液占流动相的体积百分比由100％线性降低至0％(相应的B液占流动相的体积百分比由0％线性升高至100％)。
重组菌X33/pPIC9K-CiP进行以上步骤，收集洗脱过程中保留时间为40min-50min的过柱后溶液，得到CiP蛋白溶液。重组菌X33/pPIC9K-CiP-G175F进行以上步骤，收集洗脱过程中保留时间为40min-50min的过柱后溶液，得到CiP-G175F蛋白溶液。重组菌X33/pPIC9K进行以上步骤，收集洗脱过程中保留时间为40min-50min的过柱后溶液，得到对照溶液。
实施例4、酶活力测定
待测蛋白溶液为：实施例3制备的CiP蛋白溶液、实施例3制备的CiP-G175F蛋白溶液或对照溶液。
一、以ABTS为底物的酶活力测定
底物：ABTS。ABTS的全称为2,2'-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐。
过氧化物酶酶活测定原理：过氧化物酶能够利用氧气在H2O2存在时将ABTS氧化生成ABTS+并且生成水，ABTS+在420nm处有较强的吸收峰。
ABTS-H2O2溶液：溶剂为pH4.5、50mM醋酸缓冲溶液；溶质及其浓度如下：2mM ABTS和2.9mM H2O2。
试验组：在0.3mL ABTS-H2O2溶液中加入1μl待测蛋白溶液。对照组：在0.3mL ABTS-H2O2溶液中加入1μl灭活后的待测蛋白溶液(灭活方法：沸水中煮10分钟)。1μl忽略不计，反应体系的体积仍以0.3mL计。25℃静置反应1分钟。检测420nm的吸光值。△G为在1min内吸光值的变化。
1个酶活单位(U)：每分钟催化1μmol ABTS氧化所需的酶量。
酶活力＝(△G×V总)/(ε×L)；
V总＝0.3mL；消光系数ε＝36,000M-1·cm-1；L为比色杯的光径，本试验中L＝0.1cm。
待测蛋白溶液的酶活力(U/ml)除以待测蛋白溶液的蛋白浓度(以总蛋白计，mg/ml)，得到待测蛋白的比活力(U/mg)。
进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置5个重复处理，结果见表2。
二、以TMB为底物的酶活力测定
底物：TMB。TMB的全称为四甲基联苯胺。
过氧化物酶酶活测定原理：过氧化物酶能够利用氧气在H2O2存在时将TMB氧化生成蓝色荧光产物并且生成水，蓝色荧光产物在650nm处有较高的吸收峰。
TMB-H2O2溶液：溶剂为pH4.5、50mM的醋酸缓冲溶液；溶质及其浓度如下：4mM TMB和2mM H2O2。
试验组：在0.3mL TMB-H2O2溶液中加入1μl待测蛋白溶液。对照组：在0.3mL TMB-H2O2溶液中加入1μl灭活后的待测蛋白溶液(灭活方法：沸水中煮10分钟)。1μl忽略不计，反应体系的体积仍以0.3mL计。25℃静置反应1分钟。检测650nm的吸光值。△G为在1min内吸光值的变化。
1个酶活单位(U)：每分钟催化1μmol TMB氧化所需的酶量。
酶活力＝(△G×V总)/(ε×L)；
V总＝0.3mL；消光系数ε＝439000M-1·cm-1；L为比色杯的光径，本试验中L＝0.1cm。
待测蛋白溶液的酶活力(U/ml)除以待测蛋白溶液的蛋白浓度(以总蛋白计，mg/ml)，得到待测蛋白的比活力(U/mg)。
进行三次重复试验，每次重复试验中每组设置5个重复处理，结果见表2。以ABTS为底物，对照溶液的酶活为0U/mg。以TMB为底物，对照溶液的酶活为0U/mg。
表2CiP蛋白或CiP-G175F蛋白的比活力测定结果(单位：U/mg)
| CiP蛋白 | CiP-G175F蛋白 | |
| 以ABTS为底物 | 208.83 | 305.75 |
| 以TMB为底物 | 17.27 | 55.26 |
结果表明，与CiP蛋白相比，CiP-G175F蛋白的过氧化物酶酶活具有大幅度的提高，在工业方面有巨大的应用潜能。
序列表
<110> 福建力多利生物科技有限公司
<120> 灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用
<130> GNCYX161989
<160> 4
<210> 1
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Lys Leu Ser Leu Leu Ser Thr Phe Ala Ala Val Ile Ile Gly Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Pro Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly
20 25 30
Gly Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu
35 40 45
Asp Asp Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro
50 55 60
Val Arg Lys Ser Leu Arg Ile Ala Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser
65 70 75 80
Pro Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly
85 90 95
Ser Ile Ile Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly
100 105 110
Gly Leu Thr Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His
115 120 125
Gly Val Ser Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Ala Ala Val Gly Met
130 135 140
Ser Asn Cys Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser
145 150 155 160
Asn Ser Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Phe Asn
165 170 175
Thr Val Thr Ala Ile Leu Asp Arg Phe Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro
180 185 190
Asp Glu Val Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu
195 200 205
Gly Leu Asn Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln
210 215 220
Val Phe Asp Thr Gln Phe Tyr Ile Glu Thr Leu Leu Lys Gly Thr Thr
225 230 235 240
Gln Pro Gly Pro Ser Leu Gly Phe Ala Glu Glu Leu Ser Pro Phe Pro
245 250 255
Gly Gly Phe Arg Ile Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg
260 265 270
Thr Ala Cys Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly
275 280 285
Gln Arg Phe Arg Ala Ala Met Ala Lys Met Ser Val Leu Gly Phe Asp
290 295 300
Arg Asn Ala Leu Thr Asp Cys Ser Asp Val Ile Pro Ser Ala Val Ser
305 310 315 320
Asn Asn Ala Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile
325 330 335
Glu Val Ser Cys Pro Ser Glu Pro Phe Pro Glu Ile Ala Thr Ala Ser
340 345 350
Gly Pro Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro
355 360
<210> 2
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aagttgtctc ttctgtctac tttcgctgct gtcatcattg gagctttggc tttgccacaa 60
ggaccaggag gtggaggttc tgtgacttgt ccaggtggac agtccacttc caactctcag 120
tgttgtgtct ggttcgatgt tctggatgat cttcaaacta acttctatca aggatctaag 180
tgtgagtccc cagttcgtaa gtctttgaga attgccttcc acgacgctat tggattctct 240
ccagctttga ccgctgctgg tcagtttggt ggtggtggtg ccgacggttc catcatcgct 300
cattcaaaca ttgaactggc tttccctgct aacggtggtc tgactgacac cgtggaagct 360
ctgcgtgctg tcggtatcaa ccacggtgtt tcttttggtg acttgattca attcgctgca 420
gctgttggta tgtctaattg tccaggttcc ccacgtttgg agtttctgac tggtagatcc 480
aactcttccc agccatctcc accatccctt attccaggtc cattcaacac tgttactgcc 540
atcttggaca gattcggtga tgctggtttc tctccagacg aggttgtcga cttgttggcc 600
gctcactctc ttgcttctca agagggtttg aactccgcta tcttcagatc cccacttgac 660
tctactcctc aagttttcga tacccaattc tacatcgaga ccttgttgaa gggtaccacc 720
cagccaggtc catctttggg tttcgctgag gagttgtccc ctttcccagg tggtttccgt 780
atcagatctg acgccttgtt ggctagagat tctagaaccg cctgcagatg gcaatccatg 840
acctcttcca atgaggttat gggtcaaaga tttagagctg ctatggctaa aatgtctgtc 900
ttgggtttcg acagaaacgc ccttactgac tgttccgacg tcattccatc tgccgtttct 960
aacaatgcag ctccagttat ccctggtggt ttgaccgtcg atgacatcga ggtttcctgt 1020
ccttctgagc cattcccaga aatcgccact gcttccggtc cattgccatc ccttgctcct 1080
gccccatag 1089
<210> 3
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Lys Leu Ser Leu Leu Ser Thr Phe Ala Ala Val Ile Ile Gly Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Pro Gln Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Cys Pro Gly
20 25 30
Gly Gln Ser Thr Ser Asn Ser Gln Cys Cys Val Trp Phe Asp Val Leu
35 40 45
Asp Asp Leu Gln Thr Asn Phe Tyr Gln Gly Ser Lys Cys Glu Ser Pro
50 55 60
Val Arg Lys Ser Leu Arg Ile Ala Phe His Asp Ala Ile Gly Phe Ser
65 70 75 80
Pro Ala Leu Thr Ala Ala Gly Gln Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly
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Ser Ile Ile Ala His Ser Asn Ile Glu Leu Ala Phe Pro Ala Asn Gly
100 105 110
Gly Leu Thr Asp Thr Val Glu Ala Leu Arg Ala Val Gly Ile Asn His
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Gly Val Ser Phe Gly Asp Leu Ile Gln Phe Ala Ala Ala Val Gly Met
130 135 140
Ser Asn Cys Pro Gly Ser Pro Arg Leu Glu Phe Leu Thr Gly Arg Ser
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Asn Ser Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Leu Ile Pro Gly Pro Gly Asn
165 170 175
Thr Val Thr Ala Ile Leu Asp Arg Phe Gly Asp Ala Gly Phe Ser Pro
180 185 190
Asp Glu Val Val Asp Leu Leu Ala Ala His Ser Leu Ala Ser Gln Glu
195 200 205
Gly Leu Asn Ser Ala Ile Phe Arg Ser Pro Leu Asp Ser Thr Pro Gln
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Gly Gly Phe Arg Ile Arg Ser Asp Ala Leu Leu Ala Arg Asp Ser Arg
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Thr Ala Cys Arg Trp Gln Ser Met Thr Ser Ser Asn Glu Val Met Gly
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Asn Asn Ala Ala Pro Val Ile Pro Gly Gly Leu Thr Val Asp Asp Ile
325 330 335
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340 345 350
Gly Pro Leu Pro Ser Leu Ala Pro Ala Pro
355 360
<210> 4
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aagttgtctc ttctgtctac tttcgctgct gtcatcattg gagctttggc tttgccacaa 60
ggaccaggag gtggaggttc tgtgacttgt ccaggtggac agtccacttc caactctcag 120
tgttgtgtct ggttcgatgt tctggatgat cttcaaacta acttctatca aggatctaag 180
tgtgagtccc cagttcgtaa gtctttgaga attgccttcc acgacgctat tggattctct 240
ccagctttga ccgctgctgg tcagtttggt ggtggtggtg ccgacggttc catcatcgct 300
cattcaaaca ttgaactggc tttccctgct aacggtggtc tgactgacac cgtggaagct 360
ctgcgtgctg tcggtatcaa ccacggtgtt tcttttggtg acttgattca attcgctgca 420
gctgttggta tgtctaattg tccaggttcc ccacgtttgg agtttctgac tggtagatcc 480
aactcttccc agccatctcc accatccctt attccaggtc caggaaacac tgttactgcc 540
atcttggaca gattcggtga tgctggtttc tctccagacg aggttgtcga cttgttggcc 600
gctcactctc ttgcttctca agagggtttg aactccgcta tcttcagatc cccacttgac 660
tctactcctc aagttttcga tacccaattc tacatcgaga ccttgttgaa gggtaccacc 720
cagccaggtc catctttggg tttcgctgag gagttgtccc ctttcccagg tggtttccgt 780
atcagatctg acgccttgtt ggctagagat tctagaaccg cctgcagatg gcaatccatg 840
acctcttcca atgaggttat gggtcaaaga tttagagctg ctatggctaa aatgtctgtc 900
ttgggtttcg acagaaacgc ccttactgac tgttccgacg tcattccatc tgccgtttct 960
aacaatgcag ctccagttat ccctggtggt ttgaccgtcg atgacatcga ggtttcctgt 1020
ccttctgagc cattcccaga aatcgccact gcttccggtc cattgccatc ccttgctcct 1080
gccccatag 1089
Claims (9)
1.一种蛋白质，如序列表的序列1所示。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(1)或(2)或(3)：
(1)编码区序列表中序列2所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码过氧化物酶的DNA分子；
(3)与(1)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码过氧化物酶的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、转基因植物组织或重组菌。
5.权利要求1所述蛋白质作为过氧化物酶的应用。
6.权利要求1所述蛋白质在制备具有过氧化物酶功能的产品中的应用。
7.权利要求1所述蛋白质的如下应用：对过氧化物酶底物进行氧化反应。
8.一种制备权利要求1所述蛋白质的方法，包括如下步骤：培养权利要求4所述重组菌，得到权利要求1所述蛋白质。
9.一种制备过氧化物酶的方法，包括如下步骤：培养权利要求4所述重组菌，得到过氧化物酶。
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| CN201611020624.5A CN108070574B (zh) | 2016-11-14 | 2016-11-14 | 灰盖鬼伞来源的过氧化物酶的突变体及其编码基因和应用 |
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Cited By (1)
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| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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| WO2006114616A1 (en) * | 2005-04-26 | 2006-11-02 | University Of Sussex | Engineered peroxidases with veratryl alcohol oxidase activity |
| CN104540955A (zh) * | 2012-07-19 | 2015-04-22 | 诺维信公司 | 用于增加纤维素材料的酶水解的方法 |
| CN105441400A (zh) * | 2015-06-01 | 2016-03-30 | 南阳师范学院 | 突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用 |
-
2016
- 2016-11-14 CN CN201611020624.5A patent/CN108070574B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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