CN108064281A - 用于制造纤维素的组合物和方法 - Google Patents

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CN108064281A CN201680022428.3A CN201680022428A CN108064281A CN 108064281 A CN108064281 A CN 108064281A CN 201680022428 A CN201680022428 A CN 201680022428A CN 108064281 A CN108064281 A CN 108064281A
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佐藤矩行
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Abstract

一种高效地制造纤维素的组合物，其含有：细胞提取物，所述细胞提取物来源于海鞘纲被囊动物或表达被囊动物纤维素合成酶的酵母；钙离子及镁离子中的至少一种二价阳离子；纤维二糖；和UDP‑葡萄糖。所述组合物的pH在6.6～7.2的范围内。

Description

用于制造纤维素的组合物和方法
技术领域
本发明涉及用于制造纤维素的组合物和方法，具体而言，涉及使用细胞提取物的用于制造纤维素的组合物和方法，所述细胞提取物来源于海鞘纲被囊动物或表达被囊动物纤维素合成酶的酵母。
背景技术
概论
纤维素是地球上最丰富的材料之一，也是最常见的有机聚合物。纤维素由β(1-4)连接D-葡萄糖的直链构成。纤维素的实用性得益于其具有独特的晶体结构。期待通过改造纤维素的晶体结构能够开发出多种基于纤维素的新型生物降解性材料。然而，晶体结构完整的纤维素的人工合成尚未成功。虽然植物和细菌可以生成纤维素，但它们也具有合成胼胝质或β(1-3)连接D-葡萄糖的酶，若将合成纤维素和胼胝质的酶分离开，则无法重建出制造晶体纤维素的分子机制。因此，需要能够高效地制造纤维素、即不制造胼胝质的新技术。
被囊动物是唯一已知在不生成胼胝质的情况下而能够生成晶体纤维素的动物(Nakashima,K.et al.,Dev.Genes Evol.,214:81-88(2004),Nakashima,K.et al.,Cell.Mol.Life Sci.,68:1623-1631(2011))。本申请的发明人成功地开发了使用来源于海鞘纲被囊动物或表达被囊动物纤维素合成酶的酵母的细胞提取物来制造纤维素的技术。
发明内容
本发明的一个方面提供用于制造纤维素的组合物，所述组合物含有：细胞提取物，其来源于海鞘纲或尾海鞘纲(Appendicularian class)的被囊动物；钙离子及镁离子中的至少一种二价阳离子；纤维二糖；和UDP-葡萄糖，其中，所述组合物的pH在6.6～7.2的范围内。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述二价阳离子的浓度可以在2～8mM的范围内。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述细胞提取物可来源于玻璃海鞘(Cionaintestinalis)。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述细胞提取物可来源于玻璃海鞘的尾芽期胚胎。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述组合物的pH可以是利用MOPS进行缓冲的。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述组合物的pH可以为6.8。
所述用于制造纤维素的组合物可以还含有稳定剂及/或蛋白酶抑制剂。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述被囊动物可表达编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因。
所述用于制造纤维素的组合物中，可使用来源于经转化的酵母(其可表达编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因)的细胞提取物来代替来源于海鞘纲或尾海鞘纲的被囊动物的细胞提取物。
本发明的一个方面提供用于制造纤维素的组合物，所述组合物含有：细胞提取物，其可来源于经转化的酵母，所述经转化的酵母可表达编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因；钙离子及镁离子中的至少一种二价阳离子；纤维二糖；和UDP-葡萄糖，其中，所述组合物的pH在6.6～7.2的范围内。
所述用于制造纤维素的组合物中，细胞提取物可来源于经转化的酵母，所述经转化的酵母可表达编码被囊动物纤维素合成酶的转基因。
所述用于制造纤维素的组合物中，细胞提取物可来源于经转化的酵母，所述经转化的酵母可包含参与纤维素制造的蛋白质。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述参与纤维素制造的蛋白质可以是由所述编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因衍生的重组蛋白。
所述用于制造纤维素的组合物中，所述重组蛋白可以为被囊动物纤维素合成酶。
所述用于制造纤维素的组合物中，细胞提取物可来源于可表达序列号2的蛋白质的经转化的酵母。
本发明的另一个方面提供经转化的酵母，其可表达编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因。
本发明的另一个方面提供转基因，其编码参与纤维素制造的蛋白质。
本发明的另一个方面提供制造纤维素的方法。所述方法包括下述步骤：制备所述用于制造纤维素的组合物；对所述组合物进行孵育；和从所述组合物中纯化出纤维素。
本发明的另一个方面提供通过本申请的制造纤维素的方法制得的纤维素。
本发明的另一个方面提供展现出图2-A中所示IR光谱的纤维素。
附图说明
[图1]图1示出了通过本发明的方法合成的纤维素的负染色TEM图像(图1-A)或从玻璃海鞘组织中纯化出的纤维素的负染色TEM图像(图1-B)。图1-A的内嵌图示出了直径为1μm的样品区域的电子衍射图样。
[图2]图2示出了通过本申请的方法制得的纤维素的IR光谱(图2-A)和艾维素(Avicel)的IR光谱(图2-B)。
具体实施方式
适宜地参照附图对本申请公开的各种实施方式进行详细说明。提及各种实施方式并不对本公开文本的范围(仅由所附权利要求书的范围界定)加以限制。此外，本说明书中记载的任何实例均非旨在限制，其仅用于示出要求保护的本发明的多种可能的实施方式中的一些。
本申请中提及了多篇公开文献。这些公开文献的全部内容被并入本申请中作为参考，以更充分地阐述本发明所属的技术领域的现状。对于公开的参考文献的重要语句中讨论的内容，将相关材料单独且具体地通过参考并入本文中。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中用来表示成分的重量百分比、尺寸、某些物理性能数值的全部数字均应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。同样，应理解说明书和权利要求书使用的具体数值也构成了本发明的其他实施方式。本申请的发明人已经努力确保实施例中揭示的数值的准确性。但是，任何测量的数值均可能固有地包括由对应的测量技术存在的标准偏差导致的一定误差。
除非另有明确的相反说明，则本文中使用的“一个”、“一种”表示“至少一个(种)”，而不应限制为“仅有一个(种)”。因此，例如，除非另有明确说明，则就“二价阳离子”而言，包括具有1种、2种或多种的二价阳离子的实施方式。
本文中使用的用语“制造纤维素”表示制造β(1-4)连接D-葡萄糖的直链，其可以是非晶性的，或者也可以形成选自纤维素I(或其结晶相、即三斜晶系变体Iα和单斜晶系变体Iβ)、纤维素II、纤维素III和纤维素IV(Nishiyama,Y.,J.Wood Sci.,55:241-249(2009),Moon,R.J.et al.,Chem.Soc.Rev.,40:3941-3994(2011))中的至少一种晶体结构。
用语“细胞提取物”表示通过破坏细胞和细胞的核膜而制得的匀浆、或利用例如但不限于超速离心法的手段从匀浆的可溶性成分中分离得到的微粒体组分(microsomalfraction)。本发明的细胞提取物可通过本申请公开的方法进行制备。但是，也可采用其他的手段，例如，采用弗氏压碎(French press)代替Parr细胞破碎弹(Parr cell disruptionbomb)。制备细胞提取物的过程中，可向包含具有纤维素合成活性的匀浆或微粒体组分的溶液中添加稳定剂，例如0.5～10mM的EDTA及/或EGTA、或者1～10％甘油，但不限于这些。在细胞提取物的制备和制造纤维素的反应中，可向细胞提取物及/或反应混合物中添加稳定剂(例如1～10％甘油)及/或蛋白酶抑制剂(例如，PMSF、亮肽素和N-α-对甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮，但不限于这些)。在细胞提取物的制备和制造纤维素的反应中，也可添加温和去垢剂，例如Brij(注册商标)35、52、58、93、C10、O20、S100、和Triton(注册商标)X-100等，但不限于这些。此外，在细胞提取物的制备和制造纤维素的反应中，可利用缓冲剂(例如Tris、HEPES、MOPS等，但不限于这些)、尤其是MOPS对水溶液进行缓冲，使pH为6.6～7.2的范围，尤其为6.8。除非另有说明，本发明中使用的水溶液基于本领域技术人员熟知的纯水或超纯水。
本文中使用的用语“被囊动物”是指在天然基因组中具有编码纤维素合成酶的基因的被囊动物的任何品种，尤其是指海鞘纲或尾海鞘纲的品种：对于海鞘而言，例如但不限于玻璃海鞘、萨氏海鞘(Ciona savignyi)、和海鞘属的其他品种；皮海鞘(Molgulatectiformis)、和皮海鞘属的其他品种；真海鞘和真海鞘属的其他品种；对于尾海鞘而言，例如但不限于异体住囊虫(Oikopleura dioica)、长尾住囊虫(Oikopleura longicauda)、和住囊虫属的其他品种，尤其是指在遗传学研究实验室中使用的动物，例如玻璃海鞘和异体住囊虫。
已知上述特定品种具有1种或2种与玻璃海鞘CiCesA蛋白(NCBI参考序列：NP_001041448.1，本申请所附序列表中记为序列号1)的氨基酸序列同一性为65％以上的纤维素合成酶蛋白，本发明的用于制造纤维素的组合物和方法采用来源于上述海鞘纲或尾海鞘纲的任一种被囊动物的细胞提取物。根据Nakashima,K.et al.(2004)，纤维素合成酶CiCesA在表皮细胞中表达。根据Nakamura,M.J.et al.(Dev.Biol.372:274-284(2012))，由于表皮细胞占据玻璃海鞘的尾芽中期胚胎的全部细胞中的约一半，因此，尾芽期胚胎有可能是用于制备本发明的组合物和方法所采用的细胞提取物的良好生物材料。但本发明的组合物和方法也可采用由任意阶段的整个胚胎制得的提取物、或者由来源于海鞘或尾海鞘的任意的特定表皮细胞制得的提取物。
已知上述特定品种具有1种或2种与异体住囊虫Od-CesA1蛋白(NCBI参考序列：[AB543594]，本申请所附序列表中记为序列号2)的氨基酸序列同一性为65％以上的纤维素合成酶蛋白。
用语“编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因”表示外源基因或基因构建体，其通过转基因技术(例如但不限于将DNA显微注射至被囊动物的生殖细胞系或体细胞或酵母中)而被设计为在被囊动物或酵母中表达所述外源基因从而永久性或暂时性地表达所述蛋白质。所述外源基因可编码来源于同种或不同种(例如不同种的被囊动物)的蛋白质、或者来源于植物界或细菌界的蛋白质。
受体被囊动物可以是表达所有参与纤维素制造的蛋白质的野生型被囊动物，或者由于例如Sasakura,Y.等(Proc.Natl.Acad.Sci.,42:15134-15139(2005))报道的转位子介导插入诱变和寡核苷酸诱导的蛋白质表达抑制等诱导突变而完全不制造纤维素的被囊动物、或较之野生型动物而言纤维素制造量大幅度减少的被囊动物。
酵母被用作宿主，只要属于子囊菌酵母即可，没有特别限制。其中，优选属于酵母科(Saccharomycetaceae)的酵母，更优选酵母属(Saccharomyces)。
用语“表达载体”表示质粒载体，或者也可以是人工染色体。表达载体含有“编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因”。使用酵母作为宿主时，质粒形式是优选的。
用语“经转化的酵母”可通过将多聚核苷酸或表达载体导入作为宿主的酵母进行制备。“导入”不仅包括导入多聚核苷酸或表达载体，也包括被导入宿主细胞的基因表达。转化方法没有特别限制，可以采用已知的方法。转化方法包括例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、DEAE-葡聚糖法、乙酸锂法、转染法和显微注射法。经转化的酵母可通过例如使用酵母筛选标记的方法等惯用方法进行筛选。
用语“参与纤维素制造的蛋白质”表示来源于被囊动物、植物或细菌的任何参与纤维素制造的蛋白质，例如纤维素合成酶、和参与到制造具有天然纤维素的至少一种结晶相(即，三斜晶系变体Iα、单斜晶系变体Iβ)的纤维素的分子机制中的蛋白质。
被囊动物纤维素的化学提纯可基于本领域技术人员已知的任意实验方案来实施，例如Nakashima,K.et al(Marine Genomics,1:9-14.(2008))。即，可从被囊动物样品中除去整个被囊。试样可在高pH条件下进行处理，例如，可使用氢氧化钾。用酸中和后，可用化学药品、例如缓冲至低pH的NaClO2对试样进行漂白。可重复这些步骤直到试样成为白色为止。用蒸馏水洗涤后，可用乙酸/硝酸水溶液处理试样(Updegraff,Anal.Biochem.32:420-424(1969))，用蒸馏水洗涤，然后冷冻干燥，得到经化学提纯的纤维素。可以对整个胚胎(受精后(hpf)12小时)或幼体(18hpf)样品以相同的方式进行处理。
14C标记纤维素的定量或其放射性测量可基于本领域技术人员已知的任意实验方案来实施，例如Lai-Kee-Him,J.et al.(J.Biol.Chem.,277:36931-36939.(2002))。即，可以利用玻璃纤维过滤器，通过过滤而回收使用14C标记UDP-葡萄糖作为底物在体外合成的纤维素。玻璃纤维过滤器可被洗涤和干燥。放射性可使用闪烁计数器在液体闪烁混合物中进行测量。
针对纤维素样品、例如基于本发明合成的纤维素或从被囊动物组织提纯得到的纤维素进行的TEM和电子衍射分析可基于本领域技术人员已知的任意实验方案来实施，例如，Lai-Kee-Him,J.et al.(2002)。即，TEM观察可使用电子显微镜进行。样品可利用乙酸双氧铀进行负染色，或在未染色的状态下进行观察。低剂量电子衍射图样可在液氮温度下的未染色样品上、利用直径为1μm的圆形选定区域进行记录。图样可使用金标准样品(goldstandard)进行校正。骤冷装置可用于制备cryo-TEM样品。在体外合成之前和之后，可将数滴去垢剂提取物(detergent extracts)置于由栅格支承的花边碳(lacy carbon)膜上。在用滤纸吸除多余的液体后，可立刻将栅格投入经液氮冷却的液态乙烷中。可用滤纸吸除多余的乙烷，将栅格设置于冷冻电镜托架(cryoholder)，并转移至显微镜下，使用1～3μm的欠焦条件以x 11,500的高放大倍率进行观察。
针对通过本发明合成的纤维素的X射线衍射分析可基于本领域技术人员已知的任意实验方案来实施，例如，Nakashima,K.et al(2008)。即，可手动将纤维素压平。X射线衍射可使用X射线衍射仪、利用Cu-Kα辐射(λ＝0.15418nm)实施。可使用光学狭缝装置。扫描可以以本领域技术人员熟知的散射角、扫描步骤和扫描速度进行。可利用软件将峰分离。衍射角可利用例如氟化钠等标准化合物进行校正。用于鉴别同质异晶的Z值可根据Wada,M.et al.(J.Wood Sci.47:124-128(2001))而由晶面间距(d-spacing)算出。取向参数R2和R3可根据Koyama,M.et al.(Cellulose 4:147-160(1997))而由峰的积分强度算出。
衰减全反射FTIR可在FTIR装置上实施。可将纤维素按压于金刚石反射附件上，可在反射模式下采集干涉图，也可通过相干叠加而提高信噪比。
本文中使用的用语“与序列具有至少为65％的序列同一性”表示：本发明的引物与同特定序列标识符关联的特定多肽序列具有65％以上、例如65、70、75、80、85、90、95、97、99％以上、或100％的序列同一性。序列同一性通过将两条待比较的序列如下所述地进行比对来确定：确定比对部分中一致的氨基酸残基的数量，并将该数量除以本发明(被查询)的序列中的氨基酸残基总数量，并将结果乘以100。可采用公众可获取的计算机算法比对多肽序列，并与其他多肽比较而确定特定区域的一致残基百分比。BLASTP和FASTA算法是两种用于比对和鉴定多聚核苷酸序列相似性的示例算法。计算机算法BLASTP和FASTA可从互联网、例如美国国家生物技术中心(NCBI)获得。BLASTP算法的应用记载于Altschul等发表的文献(Nucleic Acids Res.25:3389-3402,1997)。FASTA算法的应用记载于Pearson和Lipman(Proc.Natl.Acad.Sci.US85:2444-2448,1988)；和Pearson(Methods in Enzymol.183:63-98,1990)。
[实施例1]
通过以下实施例，非限定性地对本发明进一步进行说明。
被囊动物胚胎的采集
将成体玻璃海鞘切开，从性腺管获得卵和精子。人工授精后，在二细胞期用人工海水洗涤被囊动物胚胎，由此除去过量的精子，进而于18℃在人工海水中孵育。在尾芽末期通过快速离心(spin down)收集胚胎。
被囊动物纤维素的化学提纯
从玻璃海鞘的成体样品手术移除整个被囊。在于60℃过夜干燥之前和之后对试样称重，然后用5％(w/v)氢氧化钾于37℃过夜处理。于室温用1％(v/v)乙酸中和6h后，将试样于80℃用0.35％NaClO2(50mM乙酸钠缓冲液缓冲至pH 4.9)漂白2h。重复这些步骤直到试样成为白色为止。用蒸馏水洗涤3次后，将试样用73％(v/v)乙酸/9％(v/v)硝酸水溶液于95℃处理30分钟(Updegraff，1969)，用蒸馏水洗涤后，冷冻干燥，得到经化学提纯的纤维素。对整个胚胎(受精后(hpf)12小时)或幼体(18hpf)样品以相同的方式进行处理，各组为1、10和100个。
被囊动物细胞提取物的制备
将采集的胚胎用洗涤缓冲液I(100mM MOPS(ph7.0)、2mM EDTA和2mM EGTA)洗涤2次。使用Parr细胞破碎弹，对胚胎进行2次均质化。通过离心(5,000x g、10分钟、4℃)来分离匀浆的上清液，继而用Miracloth滤布(Millipore,Millipore,Merck Ltd.)过滤至超速离心管中。超速离心(100,000x g、60分钟、4℃)后，收集沉淀，并悬浮于1mL洗涤缓冲液II(100mM MOPS(pH 7.0)、2mM EDTA、2mM EGTA和10％(w/v)甘油)中。利用BCA蛋白质分析试剂盒(Pierce,Life Technologies Corporation)测定被囊动物胚胎提取物的蛋白质浓度。将被囊动物胚胎提取物用洗涤缓冲液II稀释至6～8mg/mL，用于后续反应。
反应混合物的制备
用于纤维素合成的反应混合物通过将500微升底物缓冲液(见后述)依次与下述溶液混合而进行制备：首先与50微升的20mM UDP-葡萄糖(可含有用于放射性标记实验的14C标记UDP-葡萄糖)混合，然后与200微升纯水混合，最终与250微升上述被囊动物细胞提取物混合。为了合成纤维素，将反应混合物于室温孵育24小时。
反应条件的优化(1)：pH
使用pH调节为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4和7.6的MOPS制备用于优化pH的洗涤缓冲液II和底物缓冲液(50mM MOPS、40mM纤维二糖、4mM CaCl2、和4mM MgCl2)。
反应条件的优化(2)：二价阳离子浓度
使用50mM MOPS(pH 7.0)、40mM纤维二糖、和2mM、4mM或8mM的CaCl2、MgCl2及/或MnCl2的组合制备用于优化二价阳离子浓度的底物缓冲液。
对反应产物的纯化
反应完成后，通过将反应混合物离心(10,000x g、15分钟、20℃)从而除去上清液，将含有合成的纤维素的沉淀物与1.5mL的2％SDS混合，然后于100℃孵育1小时。通过将SDS混合物离心(10,000x g、15分钟、20℃)从而除去上清液，将沉淀物与1.5mL的2％NaOH混合，然后于100℃孵育75分钟。通过将NaOH混合物离心(10,000x g、15分钟、20℃)从而除去上清液。通过翻转离心管数次而将沉淀物与1.5mL纯水混合。将用水洗涤合成的纤维素的步骤进一步重复5次，所述步骤包括通过离心(10,000x g、15分钟、20℃)而除去上清液、和将含有合成的纤维素的沉淀物与新鲜的纯水混合的操作。重复用水洗涤的步骤后，将合成的纤维素供于以下所述的分析。
14C标记纤维素的定量
利用玻璃纤维过滤器进行过滤，回收使用含有14C标记UDP-葡萄糖的反应混合物合成的纤维素。对玻璃纤维过滤器进行洗涤和干燥。使用闪烁计数器在液体闪烁混合物中测量放射性。
TEM和电子衍射分析
对于TEM观察和电子衍射分析而言，可使用电子显微镜进行成像，并于200kV进行电子衍射。对于纤维素样品、例如基于本发明合成的纤维素、或从玻璃海鞘组织中提纯得到的纤维素，利用乙酸双氧铀进行负染色，或者在未染色的状态下进行观察。在液氮温度下的未染色样品上、利用直径为1μm的圆形选定区域记录低剂量电子衍射图样。
傅立叶变换红外光谱分析
衰减全反射FTIR在Spectrum One FTIR装置上(Perkin Elmer)实施。将基于本发明合成的纤维素或从玻璃海鞘组织中提纯得到的纤维素按压于金刚石反射附件上(测力计数为50)，在反射模式下以2cm-1的分辨率采集干涉图(4000-400cm-1)，并且通过相干叠加提高信噪比。
结果
以下表1总结了反应混合物pH优化实验的结果。
[表1]
表1示出了于指定pH合成的纤维素的结合态放射性测量值、和通过将各pH下的测量值除以放射性最强时的pH(pH 6.8)对应的测量值而得到的百分比数值。表1表明，在pH6.6至pH 7.2的范围内观察到高合成活性，pH 6.8时的合成活性最高。
以下表2示出了反应混合物中二价阳离子浓度优化实验的结果。
[表2]
表2示出了各二价阳离子浓度下合成的纤维素的结合态放射性测量值、和通过将各浓度下的测量值除以放射性最强时的浓度(4mM Ca2+、4mM Mg2+、和0mM Mn2+)对应的测量值而得到的百分比数值。表2证明，在2～8mM的Ca2+或Mg2+的条件下观察到高合成活性，并在4mM Ca2+、4mM Mg2+、和0mM Mn2+的浓度条件下观察到最高合成活性。不存在Ca2+和Mg2+的情况下，Mn2+促进了纤维素合成。Mn2+的效果在2mM时是显著的，但在4mM或更高的浓度时效果较不明显。Ca2+及/或Mg2+存在的情况下，Mn2+对于纤维素合成具有抑制效果。
由这些结果可得出下述结论：在从玻璃海鞘胚胎提取得到的无细胞体系中，纤维素合成的有利条件为pH 6.8、4mM Ca2+、4mM Mg2+、且不存在Mn2+。
图1示出了合成的纤维素的负染色TEM图像(图1-A)或从玻璃海鞘组织中提纯得到的纤维素的负染色TEM图像(图1-B)。图1-A的内嵌图示出了合成纤维素的直径为1μm的区域的电子衍射图样。晶面(110)、(020)、和(220)的晶面间距值分别为0.448nm(n＝11)、0.408nm(n＝11)和0.222nm(n＝3)。这些结果表明，上述实施例中合成的纤维素为纤维素II结构(反平行链)，而不是天然纤维素的结构、即纤维素I(全平行链)。
[实施例2]
1.表达载体的构建
利用RT-PCR，使用引物对OdF和OdR，由cDNA模板扩增异体住囊虫源纤维素合成酶Od-CesA1(本申请所附序列表中的序列号2)的全长编码区。使用无缝克隆(In-Fusioncloning)将全长α因子置换为分泌表达，由此将扩增得到的片段克隆至pGAPZα表达载体(Life Technologies)中。将得到的质粒命名为Od1pGZ。
2.使用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)作为宿主的重组蛋白表达
将Od1pGZ用限制性内切酶AvrII处理后，用于使用乙酸锂法进行的巴斯德毕赤酵母转化。将经转化的巴斯德毕赤酵母在5mL含有博来霉素(Zeocin)(100μg/ml)的YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)中于30℃、200rpm的条件下培养24小时(预培养)，进而接种至300mL的YPD培养基中，于30℃、200rpm的条件下培养24小时(大量培养)。
3.使用重组蛋白的纤维素试管(test-tube)合成
通过离心(4℃、1,000×g、3分钟)回收酵母细胞，悬浮在用于破坏细胞的培养基(50mM磷酸钠、pH7.4、5％甘油、1mM EDTA)中，然后使用LV1Microfluidizer(Microfluidics)，以30,000psi对悬浮液处理3次从而进行破坏。将匀浆离心(4℃、1,000×g、3分钟)后，将回收的上清液供于超速离心(4℃、100,000×g、60分钟)，得到作为沉淀物的微粒体组分。将微粒体组分悬浮于溶液(75mM Mops(pH 7.0)、2.5％甘油、20mM纤维二糖、1mM UDP-葡萄糖、8mM MgCl2、0.5mM EDTA、0.5mM EGTA)中，于24℃反应12小时。
4.合成产物的回收和分析
向反应混合物中添加SDS，使最终浓度为2％，然后于50℃脱脂24小时。将反应混合物离心(28℃、20,000×g、20分钟)，然后以沉淀物的形式回收不溶性组分。对沉淀物进行蛋白酶处理(浓度为20μg/1mL的蛋白酶K、磷酸盐缓冲盐水、1％SDS、50℃、48小时)，然后再次离心，回收沉淀物(28℃、16,000×g、20分钟)。对沉淀物进行碱处理(2％氢氧化钾、24℃、24小时)，进而通过离心回收沉淀物(30℃、16,000×g、20分钟)。将得到的沉淀物悬浮于乙酸(72％)和硝酸(12％)的混合溶液中，于100℃处理30分钟，接着用等量的水稀释，然后通过离心(15℃、16,000×g、20分钟)回收沉淀物。用水洗涤回收的沉淀物数次，然后悬浮于水中，由此得到合成产物。
5.合成纤维素的数据分析
将合成产物(5μg)置于氟化钡窗口，干燥后，使用Spotlight 200(PerkinElmer)测定显微FT-IR光谱。图2示出了由合成产物和纤维素试样得到的光谱(测定面积：100μm×100μm)。
对于本领域技术人员而言，显而易见的是，在不偏离本发明的范围和主旨的情况下，可对本发明进行各种变型和改变。因此，应理解，对于本发明的变型和改变也包括在所附权利要求及其等同范围内。

Claims (13)

1.用于制造纤维素的组合物，所述组合物含有：
细胞提取物，所述细胞提取物来源于海鞘纲或尾海鞘纲的被囊动物；
钙离子及镁离子中的至少一种二价阳离子；
纤维二糖；和
UDP-葡萄糖，
其中，所述组合物的pH在6.6～7.2的范围内。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述细胞提取物来源于玻璃海鞘。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述细胞提取物来源于玻璃海鞘的尾芽期胚胎。
4.用于制造纤维素的组合物，所述组合物含有：
细胞提取物，所述细胞提取物可来源于经转化的酵母，所述经转化的酵母可表达编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因；
钙离子及镁离子中的至少一种二价阳离子；
纤维二糖；和
UDP-葡萄糖，
其中，所述组合物的pH在6.6～7.2的范围内。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述细胞提取物可来源于经转化的酵母，所述经转化的酵母可表达序列号2的蛋白质。
6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中，所述二价阳离子的浓度在2～8mM的范围内。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的pH是利用MOPS进行缓冲的。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中，所述组合物的pH为6.8。
9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还含有稳定剂及/或蛋白酶抑制剂。
10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中，所述被囊动物表达编码参与纤维素制造的蛋白质的转基因。
11.制造纤维素的方法，所述包括：
制备权利要求1至10中任一项所述的组合物；
对所述组合物进行孵育；和
从所述组合物中纯化出纤维素。
12.通过权利要求11所述的方法制得的纤维素。
13.纤维素，其展现出下述IR光谱：
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