CN105441400A - 突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用，属于基因工程及环境技术领域。本发明利用基因合成定点突变平台合成CIPmt4，经3轮易错PCR，抗性筛选得到含5个氨基酸突变(I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F)的灰盖鬼伞过氧化物酶CIPmt5，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:3所示。该突变酶的最适反应温度由野生型的25℃提高到45℃，最适反应pH由原来的5.0提高到6.5，高活性反应pH变宽，稳定性增强，更适于工业化应用。除次甲基蓝外，突变酶CIPmt5对染料氨基黑、甲基橙、刚果红、苯胺蓝、结晶紫、溴酚蓝的降解最适pH均向中性、碱性方向偏移，并且对7种染料的降解能力均显著高于野生型酶。

Description

突变灰盖鬼伞过氧化物酶、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶，同时还涉及该突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备方法和应用，属于基因工程及环境技术领域。
背景技术
随着染织业发展，大量的染料以废水的形式排放进入周围环境，严重破坏了生态系统，有毒染料废水处理已成为困扰环境保护工作的难题。染织业中的偶氮染料具有复杂的芳香环结构，对理化因素、热和光稳定，较难被生物降解。目前使用的染料废水处理方法主要包括物理、化学和生物的方法。理化方法成本较高，并且不破坏染料结构，只是把染料从一相转移到另一相，会形成新的污染；生物降解工艺具有将染料降解或者转化成二氧化碳和无机盐的潜能，已经逐渐成为有希望替代现有处理工艺的一种方法，其中酶法降解染料已逐渐引起了人们的重视。
过氧化物酶(EC1.11.1.7)广泛存在于动物、植物和微生物体内，是一类以铁卟啉为辅基、过氧化氢为电子受体的氧化还原酶，可氧化多种有机和无机分子，在免疫检测、生物传感器、工业废水处理方面有着广泛的应用。过氧化物酶家族中研究最多、应用范围最广的是植物来源的辣根过氧化物(horseradishperoxidase，HRP)。但是，HRP的生产受到地域和气候的限制，产量低、周期长，使其在工业上的应用受到限制。由墨汁鬼伞菌分泌的灰盖鬼伞过氧化物酶(CoprinuscinereusPeroxidaseCIP)一经报道就引起了人们的极大关注，该酶最先由Shinmen分离纯化得到，由343个氨基酸组成，与Arthromycesramosusperoxidase(ARP)在本质上相同。尽管CIP与HRP的同源性不超过10％～16％，但酶学特性和底物广谱性却十分相似。研究发现，灰盖鬼伞过氧化物酶可以参与清除废水中的酚类物质和苯类物质，并用作清洁剂、生物传感器等，它能在较宽的pH和温度范围内有效降解刚果红、甲基橙等偶氮类染料，在纸浆造纸工业极具应用潜力。同时CIP的生产不受地域和气候限制，是一种有望替代HRP成为有广阔应用前景的工业用酶。
灰盖鬼伞属于中温菌，适宜生长在偏酸性环境中，因此产生的CIP在中温和偏酸性条件下才表现出较高的催化活性，并且CIP对H2O2不稳定。但作为工业酶制剂，有关CIP的诸多应用都要求在中性或碱性条件、高温环境中进行，例如造纸工业中纸浆的生物漂白，洗涤行业的去污过程等。由于天然CIP的酶学性质致其无法满足工业化应用要求，其产业化应用受到极大限制。
利用分子定向进化技术进行CIP酶学性质的分子改良是提高酶的热稳定性和碱适应性的重要途径，如Cherry等利用定向进化技术得到了一个氧化稳定性提高100倍、热稳定性提高174倍的突变CIP(I49S、V53A、T121A、M166F、E239G、M242I和Y272F)，但是该突变酶的高温稳定性较差，40℃处理5min活性下降为87％。目前国际上尚没有关于CIP的最适反应pH向中、碱性方向偏移，最适反应温度大幅提高且高温稳定性增强的分子定向进化研究，国内对灰盖鬼伞的研究仅处于菌种发酵生产阶段，对酶的研究甚少。董冰雪等(2014)公开了一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶，由工程菌CIPmt6-2/GS115(是由含6个氨基酸突变的毕赤酵母密码子偏好性的CIP基因(I49S、V53A、T121A、M166F、Y272F和T280P)连接在表达载体pPICZαA上，整合于毕赤酵母GS115染色体上构建而成)发酵制备，与野生酶相比，突变酶的最适反应温度有所提高，最适反应pH向中性方向偏移1.5单位，并且突变CIP用酵母发酵，生产不受地域、气候限制，周期短、价格低廉，对温度和双氧水的稳定性增强。然而，CIPmt6-2的最适反应温度仅为32℃，高活性pH范围窄，难以适应工业废水处理中高温反应需要。
发明内容
本发明的目的是提供一种最适反应温度45℃、最适反应pH6.5的突变灰盖鬼伞过氧化物酶。
同时，本发明还提供一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备方法。
最后，本发明还提供一种突变灰盖鬼伞过氧化物酶的应用。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
突变灰盖鬼伞过氧化物酶，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。
基因，编码上述突变灰盖鬼伞过氧化物酶，其碱基序列如SEQIDNO:57所示。
重组表达载体，包含上述编码突变灰盖鬼伞过氧化物酶的基因。
重组表达基因工程菌，包含上述重组表达载体。
突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备方法，包括以下步骤：取重组表达基因工程菌培养，诱导表达突变灰盖鬼伞过氧化物酶。
所述诱导表达的诱导剂为甲醇。
突变灰盖鬼伞过氧化物酶的应用，具体为过氧化物酶在染料废水处理(或降解染料)中的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用基因合成定点突变平台合成CIPmt4，经3轮易错PCR，抗性筛选得到含5个氨基酸突变(I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F)的灰盖鬼伞过氧化物酶CIPmt5，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。该突变酶的最适反应温度由野生型的25℃提高到45℃，最适反应pH由原来的5.0提高到6.5，高活性反应pH变宽，稳定性增强，更适合工业化应用。
在选用的偶氮染料氨基黑、甲基橙、刚果红，杂环类染料次甲基蓝、苯胺蓝和三芳甲烷类染料结晶紫、溴酚蓝共7种染料中，除次甲基蓝外，突变酶对其他6种染料降解的最适pH均向中性、碱性方向偏移，并且突变酶对7种染料的降解能力均显著高于野生型酶。
附图说明
图1为实施例1中采用基因合成定点突变平台合成CIPmt4基因的PCR产物电泳图；
图2为突变CIP基因表达载体的构建示意图；
图3为CIPmt5和CIPwt蛋白纯化图；
图4为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt的最适反应pH图；
图5为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt对pH的稳定性；
图6为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt的最适反应温度图；
图7为以ABTS为底物时CIPmt5和CIPwt对温度的稳定性。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
突变灰盖鬼伞过氧化物酶的分子定向进化，包括：
1)CIPmt4基因的合成
使用DNAworks3.1软件设计、优化基因拼装的引物，在genebank中查找CIP的DNA序列(Genebank登录号：X69457)，翻译成氨基酸序列(如SEQIDNO:1所示)，替换序列中第49、53、166和242位氨基酸，参数选择为：引物长度40bp，毕赤酵母密码子偏好性，重叠区解链温度60℃，敲除掉内部的SacI位点，两端加上SacII和EcoRI限制性酶切位点；输入软件后得到一系列长40bp左右的寡核苷酸引物，选择重叠区不低于12bp，解链温度相差不超过2℃，重复、错配最少的50条引物作为基因合成的引物(CIP1～CIP50如SEQIDNO:4～53所示)；先将合成好的引物每条配成100μmol/L，等量混合后用无菌双蒸水稀释至终浓度每条2μmol/L，配成混合引物；
基因合成参照改良的OE-PCR技术，反应分两步，一步基因拼接(geneassembly)获得完整的模板，一步简单的基因扩增(geneamplification)得到完整的基因；基因拼接30μL的PCR反应体系含有混合引物2μL，1×PCRbuffer，200μmol/LdNTP，0.3UPrimeSTARHSDNA聚合酶(反应程序：95℃变性5min；98℃变性10s，60℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min)；基因扩增PCR30μL反应体系含有第一轮PCR产物1.5μL，20μmol/L引物CIP1、CIP50各0.5μL，1×PCRbuffer，200μmol/LdNTP，0.3UPrimeSTARHSDNA聚合酶，反应参数同基因拼接，PCR产物电泳图见图1(图中1为DL2000Marker，2为第一轮PCR产物，3为第二轮PCR产物)；
引物CIP1：5’-GCGAATTCCAAGGTCCTGGCGGAGGTGGTAGT-3’，
引物CIP50：5’-TCCCCGCGGTGGGGCTGGAGCTAAAGAAGGCAGTGGGCC-3’；
PCR产物纯化后连接到用SmaI酶切处理的pUC19上，电击转化大肠杆菌DH10B，在含有Amp、IPTG、X-gal的LB固体平板上筛选白色菌落，提质粒送上海invitrogen公司测序，确认得到含4个氨基酸突变(I49S、V53A、M166F和M242I)的灰盖鬼伞过氧化物酶CIPmt4，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所示(碱基序列如SEQIDNO:56所示)，质粒命名为CIP4/pUC19。
2)易错PCR
以CIP4/pUC19质粒为模板，以CIP1、CIP50为引物，采用北京天泽恩基因科技有限公司的易错PCR试剂盒进行易错PCR扩增(反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min)；三轮易错PCR，每次选择表达的蛋白活性高且最适pH往中性方向偏移的作为模板进行下一轮易错PCR。
3)突变酶文库构建
采用天根公司的普通DNA回收试剂盒纯化每轮易错PCR产物，用SacII和EcoRI双酶切，酶切产物回收后连接在用同样的酶处理过的酵母表达载体pPICZαA上，命名pPICZαA-cipmt(质粒构建示意图见图2)；提取pPICZαA-cipmt质粒，用SacI线性化处理并回收，根据毕赤酵母使用操作册制作感受态细胞；向100μL感受态细胞中加入8μg线性化DNA混匀(5～10μg均可)，转入电击杯，冰上孵育5min，设置电压1800V，采用eppendorf公司的电击转化仪器转化毕赤酵母GS115；加入1mol/L的山梨醇，于30℃下静止孵育1h，涂布在含有100mg/LZeocin的YPDS平板上，30℃倒置培养2d(2～3d均可)；挑取转化子，采用载体pPICzαA上的一对引物AOX5/AOX3(如SEQIDNO:54、55所示)和CIP基因上最外侧的一对引物CIP1/CIP50，巢式PCR检测CIP基因在毕赤酵母染色体上的整合。
4)高抗转化子筛选
挑选PCR检测为阳性的转化子，点在含1000mg/Lzeocin的YPD平板上，于30℃下倒置培养3d，筛选得到高抗转化子CIPmt5/GS115。
5)文库筛选
取高抗转化子CIPmt5/GS115做小量诱导表达，表达后取上清在96孔板中进行酶活性、中碱性pH活性、高温下酶活性检测，得到一个目的突变酶，高保真酶扩增后送invitrogen公司测序，得到含5个氨基酸突变(I49S、V53A、T121A、M166F和Y272F)的灰盖鬼伞过氧化物酶CIPmt5，其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示(碱基序列如SEQIDNO:57所示)，该突变体丢失了CIPmt4的242位突变，同时引入了121位和272位两个突变。
实施例2
突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备及纯化，包括：
1)大量表达突变型酶
接种CIPmt5/GS115到含有5mLBMGY培养基的20mL小瓶中过夜培养，转入含有100mLBMGY培养基的500mL三角瓶中，4层纱布封口，30℃摇床培养过夜(至OD6002～6即可)，离心收集菌体后重悬于BMMY培养基中，调节OD600为10，于29℃下摇床培养，每隔24h加甲醇至终浓度0.5％保持诱导；
2)蛋白的纯化
收集培养120h的培养物20mL，10000r/min转速下离心2次取上清，装入透析袋中，用PEG-4000浓缩至1.5mL；采用Qiagen公司的Ni-NTASpincolumn纯化蛋白，操作参照试剂盒说明书：每种蛋白取2支Ni-NTA离心吸附柱，先加入600μL的NPI-10buffer，柱子在开盖状态下不高于2900r/min离心2min使柱子平衡，每支吸附柱子加入750μL浓缩的粗酶液，开盖状态下不高于1600r/min离心5min，使带有组氨酸标签的CIP结合到纯化柱上，600μL的NPI-20buffer洗涤Ni-NTA离心柱，不高于2900r/min离心2min洗去非特异性结合的蛋白，洗涤重复两次，用600μL的NPI-500洗脱蛋白，即得。
试验例
野生型酶采用CIPwt/GS115制备，制备及纯化操作同实施例2。
1)电泳检测及分子量估算
纯化后的酶液各取5μL，用SDS-PAGE凝胶电泳检测酶的纯度并估算分子量(见图3，图中1为蛋白分子量标准，2为纯化后的CIPmt5，3为纯化后的CIPwt)。从图中可以看出，纯化后皆得到单一条带，大小在43KD左右，符合预期大小。
2)蛋白浓度的测定
以NPI-500Buffer为空白参照，用Thermoscientificmanodrop2000微量紫外分光光度计测定酶蛋白的浓度。测得CIPwt的浓度为14.916mg/mL，CIPmt5的浓度为9.827mg/mL。
3)酶活性的测定
酶活性测定采用ABTS法，向含有0.5mmol/LABTS的缓冲液(pH5.0)中加入适量的酶液，25℃保温数分钟，再加入0.1mmol/LH2O2起始反应。利用Bio-radEXL800酶标仪测量405nm光吸收增加，以一分钟内氧化1μmolABTS至蓝绿色阳性离子所需要的酶量定义为一个单位(U)(ε＝3.6×104L·mol-1·cm-1)。
4)酶学性质检测
1、pH对酶反应的影响
最适反应pH测定：采用Mcllvaine’scitrate–phosphatep(pH2～2.5)和BrittonRobinsonBuffer(pH3.0～9.0)作为缓冲液，200μL反应体系含49.7ng纯化的CIPwt或者CIPmt5酶，酶活性测定方法同上，统计分析后找出最适反应pH，以最适pH的酶活作为100％，计算其他pH下的相对酶活，结果见图4。从图中可以看出，CIPwt的最适反应pH为5.0，CIPmt5的最适反应pH为6.5，并且CIPmt5在pH3.5～6.5之间均具有较高的活性，活性是最适pH的75％以上。说明突变酶CIPmt5的最适pH向中性pH偏移1.5个单位，并且在更宽的pH范围内有高的活性。
pH稳定性测定：取纯化后的CIPwt或者CIPmt5，先置于不同pH的缓冲液(Mcllvaine’scitrate–phosphatep，pH2～2.5；BrittonRobinsonBuffer，pH3.0～9.0)内4℃保温2h，再调至最适pH，CIPwt选用25℃测定酶活，CIPmt5选用45℃测定酶活，以未处理的酶作对照，活性作为100％，计算各pH处理后的相对酶活，每个反应至少3个重复，结果见图5。从图中可以看出，CIPwt在pH5.0时最稳定，处理2h后酶活几乎不受影响；CIPmt5在pH6.5时最稳定，4℃处理2h后相对酶活为97.3％，pH8～9buffer处理2h后酶活仍超过50％，而CIPwt除在pH5.0～6.5范围保有60％以上的活性外，其他pHbuffer处理后残留活性均低于50％。
2、温度对酶反应的影响
最适反应温度测定：设置10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃共11个温度梯度，以pH5.0的NaAC作为缓冲液，其他条件同最适pH测定，统计分析后找出最适反应温度，以最适温度的酶活作为100％，计算其他温度下的相对酶活，结果见图6。从图中可以看出，CIPwt的最适反应温度为25℃，CIPmt5的最适反应温度为45℃，比CIPwt提高20℃。
温度稳定性测定：取纯化后的CIPwt或者CIPmt5，先置于不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃)下保温2h，冰上冷却，再按最适条件测定酶活，其中CIPwt采用pH5.0的NaAcbuffer，于25℃下测剩余酶活，CIPmt5采用pH6.5的NaAcbuffer，于45℃下测剩余酶活，以未处理的酶作对照，活性作为100％，计算各温度处理后的相对酶活，每个反应至少3个重复，结果见图7。从图中可以看出，CIPwt在温度35℃以下较稳定，处理2h后活性仍在70％以上，超过35℃后酶活急剧下降；CIPmt5在温度45℃处理2h后残留活性仍在80％以上，50℃处理2h活性仍超过60％，之后随着温度的升高稳定性逐渐下降。说明高温下CIPmt5的稳定性高于CIPwt，工业上更适于在高温下反应。
5)动力学参数的测定
以不同浓度的ABTS、2,6-DMP和愈创木酚为底物，反应温度设为25℃，采用Bio-radEXL800酶标仪在相应波长下测量吸光值的变化(ABTS对应波长405nm，2,6-DMP和愈创木酚对应波长450nm)，计算出不同底物时的酶活，每个反应至少三个重复，结果见下表1。动力学参数(Km和Kcat)采用Graphpadprime5软件中的米氏方程计算、拟合，最适底物用转化效率(Kcat/Km)确定。
表1CIPwt和CIPmt5的动力学参数
从表1可以看出，相较CIPwt，CIPmt5与ABTS、2,6-DMP和愈创木酚的亲和力都增强，表现为Km值下降，同时转化率升高。
6)染料脱色试验
1、染料的配制
选取偶氮类染料刚果红、氨基黑、甲基橙，杂环类染料次甲基蓝、苯胺蓝，三芳甲烷类染料结晶紫、溴酚蓝共7种染料分别配制成100mg/L的母液。
2、最适pH和脱色率测定
以Mcllvaine’scitrate-phosphatep(pH2.2～8)为缓冲液，分别用CIPwt和CIPmt5的粗酶液降解上述七种染料。200μL反应体系含染料终浓度5mg/L，双氧水10mmol/L，CIPwt组酶用量为0.045U/mL，CIPmt5组酶用量为0.042U/mL，室温下降解染料4h，采用Bio-radEXL800酶标仪测量降解前后染料的浓度，计算染料脱色率，计算公式如下：
脱色率(％)＝(脱色前吸光度-脱色后吸光度)/脱色前吸光度×100％。
每个试验3个重复，刚果红、氨基黑和甲基橙采用490nm波长，次甲基蓝和苯胺蓝采用405nm波长，结晶紫和溴酚蓝采用630nm波长，试验结果见下表2。
表2染料降解的最适pH和脱色率
从表2可以看出，除次甲基蓝外，相较CIPwt，CIPmt5对其他6种染料降解的最适pH均向中性、碱性方向偏移，并且，CIPmt5对7种染料的脱色率均显著高于CIPwt。

Claims (6)

1.突变灰盖鬼伞过氧化物酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。
2.编码如权利要求1所述突变灰盖鬼伞过氧化物酶的基因，其特征在于：其碱基序列如SEQIDNO:57所示。
3.重组表达载体，其特征在于：包含如权利要求2所述的基因。
4.包含如权利要求3所述重组表达载体的重组表达基因工程菌。
5.突变灰盖鬼伞过氧化物酶的制备方法，其特征在于：步骤如下：取权利要求4中所述重组表达基因工程菌培养，诱导表达突变灰盖鬼伞过氧化物酶。
6.如权利要求1所述突变灰盖鬼伞过氧化物酶在染料废水处理或降解染料中的应用。
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